Abstract
Tidligere studier har vist at type 2 diabetes mellitus (diabetes mellitus type 2) er knyttet til økt risiko for å utvikle tykktarmskreft. Insulin og insulin-like growth factor 1 (IGF-1) er forhøyet hos pasienter med diabetes mellitus type 2. Den økte insulin og IGF-1 kan være ansvarlig for utvikling av tykktarmskreft. I denne studien undersøkte vi effekten og mekanismer av insulin og IGF-1 i tykktarm kreft utvikling
in vitro Hotell og
in vivo
. Insulin og IGF-1 alene eller sammen forhøyet spredning og redusert apoptose i tykktarmskreft MC38 celler. I mellomtiden, insulin og IGF-1 fremmet fosforyleringen av ekstracellulære-signal regulert kinase 1/2 (ERK1 /2) og c-Jun N-terminal kinase (JNK). Behandling med ERK1 /2 eller JNK-inhibitor, i nærvær av insulin og IGF-1 signifikant redusert B-cellelymfom 2 (Bcl-2) og øket Bcl-2-assosiert X-protein (Bax) ekspresjon og endelig økt apoptose og inhiberte proliferasjonen . Accelerative kolon tumorvekst ble funnet i en musemodell for diabetes mellitus type 2 med
db /db
mus som fikk høyt nivå av endogen insulin og IGF-1. Videre er inhiberingen av ERK1 /2 eller JNK undertrykket utvikling av colon tumor
in vivo
. Disse resultater antyder at aktiveringen av ERK1 /2 og JNK-signal av insulin og IGF-1, i det minste delvis er ansvarlig for utvikling av tykktarmskreft med diabetes mellitus type 2
relasjon:. Teng JA, Wu SG, Chen JX, Li Q, Peng F, Zhu Z, et al. (2016) Den Aktivering av ERK1 /2 og JNK MAPK signale av insulin /IGF-1 er ansvarlig for utvikling av tykktarmskreft med Type 2 Diabetes Mellitus. PLoS ONE 11 (2): e0149822. doi: 10,1371 /journal.pone.0149822
Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 27 april 2015; Godkjent: 04.02.2016; Publisert: 22 februar 2016
Copyright: © 2016 Teng et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien støttes av Natural Science Foundation National of China (No. 81160107, JAT), Guangxi Science Research og teknikk Development Plan Foundation (No. 1104003B-69, JQ), og Guangxi Natural Science Foundation (No. 2010GXNSFB013083, JAT). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i de siste tiårene, på grunn av den raske økonomiske vekst og endringer i livsstil i Kina, forekomst og tilfeller av diabetes har økt raskt. I Kina, utbredelsen av diabetes var 9,7%, sto for 92,4 millioner mennesker som lever med diabetes, hovedsakelig type 2 diabetes mellitus (diabetes mellitus type 2) [1]. Diabetes mellitus type 2 er assosiert med økt forekomst av kreftdødelighet [2, 3]. Spesielt er risikoen for brystkreft [4], bukspyttkjertel [5], lever [6] og tykktarm [7, 8] kreft er forhøyet hos pasienter med diabetes mellitus type 2. Diabetes mellitus type 2 øker levetiden risikoen for tykktarmskreft med opptil tre ganger enn den generelle befolkningen, noe som gjør tykktarmskreft en av de vanligste kreftformene hos pasienter med diabetes mellitus type 2 [9].
De mekanismene bak tilkobling av diabetes mellitus type 2 med tykktarmskreft er kompliserte og ennå ikke fullstendig klarlagt. Diabetes mellitus type 2 er forbundet med hyperinsulinemi og forhøyede insulinlignende vekstfaktor 1 (IGF-1). Insulin, en viktig vekstfaktor som virker som en celle mitogen, da ved høye konsentrasjoner øke risikoen for tykktarmskreft ved å fremme veksten av tumorer [10]. Og insulinbehandling kan ytterligere øke risikoen for tykktarmskreft hos pasienter med diabetes mellitus type 2 [11]. Insulin stimulerer celleproliferasjon gjennom direkte binding til insulinreseptorer eller IGF-1-reseptorer, eller ved inhibering av IGF-bindende proteiner, som øker IGF-1 tilgjengeligheten til IGF-reseptoren [12]. Insulin eller IGF-1-signalisering viste seg å være som en potent vekstregulator forbundet med karsinogenese i forskjellige cellelinjer [13]. Tidligere studier har vist en sammenheng mellom forhøyet IGF-1 og risikoen for tykktarmskreft [14, 15]. Korrelasjonen mellom insulin eller IGF-1 og risikoen for tykktarmskreft hos pasienter med diabetes mellitus type 2 er allment akseptert [16, 17]. Mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK) signal består av 3 hovedveier: ekstracellulære regulert proteinkinaser 1/2 (ERK1 /2), c-Jun N-terminal kinase (JNK) og P38 signaler. Tidligere studier har vist at MAPK signal, som fungerer som nedstrøms av insulin og IGF-1 proliferativ signalering, spiller en rolle i spredning av forskjellige kreftformer, inkludert bryst, tykktarm og prostatakreft [18-20]. Imidlertid, på grunn av mangel av ideelle tykktarmskreft modell med diabetes mellitus type 2, er det fremdeles ikke klart hvordan dette signal regulere proliferasjon av tykktarmskreft i en diabetes mellitus type 2 miljø.
Denne studien var rettet for å bestemme mekanismen for insulin /IGF-1 i tykktarm kreft vekst innen diabetes mellitus type 2 miljø. For dette formål, ble en mus avledet koloncancercellelinje-MC38 celler med insulin /IGF-1-behandling og en mus spontan diabetes mellitus type 2 modell med tumor allotransplantater anvendt for å etterligne diabetes mellitus type 2 miljøet
in vitro
og
i vivo
. Insulin /IGF-1 forhøyet proliferasjon og redusert apoptose i celler MC38. I mellomtiden ble virkningene av insulin /IGF-1 i MC38-celler ble ERK1 /2 og JNK avhengige. Accelerative colon tumorvekst ble funnet i en musemodell av diabetes mellitus type 2, som har høyt nivå av insulin og IGF-1. Derfor foreslår vi at aktiveringen av ERK1 /2 og JNK signalering av insulin og IGF-1, i det minste delvis er ansvarlig for regulering av utvikling og dannelse av tykktarmskreft med diabetes mellitus type 2.
Materialer og Metoder
celle~~POS=TRUNC kultur~~POS=HEADCOMP
Tykktarmskreft kreft~~POS=HEADCOMP MC38-cellelinjen ble opprinnelig avledet fra C57BL /6 mus behandlet med carcinogen 1,2-dimetylhydrazin [21], ble det anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og dyrket i DMEM-medium supplert med 10% føtalt bovint serum, 1% glutamin og 1% penicillin /streptomycin. Cellene ble holdt ved 37 ° C og 5% CO
2 i et fuktig miljø. Medium ble erstattet hver 48. time og cellene ble trypsinert når nådde 80% samløpet. Cellene ble serum-sultet over natten og deretter behandlet med 5 ng /ml eller 50 ng /ml konsentrasjoner av insulin (Sigma, St. Louis, MO) og IGF-1 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) ble oppløst i fosfatbufret saltvann (PBS). I ERK1 /2 eller JNK inhibering assays, ble 40 uM ERK1 /2 inhibitor PD98059 (Sigma, St. Louis, MO) eller 20 pM JNK inhibitor SP600125 (Sigma, St. Louis, MO) oppløst i dimetylsulfoksyd (DMSO) tilsatt til dyrkede celler.
Celleproliferering analysen
Celleproliferering ble bestemt ved hjelp av en celle telling kit-8 (CCK-8) (Dojindo, Kumamoto, Japan) i henhold til produsentens protokoll. Kort sagt ble MC38-celler sådd ut på 96-brønners plater med 8000 celler per brønn. Etter inkubering over natten, ble cellene behandlet med 50 ng /ml insulin og 50 ng /ml IGF-1 med eller uten 40 mM ERK1 /2 inhibitor PD98059 eller 20 uM JNK inhibitor SP600125 for 24, 48 eller 72 timer. Deretter ble 10 ul 2- (2-metoksy-4-nitrofenyl) -3- (4-nitrofenyl) -5- (2,4-disulfofenyl) -2H-tetrazolium mononatriumsalt (WST-8) ble tilsatt til hver brønn og inkubert ved 37 ° C i ytterligere 2 timer. Da den optiske absorbans ved bølgelengde 450 nm ble målt ved hjelp av en mikroplateleser (Thermo Scientific, Waltham, MA).
Cell syklus analyse
For
in vitro
cellesyklus analyse, MC38 celler med ulike behandlinger for 72 timer, ble høstet og fiksert med 70% iskald etanol i 4 timer. Da de fikserte cellene ble inkubert med 400 pl 0,5 mg /ml propidiumjodid (PI) i 30 minutter ved 4 ° C. De fargede celler ble analysert med en FACS Calibur (BD, Franklin Lakes, NJ). Kvantifisering av fluorescens ble gjort ved strømningscytometri for å bestemme den cellesyklus kinetikken av MC38 celler i G0 /G1-fase, S-fasen og G2 /M-fase.
celle apoptose analyse
Apoptose hastigheten ble evaluert på 7
th dag med kultur av Annexin V-FITC apoptose Detection Kit i (BD, San Diego, CA) i henhold til produsentens protokoll. I korthet, en x 10
6 trypsinert Cellene ble vasket med PBS og resuspendert i Annexin V bindingsbuffer. Cellene ble farget med 5 ul av FITC Annexin V og 5 ul PI i 15 minutter ved romtemperatur i mørke. De fargede celler ble analysert ved FACS Calibur (BD, Franklin Lakes, NJ) i løpet av en time.
Western Blot analyse
MC38 celler eller tumorvev lysatene ble fremstilt ved hjelp av vestlige lysebuffer som inneholder protease og fosfatase hemmere på is. Celleekstrakter ble sentrifugert ved 12000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C og supernatanten ble benyttet for Western blotting. Proteinkonsentrasjon ble målt ved Bio-Rad analyse ved bruk av produsentens protokoll (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Tyve ug av supernatant-proteiner ble separert på 10% SDS-PAGE og overført på polyvinylidenfluorid membraner (Millipore, Billerica, Massachusetts) i 1 time. Membranene ble blokkert med 5% fettfri tørrmelk i Tris-bufret saltvann inneholdende 0,05% Tween-20 i 2 timer, etterfulgt av inkubasjon med primære antistoffer over natten ved 4 ° C. Den primære antistoffer av GAPDH (Cat # 4695s), ERK1 /2 (Cat # 5174), p-ERK1 /2 Thr202 /Tyr204 (Cat # 4370), JNK (Cat # 9252), p-JNK Thr183 /Tyr185 (Cat # 9251), P38 (Cat # 8690), p-P38 Thr180 /Tyr182 (Cat # 4511) og Caspase3 (Cat # 9664) var fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA), BCL-2 (Cat # sc-509), Bax (Cat # sc-20067) og cyclin D1 (Cat # sc-753) var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, California). Membranen ble deretter inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert kanin eller mus sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur. Immunreaktive bånd ble påvist ved hjelp av Super Signal West Pico kjemiluminescenssubstrat (Thermo Scientific, Rockford, IL).
tumorvekst studier i mus modell av type 2 diabetes
Dette prosjektet ble godkjent av Animal Care og bruk komité Folkets sykehus i Guangxi Zhuang autonome region, Nanning, Kina (# 2011-005). Mann B6.BKS-Lepr
db mus (
db /db
) og deres heterozygote kullsøsken (
db /+
) ble kjøpt fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Alle prosedyrer fulgt National Institutes of Health retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr. Mus ble plassert i en bestemt patogen fri anlegg under standard 12 timer lys /mørke syklus og matet standard gnager chow og vann
ad libitum
. Åtte uker gamle
db /db
mus ble brukt som type 2 diabetes modell mens
db /+
mus som friske kontroller. MC38 celler ble ekspandert i DMEM-medium supplert med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin
in vitro
. 2 x 10
6 MC38-celler suspendert i 0,1 ml PBS ble injisert subkutant inn i høyre flanke av hver mus for å initiere tumorvekst. For
in vivo
ERK1 /2 og JNK blokkerer studier, 10 mg /kg PD98059 eller 30 mg /kg SP600125 ble administrert intraperitonealt (ip) hver 3. dag når tumorvolumet nådd 100mm
3 (7- 8 dager etter startfasen) og varte i ytterligere 2 uker. 1% DMSO ble anvendt som kontrollbehandling. Størrelsene på svulster ble målt etter 3 dager med calipers når svulstene begynte å vokse. Hvilken som helst dimensjon av tumoren oversteg 20 mm eller tumorbelastning var større enn 10% av kroppsvekten ble ansett for å være endepunktene til observasjon. Tumorvolumet ble beregnet ved hjelp av formelen: tumorvolum = bredde
2 x lengde x π /6 [22]. CO
2 og halshugging ble brukt til mus dødshjelp. Svulster ble skåret ut og tumorvekten ble målt ved slutten av forsøkene. En del av svulstene fra begge grupper ble brukt for svulst lysat i Western Blot eksperimenter.
Målinger av blodsukker, insulin og IGF-1
Mus ble fastet i 6 timer, og blodsukker -konsentrasjonen ble overvåket i venøst blod tatt fra halevenen ved hjelp av en glukosemåler (Roche, Basel, Switzerland). Ved ofring ble blodprøver samlet for å måle serumkonsentrasjonen av insulin og IGF-1. Serumet insulin og IGF-1 ble bestemt av et enzym immunoassay henhold til produsentens protokoll (R D Systems, Minneapolis, MN).
Statistisk analyse
SPSS 17,0 programvare (SPSS Inc. , Chicago, IL) ble anvendt for statistisk analyse. Kvantitative resultater ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Den statistiske analysen ble utført ved Student t test mellom to grupper eller enveis ANOVA for data fra flere grupper. P-verdier. 0,05 ble vurdert som signifikante
Resultater
Insulin /IGF-1 fremmer kolon kreftceller spredning og cellecyklusprogresjonen
in vitro
tidligere studier har vist at insulin og IGF-1 har pro-spredningseffekter på forskjellige kreftceller [13]. Vi har spekulert i at insulin eller IGF-1 har de samme virkninger på MC38-celler, en mus avledet koloncancercellelinje. Ettersom blod insulin og IGF-1 nivåene økte i diabetes mellitus type 2 pasienter, kombinasjon av insulin og IGF-1 (insulin /IGF-1) ble også brukt til å etterligne dette miljøet
in vitro
. Faktisk fant vi at enten insulin eller IGF-1 fremmet utvidelse av MC38 celler
in vitro plakater (figur 1A). For å bestemme de pro-proliferative virkninger av insulin og IGF-1, ble en CCK-8-analysen brukt til å detektere cellenes levedyktighet. Som vi ventet, enten insulin eller IGF-1 fremmet spredning av MC38-celler på en doseavhengig måte. Videre, kombinasjonen av insulin og IGF-1 viste en additiv virkning på proliferasjon (figur 1B).
MC38-celler ble dyrket med forskjellige konsentrasjoner av insulin og IGF-1 i 72 timer. Kontrollgrupper ble behandlet med PBS. (A) Celle morfologi ble observert. (B) Celler ble høstet for spredning analyse med CCK-8-analyse. * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001 versus kontroll,
# P 0,05;
## P 0,01 mellom de angitte to gruppene, n = 3 per gruppe. (C) cellesyklusanalyse av insulin /IGF-1-behandlede celler. DNA-innhold ble målt ved PI flekker på strømningscytometri. Prosentandelene av cellesyklusfaser er vist i hvert panel. Dataene som vises er representative for tre separate eksperimenter.
neste adressert spørsmålet om insulin /IGF-1 forfremmet cellecyklusprogresjonen i MC38 celler. For den cellesyklusanalyse, ble DNA-innhold målt ved PI-farging på flowcytometri etter 72 timer med insulin og IGF-1-behandling. Cellesyklusanalyse viste at insulin /IGF-en signifikant reduksjon i andelen av MC38 celler i G0 /1-fase, og forbedret andelen av MC38 celler i S-fase (figur 1C). Dermed disse dataene viste at insulin /IGF-1 fremmer tykktarmskreft celleproliferasjon og cellesyklusprogresjon
in vitro
.
Insulin /IGF-1 hemmer kolon kreftceller apoptose
in vitro
apoptose spiller en viktig rolle under kreft vekst. For å vurdere om insulin /IGF-1 påvirket apoptose av celler MC38
in vitro
ble cellene dyrket med insulin og IGF-1 alene, eller begge sammen i 72 timer. Cellene ble høstet for apoptose analyse av Annexin V og PI flekker på strømningscytometri. Den apoptose-analysen viste at insulin og IGF-1 alene, eller begge deler samtidig reduseres den totale apoptotiske celler (figur 2A og 2B). For ytterligere å identifisere den fasen av apoptose, ble det tidlig og sent stadium apoptotiske celler måles også. Som forventet, alle behandlinger redusert tidlig stadium apoptose og sent stadium apoptose, med unntak av IGF-1 alene kan ikke påvirke sent stadium apoptose (Fig 2A og 2C). Resultatene viste at insulin /IGF-1 inhiberer tykktarmskreftceller apoptose
in vitro
.
MC38-celler ble dyrket med insulin og IGF-1 alene, eller begge sammen i 72 timer. Kontrollgrupper ble behandlet med PBS. (A) Celler ble høstet for apoptose analyse av Annexin V og PI flekker på strømningscytometri. Den tidlige fasen (Annexin V + /PI-) og sent stadium (Annexin V + /PI +) apoptotiske hendelsene ble inngjerdet. Dataene som vises, er representative for tre separate eksperimenter. Kvantifisering av total prosentandel (B) og tidlig /sent stadium prosentandel (B) av apoptotiske celler etter behandlingene. * P 0,05; ** P. 0,01 versus kontroll, n = 3 pr gruppe
Insulin /IGF-1 aktiverer ERK1 /2 og JNK signalisering av tykktarmskreftceller
in vitro
Forrige studien viste at Ras-Raf-MAPK signal, som fungerer som nedstrøms av insulin /IGF-1-signalisering spiller en rolle i spredning av ulike kreftformer [18-20]. For å avgjøre om Ras-Raf-MAPK signal involvert i insulin /IFG-1sinaling transduksjon, vi har oppdaget de 3 viktigste nedstrøms molekyler (ERK1 /2, JNK og P38) i Ras-Raf-MAPK signalveien. MC38 celler ble dyrket i 72 timer med forskjellige behandlinger og høstet for western blot analyse (figur 3A). Vi har funnet at insulin, IGF-1 og insulin /IGF-1 øket fosforylering av ERK1 /2 og JNK, bortsett fra P38 (figur 3B-3D). Videre var det additive effekt når insulin og IGF-1 ble anvendt sammen (figur 3B og 3C). Dermed disse dataene viste at insulin /IGF-1 aktiverer ERK1 /2 og JNK signalisering av tykktarmskreft celler
in vitro
.
MC38 celler ble dyrket med insulin og IGF-1 alene eller begge deler sammen i 72 timer og deretter samlet for western-blotting-analyse. Kontrollgrupper ble behandlet med PBS. (A) Western blotting-analyse av p-ERK1 /2, ERK1 /2, p-JNK, JNK, p-P38 og P38-protein-ekspresjon i behandlede celler. GAPDH fungerte som en lasting kontroll. Blottene er vist er representative for tre separate eksperimenter. Semi-kvantifisering for uttrykkene (B) ERK1 /2 og pErk1 /2, (C), JNK og p-JNK, (D) p38 og p-P38 proteiner. Brett endringer ble normalisert ved kontrollgrupper. * P 0,05; ** P 0,01; *** P. 0,001 versus kontroll, n = 3 pr gruppe
Hemming av ERK1 /2 eller JNK signale opphever de proliferative og anti-apoptotiske effekten av insulin /IGF-1
i vitro
Vi neste vurdert om effekten av insulin /IGF-1-signalet var ERK1 /2 og JNK avhengige. MC38 cellene behandlet med insulin /IGF-1 med eller uten 40 mM ERK1 /2 inhibitor PD98059 eller 20 uM JNK inhibitor SP600125 for 24, 48 eller 72 timer. De spredning priser ble målt ved hjelp av CCK-8 kit. Som vist i figur 4A, den proliferative virkning av insulin /IGF-1 ble opphevet ved enten PD98059 eller SP600125. Vi oppdaget også effekten av ERK1 /2 inhibitor (figur 4B) og JNK-inhibitor (figur 4C) i fosforylering, apoptose og proliferasjon med western blot. Den kombinerte insulin /IGF-1 dramatisk økt ekspresjon av anti-apoptotiske protein Bcl-2, proliferative protein Cyclin D1 og redusert ekspresjon av apoptotiske protein Bax og Caspase 3. Behandlet med enten PD98059 eller SP600125 kunne reversere disse effekter. Resultatene viste at inhibering av ERK1 /2 eller JNK signale opphever de proliferative og anti-apoptotiske virkninger av insulin /IGF-1
in vitro
.
MC38-celler ble dyrket med insulin og IGF- 1 alene eller begge sammen i 72 timer. ERK1 /2 inhibitor PD98059 (B), JNK inhibitor SP600125 (C) eller deres bærer DMSO tilsatt til kulturene når MC38-celler ble behandlet med både insulin og IGF-1. (A) Cellene ble innsamlet for analyse proliferasjon med CCK-8-analysen ved 24, 48 og 72 timer. ** P 0,01; *** P 0,001 mellom de angitte to gruppene, n = 3 per gruppe. (B og C) Western blot-analyse for p-ERK1 /2, ERK1 /2, p-JNK, JNK, Cyclin D1, BCL2, Bax og Caspase3 protein ekspresjon i de behandlede cellene MC38. GAPDH fungerte som en lasting kontroll. Blottene som vises er representative for tre separate eksperimenter.
Endogene insulin og IGF-1 er forhøyet hos mus type 2 diabetes modell
Åtte uker gamle mannlige
db /db
mus ble brukt til å etablere en spontan type 2 diabetes modell. Mens deres
db /+
kullsøsken ble brukt som normale kontroller. I begynnelsen av forsøkene, ble kroppsvekt og blodsukker testet for å confirme om diabetiker modellen var vellykket. Vi fant at
db /db
mus var overvektige i forhold til sine
db /+
kullsøsken som fikk normal vekt (Fig 5A). Fastende blodsukker hos
db /db
mus ble dramatisk forhøyet (figur 5B). Vi deretter bestemt hvorvidt serum insulin og IGF-1 ble endret i disse musene. Serum insulin ble økt i
db /db
mus som forventet (figur 5C). Hva mer, serum IGF-1 i
db /db
mus ble også økt betydelig (figur 5D). Resultatene indikerte at
db /db
mus er ideelle modeller for type 2-diabetes med høyt nivå av insulin og IGF-1.
Menn
db /db
mus ble brukt som mus type 2 diabetes modeller, mens
db /+
kullsøsken som normale kontroller. Kroppsvekt (A), blodglukose (B), insulin (C) og IGF-1 (D) ble bestemt før MC38 celler injeksjon ved 8
th uke. * P 0,05; *** P. 0,001, n = 5 per gruppe
Endogen insulin /IGF-1 akselererer kolon tumorvekst i mus type 2 diabetes modell
For ytterligere å validere effekten av endogen insulin /IGF-1 i veksten av tykktarms tumor, ble MC38 celler subkutant injisert i
db /db
eller
db /+
mus å initiere tumorvekst. Tumorvolumene ble målt ved ulike tidspunkt etter inokulering, og tumorvekter ble målt etter avliving. Vi fant ut at tumorvekst var raskere, og tumorvekt var tyngre i
db /db
mus enn
db /+
mus (Fig 6A og 6B). Neste vi har oppdaget fosforyleringen av ERK1 /2 og JNK, Cyclin D1, Bcl-2, Caspase 3 og Bax i tumorvev. Både p-ERK1 /2 og p-JNK uttrykk var høyere i
db /db
mus (Fig 6C og 6D). Uttrykk for cyclin D1 og BCL-2 ble økt, mens uttrykk for Bax og caspase 3 ble redusert i
db /db
mus, som var i samsvar med observasjonene
in vitro
(Fig 6E og 6F). Resultatene viste at endogen insulin /IGF-1 akselererer colon tumorvekst i en musemodell type 2 diabetes.
2 x 10
6 MC38-celler suspendert i 0,1 ml PBS ble injisert subkutant inn i
db /db Hotell og
db /+
mus for å starte tumorvekst
in vivo
. (A) Tumorstørrelsen ble målt hver 3. dag. * P 0,05; *** P 0,001. (B) Tumorene ble skåret ut og veiet 3 uker etter celleinjeksjon. *** P 0,001. En representant tumormasse fra hver gruppe ble vist i innfelt (skala bar = 1 cm). (C og E) Western blotting-analyse av p-ERK1 /2, ERK1 /2, p-JNK, JNK, Cyclin D1, Bcl-2, Bax og Caspase3 protein ekspresjon i tumorer. GAPDH fungerte som en lasting kontroll. Blottene er vist er representative for tre separate eksperimenter. (D og F) Semi-kvantifisering for de uttrykk for ERK1 /2 og pErk1 /2, JNK og p-JNK, cyclin D1, BCL-2, Bax og Caspase3 protein. Brett endringer ble normalisert ved kontrollgrupper. * P 0,05; ** P. 0,01 versus kontroll, n = 3 pr gruppe
Hemming av ERK1 /2 eller JNK signale undertrykker utviklingen av tykktarms svulst i mus type 2 diabetes modell
På slutten av denne studien, for å finne ut om utviklingen av colon tumor i
db /db-mus ble
ERK1 /2 eller JNK avhengige, anvendte vi ERK1 /2 eller JNK inhibitor for å behandle kolon tumorbærende
db /db
mus. Vi har funnet at virkningen av ERK1 /2 eller JNK inhibitor var doseavhengig og 10 mg /kg PD98059 eller 30 mg /kg SP600125 viste en bedre effekt for å blokkere tumor ERK1 /2 eller JNK-signalhenholdsvis
in vivo
(S1 fig). Som vi forventet, PD98059 eller SP600125 viste en signifikant undertrykkelse i tykktarm tumorvekst
in vivo
, som var konsistent med resultatene funnet
in vitro plakater (figur 7A). Tumormassen målinger ved slutten av forsøkene viste lignende resultater (figur 7B).
2 x 10
6 MC38-celler suspendert i 0,1 ml PBS ble injisert subkutant inn i
db /db
mus å initiere tumorvekst
in vivo
. 10 mg /kg PD98059 eller 30 mg /kg SP600125 ble administrert intraperitonealt hver 3. dag når tumorvolumet nådde 100mm
3. 1% DMSO ble anvendt som kontrollbehandling. (A) Tumorstørrelsen ble målt hver 3. dag. * P 0,05; *** P 0,001. (B) Tumorene ble skåret ut og veiet 3 uker etter celleinjeksjon. *** P 0,001. En representant tumormasse fra hver gruppe ble vist i innfelt (skala bar = 1 cm). (C og E) Western blotting-analyse av p-ERK1 /2, ERK1 /2, p-JNK, JNK, Cyclin D1, Bcl-2, Bax og Caspase3 protein ekspresjon i tumorer. GAPDH fungerte som en lasting kontroll. Blottene er vist er representative for tre separate eksperimenter. (D og F) Semi-kvantifisering for de uttrykk for ERK1 /2 og pErk1 /2, JNK og p-JNK, cyclin D1, BCL-2, Bax og Caspase3 protein. Brett endringer ble normalisert ved kontrollgrupper. ** P 0,01; *** P. 0,001 versus kontroll, n = 3 pr gruppe
Vi har også oppdaget de uttrykk for målrettet og nedstrøms proteiner etter PD98059 eller SP600125 behandling i denne modellen (figur 7C-7F). Som vi forventet, PD98059 og SP600125 spesifikt blokkert ERK1 /2 og JNK henholdsvis
in vivo plakater (Fig 7C og 7D). Både PD98059 og SP600125 redusert ekspresjon av Cyclin D1 og Bcl-2, men økte ekspresjon av Caspase 3 og Bax (figur 7E og 7F). Disse resultatene bekreftet at hemming av ERK1 /2 eller JNK signale undertrykker utviklingen av tykktarms svulst i mus type 2 diabetes modell.
Diskusjoner
I denne studien, observerte vi at insulin og IGF- 1, fungere som mitogener av tykktarm kreft celler, aktiverer ERK1 /2 og JNK MAPK signalering, noe som resulterer i cellesyklus akselerasjon, cellevekst og anti-apoptose i tykktarmskreft MC38 celler. Videre fikk vi bekreftet disse funnene
in vivo
ved å etablere et kolon svulst allograft modell med diabetes mellitus type 2.
Diabetes er preget av defekter i glukose homeostase og insulin funksjon. Diabetes mellitus type 2, som er preget av insulinresistens og høye insulin nivåer, utgjør 90-95% av diabetes mellitus [23]. Tiår med epidemiologiske bevis viste at diabetes mellitus type 2 var forbundet med en økt risiko for kreft på ulike nettsteder, inkludert colorectum, lever, bukspyttkjertel, bryst og blære [24]. Vår tidligere studie fant at diabetes mellitus type 2 kan være en av de viktigste sykdomsfremkallende risikofaktorer for tykktarmskreft i kinesisk [25]. Men det var også en del forskere er hevdet at disse forbindelser kan være forårsaket av skjevheter i litteraturen [26, 27]. En fersk paraply gjennomgang som vurderes sammenhenger mellom diabetes mellitus type 2 og risiko for å utvikle kreft i 20 områder, viste at bare kolorektal, bryst, intrahepatisk kolangiokarsinom, og livmorkreft måtte robust bevis for å underbygge risikoen for å utvikle kreft uten hint av skjevhet [28].
mekanismene for diabetes mellitus type 2 fremmer utviklingen av kreft er ennå ikke undersøkt, herunder hyperinsulinemi, høyt nivå av IGF-1 og hyperglykemi i diabetes mellitus type 2 [29]. Våre tidligere undersøkelser viste at insulin glargin fremmet vekst av human koloncancer (HCT-116 og SW480-celler) og brystkreft (MCF-7-celler)
in vitro product: [30, 31]. Hva mer, ble glargin insulinbehandling antas å øke risikoen for å utvikle tykktarmskreft [32]. I tillegg, hyperinsulinemi fører også til å øke nivået av bioaktive IGF-1, som er et potent mitogen som kan resultere i karsinogenese [33]. Men gjorde en randomisert kontrollert studie ikke støtter hypotesen om at hyperglykemi var relatert til økt kreftrisiko [34]. Derfor kan hyperinsulinemia og høyt nivå av IGF-1 være de viktigste mekanismer. Resultatene fra vår studie støtter denne hypotesen. Vi har funnet at kombinasjonen av insulin og IGF-1 betydelig grad fremmet vekst og cellesyklusen av murine colon cancer MC38 celler enn engangsbruk av insulin eller IGF-1
in vitro
. Dette resultatet viste også at insulin /IGF-1 hadde en additiv virkning i MC38 celler spredning.
MAPK signalveier, som konverterer ekstracellulære signaler i bestemte cellulære responser gjennom en serie av hendelser fosforylering, spiller en viktig rolle i colon kreftutvikling og metastasering [35]. ERK1 /2, P38 og JNK er de 3 store MAPK familier funnet aktivert i tykk- og endetarmskreft. Tidligere studier antydet at ERK1 /2 pathway, men ikke JNK-reaksjonsveien eller P38, er en viktig regulator av celleformering i kolorektal cancer [36]. De andre to MAPK veier, den P38 og JNK, megle apoptose og inflammatorisk respons [36]. Imidlertid kan virkningen av JNK-aktivering være mangfoldig i reguleringen av apoptose når cellen mottar forskjellig stimulering. For enkel og vekstfaktorer fører til proliferasjon og anti-apoptose via JNK-reaksjonsveien, mens de inflammatoriske cytokiner (for eksempel TNF-α) fører til apoptose [37]. Det er allment akseptert at insulin eller IGF-1 fremmer proliferasjon av ulike kreftformer ved å aktivere MAPK signalings [18-20]. Vår nåværende studie viste tydelig at insulin /IGF-1 aktiveres ERK1 /2 og JNK MAPK men ikke P38 MAPK signal i spredning av MC38 celler. Inhiberingen av ERK1 /2 eller JNK viste at begge disse MAPK signalings bidratt til proliferasjon og anti-apoptose. Imidlertid, Carlson et al. rapportert at insulin ikke forbedre ERK1 /2, JNK eller P38 fosforylering i adipocytter fra T2MD pasienter [38]. Mens Gogg et al. viste at MAPK signal (ERK1 /2) ble økt, men insulinsignaleringen ble svekket i subkutane mikrovaskulære endotelceller fra T2MD pasienter [39]. De ovennevnte og våre resultater studier indikerte at aktivering og effekter av MAPK signal av insulin eller IGF-1 i ulike cellelinjer kan være ulike.
Neste, vi ment å bekrefte vår hypotese med en mus diabetes mellitus type 2-modellen
in vivo
. Mangelen på pålitelige dyremodeller som etterligner menneskelig diabetes mellitus type 2 har forsinket undersøkelser av spesifikke mekanismene som er involvert i samspillet mellom diabetes mellitus type 2 og kreftutvikling. I løpet av disse tiårene ble flere mus diabetes mellitus type 2 modeller introdusert i diabetesstudier. Det er 2 typer mus diabetes mellitus type 2-modellen: induserte og spontane diabetes mellitus type 2 modeller [40]. Høy fett diett pluss lav dose av streptozotocin er en hyppig brukt metode for å indusert diabetes mellitus type 2 hos mus. Imidlertid lang tid som er nødvendig for induksjon, ustabil hyperinsulinemia og stor variasjon er begrensningene i denne modellen. [41]. De leptin reseptor knockout mus (
db /db
mus) er relativt egnet for spontan diabetes mellitus type 2-modellen [42]. I denne studien fant vi at blodsukker, serum insulin og IGF-1 var ekstremt høyere i
db /db
mus enn
db /+
mus ved 8 ukers alder. Disse parametrene ble korrelert med diabetes mellitus type 2 pasienter. Dessuten, både
db /db
mus og tykktarmskreft MC38 celler vi brukte var med C57BL /6 bakgrunn, noe som gjorde det mulig for oss å etablere en MC38 kolon svulst allograft i
db /db
mus. Derfor
db /db
mus ble den ideelle spontan diabetes mellitus type 2-modellen i vår studie. Kazuya et al.
