Abstract
Micro RNA (mirnas) er en klasse av små, ikke-kodende RNA-arter som spiller viktige roller i hele mobilnettet utvikling og regulering. miRNA uttrykk mønstre hentet fra ulike vevstyper peker ofte til mobil avstamning av en enkeltperson vevstype, og dermed blir en mer invariant kjennetegn på vevstype. Nyere arbeider har vist at disse miRNA uttrykk mønstre kan brukes til å klassifisere tumorceller, og at denne klassifiseringen kan være mer nøyaktig enn den klassifiseringen oppnådd ved hjelp av budbringer RNA genuttrykksmønster. Et aspekt av miRNA biogenese som gjør dem særlig attraktive som en biomarkør er det faktum at de blir opprettholdt i en beskyttet tilstand i serum og plasma, og dermed gir påvisning av miRNA ekspresjonsmønstre direkte fra serum. Denne studien er fokusert på evaluering av miRNA ekspresjonsmønstre i humant serum for fem typer humane cancer, prostata, kolon, eggstokk, bryst og lunge, ved hjelp av et pan-human mikroRNA, høy tetthet microarray. Dette microarray plattform muliggjør samtidig analyse av alle menneskelige microRNAs av enten fluorescerende eller elektrokjemiske signaler, og kan enkelt redesignet for å inkludere nylig identifiserte miRNAs. Vi viser at tilstrekkelig mirnas er til stede i en milliliter av serum å detektere miRNA uttrykk mønstre, uten behov for amplifiseringsteknikker. I tillegg er vi i stand til å bruke disse uttrykk mønstre til riktig diskriminere mellom normale og kreftpasientprøver
Citation. Lodes MJ, Caraballo M, Suciu D, Munro S, Kumar A, Anderson B (2009) Detection av kreft med Serum mirnas på et oligonukleotid Microarray. PLoS ONE 4 (7): e6229. doi: 10,1371 /journal.pone.0006229
Redaktør: Alfredo Herrera-Estrella, Cinvestav, Mexico
mottatt: 03.02.2009; Godkjent: 04.06.2009; Publisert: 14.07.2009
Copyright: © 2009 lodes et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Combimatrix er en reklamefilm for-profit selskap, som ga støtte til studien. Nøkkel etterforskere er ansatte i selskapet. Tillatelse fra selskapets juridiske og finans avdelinger ble innhentet for å sende publikasjonen, og tillatelse fra tilsynene ble innhentet for å starte undersøkelsen. Vitenskapelig ansatte designet studien, samlet og analysert dataene og skrev manuskriptet
Konkurrerende interesser. CombiMatrix er en reklamefilm for-profit selskap og sentrale etterforskere er ansatte i selskapet. Forfatterne har erklært at ingen andre konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
microRNAs (miRNA) er single-RNA molekyler av ca 21-23 nukleotider i lengde, hvilken funksjon i regulering av gen uttrykk. mirnas er uttrykt som en del av primær transkripter i form av hårnåler med signaler for dsRNA-spesifikk nuklease spaltning av ribonuklease drosha i kombinasjon med en RNA-bindende protein. Etter at forløperen miRNA frigjøres som en tilnærmet 70 nt RNA, blir den transportert fra kjernen til cytoplasma av exportin-5, og deretter spaltes ved dicer RNase III for å danne en dobbelt-trådet RNA. Dicer initierer dannelsen av RNA-induced Slå kompleks (RISC), som er ansvarlig for genet Slå observert på grunn av miRNA uttrykk og RNA interferens [1], [2], [3].
microRNAs ha blitt funnet i vev, og også i serum og plasma, og andre kroppsvæsker, i en stabil form som er beskyttet mot endogen RNase-aktivitet (i forbindelse med RISC, enten fritt i blodet eller i exosomes (endosomet-avledede organeller)). Studier av Lu et al [4] demonstrert muligheten og nytten av å overvåke ekspresjon av mirnas i humant kreftvev. De fant en høy grad av diversitet i miRNA uttrykk på tvers av kreft, og fant at ca. 200 mirnas kan være tilstrekkelig til å klassifisere humane kreftformer. Tam [5] tilføyer at fordi mirnas fungerer som ledere i gennettverk, de er forskjellige fra andre biomarkører fordi de har en patogen rolle i sykdomsprosessen og ikke er biprodukter av sykdomstilstanden. Fordi mirnas funksjon av spesifikk binding til sine mål, kan polymorfismer (SNP) i sekvensen av miRNAs eller sine mål mRNA føre til sykdom, inkludert kreft. Disse miRNA-spesifikk SNP kan påvirke risiko for sykdom og kan også benyttes ved diagnose av disse sykdommer [6]. Deregulerte mirnas har blitt beskrevet fra en rekke menneskelige kreft inkludert bryst, lunge, tykktarm, eggstokkreft og prostatakreft. Mitchell et al [7] fant at mirnas som stammer fra prostata kreftvev angi sirkulasjon og kan brukes til å skille pasienter med prostatakreft fra friske kontroller og etablert en blod-basert PCR-metode for påvisning av human prostatakreft. En tilsvarende tilnærming ble brukt til å oppdage serum miRNA fra eggstokkreft pasienter [8]. Taylor og Gercel-Taylor [9] undersøkt ved bruk av sirkulerende exosomes i diagnostisering av kreft. De fant at den miRNA innholdet av ovarian tumorceller og sirkulerende exosome var lik og kan brukes til å skille kreftpasienter fra pasienter med godartet ovarialsyndrom og fra normale kontroller.
miRNA signaturer fra normale og cancerøse vev har blitt brukt å klassifisere flere typer kreft, og kan også tillate klinikere å finne en behandling kurs basert på den opprinnelige vevstype. Det kan også være mulig å benytte miRNA uttrykk mønstre som en biomarkør for å overvåke virkningen av behandlingen av kreft progresjon [2]. Fordi miRNA ekspresjonsprofiler parallelt utviklingsmessige opprinnelse vev, og fordi relativt få mirnas kan brukes for effektivt å skrive vev, er de potensielt overlegne markører enn messenger RNA for kreftdiagnose [4]. Potensialet for anvendelse av serum mirnas som biomarkører for sykdom, og som mål for terapeutiske midler er lovende [10], ettersom det ville bety en ikke-invasiv, nøyaktig test for kreft. I denne studien, viser vi at serum mirnas kan brukes til å diskriminere mellom kreftpasient sera og normal donor sera, ved hjelp av en enkel microarray analyse som krever ingen forsterkning trinn.
Resultater
Serum mikroRNA utvinning
Vi har fastslått at en tilstrekkelig mengde av mirnas er til stede i mindre enn 1 ml av humant serum for å frembringe et detekterbart signal på en microarray ved hjelp av fluorescens eller elektrokjemisk deteksjon (ECD). Ved hjelp av en enkel fenol /kloroform-ekstraksjon protokollen, vi utvinnes omtrent 1,3 mikrogram av serum RNA fra hver 800 ul av serum (gjennomsnitt av 18 prøver, standard avvik 0,3). Det resulterende mønster av miRNA uttrykk kan benyttes for å skille mellom kreftpasienter og normale donorer.
Den omtrentlige størrelse av de små RNA utvinnes fra plasma ble bestemt ved å isolere store RNA-fragmenter (lav etanolkonsentrasjon) og små RNA-fragmenter (høy etanolkonsentrasjon) ved anvendelse av Invitrogen PureLink miRNA isolasjonskit, etter syre fenol /kloroform ekstraksjon og utfelling. De to RNA størrelse fraksjoner ble merket med biotin (Mirus) og hybridisert til en microarray. Resultatene (ikke vist) indikerte at det store flertall av signalet var fra små RNA-fraksjonen, som var tilsvarende til signalet fra den ikke-fraksjonert prøven.
DNA-kontaminering av ekstrahert serum nukleinsyre ble undersøkt ved sammenligning av et utklipt som ble delt, og halvparten behandlet med DNase I. Når du har merket både behandlet og ubehandlet prøver med biotin og hybridisering til ulike sektorer av samme 4 × 2K array, kunne svært liten forskjell sees mellom behandlede og ubehandlede prøver (r
2 = 0,9 og 0,96 for henholdsvis to replikater) som indikerer at lite DNA forurenser prøver (data ikke vist).
analysens følsomhet og stabilitet
sensitiviteten av vår miRNA analysen ble bestemt ved å tilsette fortynninger av en syntetisk RNA-oligonukleotid til vår analyse i løpet av serum ekstraksjon. Vi var i stand til å oppdage om lag 4000 eksemplarer av serum microRNAs per mikroliter av serum (figur 1). Dette deteksjonsgrensen er lik den som er rapportert i Mitchell et al [7] for prostatakreft spesifikke mikroRNA MIR-141 ved bruk av TaqMan analyser. miRNA mikromatriser er forholdsvis mer følsom enn vanlige ekspresjonssystemer mikromatriser fordi små oligonukleotider har en tendens til å ha bedre hybridiseringsbetingelser kinetikk enn større RNA eller DNA-molekyler. For mirnas, både deres beskyttelse mot nedbrytning av forskjellige cellulære faktorer, og deres lille størrelse bidrar til deres deteksjon i serum ved hjelp av mikromatriser på nivåer som er så lave som de sett med metoder som ellers ville bli betraktet mer følsom.
RNA miRNA analoge oligonukleotider, ved konsentrasjoner i området fra 0 til 40 millioner kopier per mikroliter, ble tilsatt i 400 ul av serum etter tilsetning av RLT buffer. RNA ble deretter ekstrahert fra serum ved hjelp av fenol /kloroform-ekstraksjon og en etanolutfelling. Prøvene ble deretter merket og hybridisert på en microarray. Vertikale linjer indikerer rekkesignalintensitet for spesifikke miRNA sonder som representerer villtypesekvensen (Wild) og sonder med to interne mutasjoner (Mut) for (A) åre | MIR-431 og (B) åre | MIR-127. Vekter for 4000 og 0 kopier datapunkter (eske i venstre panel) er utvidet i høyre panel. (C) åre | MIR-431, og (D) åre | MIR-127
Vi har også fastslått at data som er samlet fra de samme serumprøvene etter å ha blitt frosset ved -80 ° C i 1 uke etter den første mikroRNA analysene, var tilsvarende de opprinnelige data. MicroRNAs fra porsjoner av 2 serumprøver fra kreftpasienter (en prostata og tykktarm 1) ble ekstrahert, merket og hybridisert til matriser, og etter en fryse /tine-arrangement, ble nye porsjoner igjen ekstrahert, merket og hybridisert til en annen matrise. Datasett, fra re-analysert prostatakreft prøve 811 og tykktarm prøve 792, viste sterk korrelasjon når rå array-data ble sammenlignet (r
2 = 0,94 og 0,96 henholdsvis). Dette resultatet indikerer at analysen er reproduserbar og stabil over tid.
Serum mikroRNA dataanalyse
Flere prostata, eggstokk, tykktarm, bryst og lungekreft serumprøver samt normal mannlig og kvinnelig donor sera har blitt analysert på pan-miRNA microarray for å fastslå serum miRNA profiler og for å bekrefte spesifisiteten av profiler for ulike kreftformer og normale donorer. Flere dataanalysefremgangsmåter er blitt testet for å bestemme den mest relevante metode for diskriminering av kreft sammenlignet med det normale. For foreløpige analysen, logger vi
2-transformert serum miRNA sondesignaler fra en normal donor og sammenlignet disse dataene til å logge
2-transform probe data fra en prostata kreft pasient og fra en prostatakreft cellelinje. Selv om både prostatakreft serumprøve og prostatakreft-cellelinje (22Rv1) prøve viste seg-regulering i forhold til en normal serumprøve, de ikke viser mye likhet til hverandre. På dette punktet, vi bare merke en relativ oppregulering av serum miRNAs i kreft sammenlignet med serum fra normale donorer (figur 2).
Logg forvandlet normal donor serum miRNA signaler (blå linje) ble sammenlignet med miRNA array-signaler fra en prostatakreft-cellelinje 22Rv (åpne firkanter) og fra en pasient prostatakreft (lukkede diamanter). Generelt, kreft og cellelinje mirnas synes å være oppregulert i forhold til normale donor serum mirnas.
Vi først satt ut for å definere et minimalt sett med sonder som ville tillate oss å skille mellom prostata og normale serumprøver. Signal fra hver miRNA probe var første bakgrunn korrigeres med negativ kontroll prober. Deretter ble hver miRNA sonde uttrykt som den naturlige logaritme av forholdet mellom seg selv og den samme sonde i en normal human serumprøve mannlig. Dette gir en verdi på 0 for alle basisserumprøve prober og en opp- eller nedregulering med hensyn til at prøven (normal) for alle de andre prøvene (normal og kreft). Figur 3 viser prosenter av en undergruppe av sonder som passerte flere kriterier. Alle prostatakreft probe datasettene ble filtrert for å fjerne alle probene som passer perfekt signal var ikke større enn dens mutant signal. Femten mirnas ble funnet å være over-uttrykt i serum fra alle trinn 3 og 4 prostatakreftpasienter (MIR-16, -92a, -103, -107, -197, -34b, -328, -485-3p, -486 -5p, -92b, -574-3p, -636, -640, -766, -885-5p) med hensyn til 8 normale kontroller (figur 3). Denne analysen viste også en litt forhøyet signal for MIR-141 i trinn 3 og 4 prostatakreft pasientsera (gjennomsnitt = 829, STD = 201) over normal donor sera (gjennomsnitt = 555, STD = 64); som er i overensstemmelse med data som rapporteres av Mitchell et al [7] ved hjelp av RT-PCR.
Når dataene angitt normalisering, den naturlige logaritme av forholdet mellom signalet for en spesifikk probe i løpet av den samme proben fra den normale serumprøve ble tatt. 15 mirnas viste oppregulering i alle trinn 3 og 4 prostatakreft prøvene sammenlignet med sera fra normale mannlige donorer. Disse mirnas er listet nedenfor hvert datasett. Fem trinn 3 og 4 prostatakreft sera (gul), og åtte normal mannlig donor sera (rød) ble analysert. Vertikale linjer indikerer pluss eller minus ett standardavvik over gjennomsnittet.
I figur 4 har vi plottet z-score-korrigerte signalintensitet for tre hybridiseringer. Z-score normalisering ble beregnet ved å subtrahere signalet ved hver sonde ved gjennomsnittet av måleledningene fra hele hybridisering, og deretter, ved å dele på at verdien av standardavviket til signalet på tvers av måleledningene, på tvers av hver hybridisering. Denne normaliserings utbytter sondesignaler som er sentrert og normalisert til et gjennomsnitt på 0 og et standardavvik på 1,0. For hver tomt, ble signal sortert fra høyeste til laveste intensitet, og plottet som en heltrukken linje. Perfekt match /mismatch (pm /mm) forhold ble plottet som åpne trekanter over signalintensiteten linje. Åpenbart prober med høyere intensitet har betydelig høyere pm /mm forholdstall. For signal fra en miRNA å bli vurdert vesentlig, må dens perfekt match (vill-type anti-sense) prøvesignalet være større enn at den er dobbel mutant negativ kontroll (mm) sonde. Nærmere bestemt må pm /mm-forholdet være større enn 1,5 (plottet på den høyre y-akse). Ved denne beregningen ble minst 34 prober betraktet som signifikant for den normale serumprøven (figur 4A). For prostatakreft-cellelinje 22Rv1 prøven og prostatakreft serumprøve (figur 4 B og C), var der 57 og 62 betydelige prober respektivt. På det enkleste nivået, det faktum at de fleste av sonder som har høy signal har også høy pm /mm forholdstall indikerer at signalene vi leser er reelle. Vi utførte også flere ikke-miRNA negativ kontroll hybridizations. For disse hybridiseringer, selv om enkelte sonder har et høyere signal enn andre, dette er ikke ledsaget av en tilsvarende økning i pm /mm-forhold (ikke vist) på
(A) Analyse av signal fra normalt serum.; (B) Analyse av signal fra 22Rv1 cellekultur; og (C) signal fra prostata cancer pasient serum. Z-score (blå linjer) ble bestemt ved å subtrahere signalet ved hver sonde ved gjennomsnittet av test probene fra hele hybridisering, og deretter, ved å dividere den resulterende verdi ved standardavvik av signalet på tvers av måleledningene, på tvers av hele hybridisering.
hierarkisk clustering.
hierarkisk clustering ble brukt til å gruppere prøver fra ulike sykdommer og normale tilstander (figur 5). Datasettet som brukes for clustering inneholdt 35 serumprøver som var en blanding av normalt serum og kreft serumprøver av forskjellige typer og alvorlighetsgrad (etapper) (se tabell 1 og 2). Siden de fleste av mirnas brukes på microarray ikke er til stede ved påvisbare nivåer i de fleste serumprøver, clustering ble bare utført på et delsett av miRNAs. Dette undergruppe ble trukket fra gruppen av miRNAs som ble vurdert å være betydelig. Bare signalet fra miRNA probe-sett som ble funnet å ha vært betydelig i minst 5 hybridiseringer på tvers av hele datasettet ble tatt og anvendt for videre analyse. Signal fra test sonder (villtype anti-sense) var log
2-transformert. Disse prober ble deretter normalisert ved omdannelse til Z-score. Bare test sonder, ikke noen av de negative kontroller eller spike-ins, ble brukt for denne beregningen. Signalet ble så terskel på grunnlag av betydning. Hierarkisk clustering ble utført ved hjelp av et program skrevet i huset som bruker Spearman rank korrelasjon som avstanden funksjon. Utgangen for dette programmet er en dendrogram som ble vist ved hjelp av programmet Utforsker [11]. Clustering indikerer en klar avgrensning mellom normal og de fleste kreftprøver (figur 5).
Kreftprøver og normale donorprøver (brak) ble gruppert ved hjelp av en hierarkisk clustering program for å vise prøve-til-prøve relasjoner. Eksempel på etikettene inkluderer donor tilstand (krefttype eller normal), prøvepartinummer (siste tre sifre), kjønn og kreft stadium (2-4, eller 0 for normal). Etiketter merket med a eller b indikere gjentatt testing av den samme prøven.
Varmekart analyse.
For ytterligere å utforske mirnas ansvarlig for clustering, Varme kartene ble brukt for å søke etter likheter mellom miRNA uttrykk mønstre innenfor hver prøve. Denne metode er mest effektiv når rader og kolonner er ordnet for å tillate at disse mønstrene lett kan identifiseres. Clustering ble således benyttet for å gi denne rekkefølgen (ved å identifisere mirnas som har lignende uttrykk mønstre, og arrangere dem i umiddelbar nærhet). Denne informasjonen ble portet til åpen kildekode-program, Cluster [12]. Rådata for både prøven og miRNA signal ble median sentrert og deretter gruppert ved hjelp av gjennomsnitt sammenhengen, Spearman rank koeffisient som en avstand funksjon. Heatmaps ble vist ved hjelp av Utforsker [11]. Denne metoden resulterte i en klar ordning av prøver tatt fra vår test-sett (figur 6). Prøvene ble merket med en unik identifikator. Serumprøver fra pasienter med tykktarm, prostata, ovarie, bryst og lunge cancer i forskjellige stadier av sykdommen og behandlingen ble anvendt i dette datasettet. Denne analysen resulterte i to hovedgrener:. En hovedgruppe av sekvenser som inneholder det meste av kreftprøvene, og en annen gren som inneholder normalgruppen sammen med en andre kreft gruppe (figur 6)
Settet av miRNAs benyttes for analyse ble valgt på grunnlag av betydning i minst 5 hybridiseringer. En probe-sett ble bedømt vesentlig dersom forholdet mellom perfekt-kamp (PM) /mismatch (MM) prober var større enn 1.5.For hver hybridisering i analysen, ble eneste signifikante signal som benyttes for gruppering. Signal for de mirnas hvis signalet ble dømt betydelig ved PM /MM forholdene var Logg to konvertert. Da signalet var median normalisert over det hybridisering og gjennomsnittlig Heis Clustering ble utført ved hjelp av en Spearman Rank korrelasjon. Clustering ble visualisert ved anvendelse av programmet Treeview [12]. Grønn indikerer negative verdier og Rødt indikerer positive verdier. Prøvene er identifisert som enten normal (blå søyle) eller kreft (gul linje) på toppen av figuren. miRNA navn er oppført til høyre og eksempel identifikasjoner er nevnt ovenfor
beslutningstre analyse
For hver miRNA moden region, ble to kontroller skrevet på brikken.. en følelse vill -type probe (r), et anti-sense villtype (PM) form og en dobbel mutant kontroll (MM). Denne sonden sett ble anvendt for å evaluere betydning, så vel som intensiteten av hver miRNA modne formen. For hver hybridisering, ble rå signal ut og prober ble gruppert etter den miRNA at de var ment for. PM signal var log
2 forvandlet, og Z-normalisert. For klassifikator og for fokusert kreft kontra normal hierarkisk clustering, brukte vi en enkel heuristisk å avgjøre om en sonde var faktisk til stede. For hver miRNA som ble evaluert, telte vi et signal betydelig hvis signalet for PM /MM 1.0. Hvis ja, ble deretter Z-normaliserte logg
2 (signal) som benyttes for det miRNA, ellers sondedata for den bestemte sonde ikke ble brukt. Normalisering ble dermed utført over anti-sense villtype sonder over chip; men ble bare data fra betydelige prober brukes for clustering og klassifisering.
Data Mining ble utført ved hjelp av WEKA pakken [13]. Normalisert probe intensitet data ble omgjort til Arff format og innspill til WEKA programmet. Hybridiseringer ble gruppert i to klasser, «kreft» og «normale». Vi brukte CfsSubsetEval rutine å velge miRNA-tallet (attributter). Denne metoden ga den beste klassifisering av data i de to klassene. Denne rutinen vurderer den prediktive evne til hver attributt, så vel som graden av redundans mellom hver miRNA. Den foretrekker attributter som er høyt korrelert innenfor hver klasse, men som har lav inter-korrelasjon. Valget av attributter ble utført ved bruk av 10-gangers kryssvalidering, og utvelgelse av de 28 beste egenskaper var basert på deres velges minst 30% av tiden.
neste ekstrahert signal fra hver hybridisering for bare denne utvalgt sett av miRNA-tallet. I figur 7A, ble to forskjellige klassifiserere brukes for å skille kreft sammenlignet med normale prøver. En Bayesiansk nettverk og en forekomst-basert metode som kalles K * [14] var i stand til å tydelig skille de to klassene innen 36 prøver. Clustering ble neste utføres ved hjelp av Cluster programmet fra Eisen et al. [12]. Gjennomsnittlig sammenhengen ble brukt som de tre-building kriterier og Spearman rank korrelasjon ble brukt som avstanden funksjon. Figur 7 B viser en mye bedre separasjon av normal vs. kreft pasientprøver.
Data Mining ble utført ved hjelp av WEKA pakken [13]. miRNA sonder (attributter) ble valgt ved hjelp av et attributt utvalg rutine kalt CfsSubsteEval. (A) 28 mirnas ble funnet ved hjelp av denne metoden. To forskjellige Klassifiserings metoder, både Bayes nettverket implementering og K * metoder [14] var i stand til å korrekt klassifisere disse prøvene (ved hjelp av 10-fold kryssvalidering). Resultatene for begge Klassifiserings kjører vises som en forvirring matrise til høyre. (B) Hierarkisk clustering av normale og kreftprøver ble utført ved hjelp av signal fra disse 28 miRNAs. Røde blokkene er sterkt uttrykt, grønn anses nedregulert og sorte blokker er ikke-signifikant bedømt ved PM /mm kriterier som er beskrevet i teksten. Prøvene er identifisert som enten normal (blå søyle) eller kreft (gul linje) på toppen av figuren. miRNA navn er oppført til høyre og eksempel identifikasjoner er oppført ovenfor.
Analyse av kodede prøver.
miRNA microarray data fra kreftpasienter og normal donor sera ble kodet for å fjerne noen indikasjon av sykdomsstatus og sendt inn for analyse. Ved hjelp av undersett av egenskaper som er beskrevet ovenfor og i figur 7, ble 16 enkelt-blind prøver tilsatt til datasettet og analysert med klassifikator. Den k-stjerners klassifikator var i stand til å ringe 16/16 prøver riktig som enten fra kreftpasienter eller normale donorer, mens Bayes Network klassifikator produsert 3 feilklassifiseringer av 16
Diskusjon plakater (data ikke vist).
miRNA uttrykk signaturer har en potensiell rolle i diagnose, prognose og behandling av humane sykdommer, inkludert kreft, hjertesykdommer, virale infeksjoner og inflammatoriske sykdommer [1] – [4], [10], [15] – [25 ]. Deregulering av miRNAs i kreft kan være forårsaket av kromosomale delesjoner, presiseringer og trans; ved hypermethylation av CpG øyer; og ved regulering av transkripsjon og post-transkripsjonell bearbeiding [1], [2], [23]. Avvikende ekspresjon av mirnas kan påvirke progresjon av kreft ved å påvirke ekspresjon av onkogener eller tumor-suppressorer og mirnas, slik som MIR-17-92 klynge, kan fungere direkte som onkogener [1], [2], [23]. mirnas er også involvert i kreft gjennom deres effekt på cellesyklus, apoptose, metastaser, og angiogenese [1], [2], [23].
Flere studier har detaljert mirnas som er forbundet med kreft [ ,,,0],15], [23], [26] – [32]. De fleste av disse studiene har brukt biopsiprøver, arkivering vev eller cancerceller [5], [33] – [37]; eller har brukt mirnas hentet fra parafin innstøpt eller formalin fiksert vev [38]. Ved å sammenligne ikke-cancerøse vev som omgir cancervev, eller normale donorer versus kreftpasienter, de mirnas som er opp eller ned regulert kan identifiseres, ofte etter PCR-amplifikasjon. Mange studier har blitt publisert som beskriver spesifisitet mirnas for ulike typer kreft, kreft stadier og kreft behandlinger og flere vurderinger har blitt publisert som oppsummerer den nyeste informasjonen om rollene til mirnas i kreft [1], [2], [5 ], [6], [15], [23], [25], [32]. Disse studiene demonstrerer nytten av mirnas i både diagnose og prognose av flere kreftformer og også skille mellom kreft og godartede lidelser [34]. Mens mange studier har ført til en forståelse av miRNAs på en vev eller cellenivå, er det et sparsomt med data i serum studier hindrer deres bruk i rutinediagnostikk.
Nylig en rekke studier har blitt utført på mirnas stede i serum [7] – [9], [39] – [41]. I en fersk rapport, ble mirnas vist å være signifikant forhøyet hos gravide versus ikke-gravide kvinner [40]; og i en annen studie ble placenta mirnas vist seg å være til stede i morens plasma [42]. I disse studiene, ble mirnas funnet å være meget stabile for lagring, og også til en hvilken som helst RNAse degradering. mirnas har nylig blitt vist av Mitchell et al [7] for å sirkulere i serum fra pasienter med prostatakreft [7]. Spesielt kan MIR-141 skiller prostatakreftpasienter fra normale individer [7]. I et verk av Taylor og Gercel-Taylor [9], ble sirkulerende tumor exosomes isolert fra serum av eggstokkreft pasienter som bruker magnetiske kuler og en antiEpCAM antistoff. mirnas ble deretter ekstrahert, merket og oppdaget av microarray. Denne tilnærmingen, ved hjelp av større mengder serum, indikerte at åtte diagnostiske mirnas var oppregulert i kreft exosomes: Mir-21, MIR-141, MIR-200A, MIR-200c, MIR-200b, MIR-203, MIR-205, og MIR-214. Hittil er imidlertid ingen rutinemessig analyse tilgjengelig for å undersøke miRNA signaturer i serum eller i plasma hos kreftpasienter.
Ett problem som vises i disse studiene er det faktum at miRNA uttrykk mønstre sett i serum er ikke identiske de som er sett fra mirnas tatt direkte fra kreftcellelinjer. I vår studie har vi funnet at selv om både prostatakreft serumprøve og prostatakreft-cellelinje (22Rv1) prøve viste oppregulering i forhold til normal serumprøven, de viser ikke mye likhet til hverandre. Denne tilsynelatende avviket kan være å ta sted for en rekke årsaker. Den mest åpenbare av disse er muligheten for at prøver tatt fra cellelinjene selv er ikke representative for hva som vises i serum. Vi kan spekulere i at den mest åpenbare kilden til mirnas som vises i serum er et produkt av tumorcellelyse; kan det imidlertid også være mulig at deres opptreden i serum er et produkt av en form for aktiv transport involverer dannelsen av exosomes (36). Dette vil forvirre en direkte sammenligning mellom miRNA uttrykk mønstre som stammer fra cellelinje og tumor med de som er serum-avledet.
Informasjon om bruk av miRNAs som biomarkører er hovedsakelig knyttet til studier av vevsprøver eller kreftcelle linjer. Distinkte mønstre av miRNA uttrykket er i stand til å skille mellom celletype og stadium i ulike kreftformer. Dette lover godt for diagnostiske og prognostiske anvendelser av miRNA profiler. Det indikerer også at det er helt klart et behov for å definere uttrykket profiler av mirnas i serum hos kreftpasienter og sammenligne disse til profiler observert i serum fra enkeltpersoner som representerer en rekke syke og friske stater. Det er forventet at miRNA profiler i serum har potensial til å være tidlige markører for diagnose av kreft og vil også spille en rolle i overvåkingen av sykdomsstatus under kjemoterapi.
I denne studien har vi fastslått at en tilstrekkelig mengde av mirnas er tilstede i en ml av humant serum for å frembringe et detekterbart signal på en microarray ved hjelp av fluorescens eller elektrokjemisk deteksjon. På det enkleste nivået, har denne studien vist at serum mirnas er oppregulert hos kreftpasienter i forhold til normale donorer. I en sammenligning av trinn 3 og 4 prostatakreft sera og normal donor serum miRNA nivåer, fant vi at 15 mirnas (MIR-16, -92a, -103, -107, -197, -34b, -328, -485-3p , -486-5p, -92b, -574-3p, -636, -640, -766, -885-5p) var oppregulert i serum fra pasienter med prostatakreft sammenlignet med normal donor sera.
varme~~POS=TRUNC kart~~POS=HEADCOMP og klynge analyser viser at serum miRNA signaturer kan også brukes til å separere kreftpasienter og normale donorer i de fleste tilfeller. Sekstifem mirnas (se figur 6) ble brukt i en Heat Map analyse som isolert 21 kreftprøver, pluss 3 re-analysert prøvene, fra normale prøver. Seksten kreftprøver klynget sammen, mens fem kreftprøver dannet en egen klynge innenfor det normale utvalget klyngen. Klyngeanalyse (se figur 5) ble også brukt til å skille 21 cancerprøver fra 12 normale prøver. Tre kreftprøver som ble re-analysert etter fryse-tining og lagring, også gruppert med kreftprøver
Vi har også vist at serum mirnas kan oppdages på et nivå tilsvarende det som er rapportert for TaqMan PCR fra serum, omtrent 4000 kopier pr ul [7], og at analysen er stabil for gjentatt sample testing etter lagring. Den relative følsomhet av miRNA mikromatriser enn vanlige ekspresjonssystemer matriser kan være grunn til hybridiserings- kinetikken til små oligonukleotider. Små molekyler har en tendens til å ha bedre hybridiseringsbetingelser kinetikk enn større RNA eller DNA-molekyler. Faktisk, de fleste av de termodynamiske modeller for å forutsi DNA hybridisering atferd utviklet ved hjelp av korte oligonukleotider [43]. Mange av konklusjonene fra slike studier gjelder ikke når større molekyler brukes som sekundær struktur, ikke-spesifikk binding, og diverse andre uforutsette effekter forstyrre spådd hybridisering atferd. For mirnas, både deres beskyttelse mot nedbrytning av forskjellige cellulære faktorer, og deres lille størrelse bidrar til deres deteksjon i serum ved hjelp av mikromatriser på nivåer som er så lave som de sett med metoder som ellers ville bli betraktet mer følsom, så som RT-PCR. Følsomheten av microarray plattform som brukes her har tillatt oss å overvåke miRNA fra et lite volum av serum og klassifisere sera som enten fra normale donorer eller fra kreftpasienter.
Våre resultater, generelt, er enig i mange tilfeller med tidligere publiserte studier.
