Abstract
Til tross for androgen deprivasjon terapi (ADT), vedvarende androgen reseptor (AR) signale gjør utvekst av kastrering resistent prostatakreft (CRPC). I prostatakreft (PCA) celler, kan ADT forbedre AR aktivitet gjennom induksjon av oksidativt stress. Heri vi undersøkt rollene til Nrf1 og Nrf2, transkripsjonsfaktorer som regulerer antioksidant genekspresjon, på hormon-mediert AR trans bruker en syngene
in vitro
modell av androgen avhengige (LNCaP) og kastrering resistente (C4-2B ) PCA celler. Dihydrotestosteron (DHT) stimulerte transaktivering av androgen responselementet (ER) ble signifikant større i C4-2B celler enn i LNCaP-celler. DHT-indusert transaktivering AR ble koblet med høyere nukleær translokasjon av p65-Nrf1 i C4-2B celler, sammenlignet med LNCaP-celler. Motsatt DHT stimulering trykt totale Nrf2 nivåer i C4-2B celler, men høyere totale Nrf2 nivåer i LNCaP celler. Interessant, siRNA mediert stanse av Nrf1 dempes AR trans mens p65-Nrf1 overekspresjon forbedret AR trans. Senere studier viste at Nrf1 fysisk samhandler med AR og forbedrer AR DNA-bindende aktivitet, noe som tyder på at p65-Nrf1 isoform er en potensiell AR coactivator. I kontrast, Nrf2 trykt AR-mediert trans ved å stimulere den kjernefysiske opphopning av P120-Nrf1 som undertrykkes AR trans. Kvantitativ RT-PCR studiene videre validert de induktive effektene av p65-Nrf1 isoform på androgen regulert gener, Ptil og TMPRSS2. Derfor våre funn implisere differensial roller Nrf1 og Nrf2 i regulering AR trans i PCA celler. Våre funn indikerer også at DHT-stimulert økning i p65-Nrf1 og samtidig undertrykkelse av både Nrf2 og P120-Nrf1 slutt letter AR trans i CRPC celler
Citation. Schultz MA, Hagan SS, Datta A, Zhang Y, Freeman ML, Sikka SC, et al. (2014) Nrf1 og Nrf2 transkripsjonsfaktorer Regulering androgen Receptor trans i prostata kreft celler. PLoS ONE 9 (1): e87204. doi: 10,1371 /journal.pone.0087204
Redaktør: Jean-Marc VANACKER, Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, Frankrike
mottatt: 19 februar 2013; Godkjent: 26 desember 2013; Publisert: 22 januar 2014
Copyright: © 2014 Schultz et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse studiene ble støttet av midler fra det amerikanske forsvarsdepartementet; PC080811 (D. M.), PC081598 (AA), og National Institute of Health, T32-CA093240 (MF), og fra Louisiana Cancer Research Consortium (DM). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er den andre. ledende årsak til kreft dødsfall i amerikanske menn [1] og forhøyede androgen reseptor (AR) signale forenkler PCa vekst. Derfor androgen deprivasjon terapi (ADT) er designet for å utarme systemiske androgen nivåer og dermed undertrykke AR signalisering i hormonavhengig PCA celler [2]. Men pasienter kun svare på ADT for ca 18 måneder på grunn av valget og utvekst av kastrering resistent prostatakreft (CRPC) celler. Interessant, CRPC celler beholde både AR uttrykk og funksjon [2], [3]. Derfor vil forstå mekanismene for vedvarende AR funksjon i CRPC celler til tross for ADT hjelpe til i utviklingen av terapeutiske strategier som undertrykker PCa tilbakefall.
Det er blitt foreslått at gjenværende androgen produksjon innenfor svulsten mikromiljøet bidrar til vedvarende AR signale [3- ]. Dihydrotestosteron (DHT) er en potent androgen som stimulerer AR mediert trans på androgen respons element (ER), til stede på arrangører av mange gener viktige ved PCA cellevekst [4]. Interessant er den klassiske reaksjonsveien AR trans ofte forbigått i CRPC cellene der vedvarende AR funksjon inntreffer til tross for lave androgennivåer [5], [6]. Dette AR trans i CRPC celler har blitt tilskrevet økt AR uttrykk og forbedret uttrykk for enzymer som omdanner androgener til DHT [3], [7]. Men nyere bevis tyder også på at parallelle signalveier som øker ekspresjon og aktivitet av AR coactivators kan spille en betydelig rolle i regulering av AR-aktivitet [3], [8]. Noen av disse AR coactivators kan endre konformasjonen av AR ligand bindingslommen, og dermed øke bindingen spesifisiteten av AR til steroid ligander. Alternativt kan AR omgås ulike kofaktorer og anstand som letter sin kjernefysiske lokalisering og er bindende kapasitet [9]. Derfor vil identifiseringen av AR kofaktorer forbedre vår forståelse av PCa progresjon til CRPC.
Studier har vist at ADT kan indusere oksidativt stress og reaktive oksygenforbindelser (ROS) spiller en betydelig rolle ved PCA progresjon til kastrering motstand [ ,,,0],10]. Kronisk oksidativt stress har blitt observert i aggressive PCA-celler og rapporter har vist at disse cellene kan utnytte ROS-induserte proteiner som antioksidant for å øke overlevelsen og opprettholde AR signale [6], [11] – [13]. Faktisk er mange effektorer av ROS signalanlegg som fungerer som AR coactivators overexpressed ved PCA og deres uttrykk kan reguleres ved hormonsignalering [14] – [16]. Antioksydant-protein peroxiredoxin-1 (prx-1) virker som en anstand for å forbedre hormon signalering og androgen følsomhet ved direkte interaksjon med AR, som forsterker dets nukleære lokaliserings [14], [15]. Videre kan avbrudd av androgen-signalering (det vil si ADT) i prostata indusere oksidativt stress ved å øke ekspresjonen av ROS produserende NADPH oksidase (NOX) [16], [17]. Disse endringene i ROS påvirke aktiviteten av transkripsjonsfaktorer slik som Nrf1 og Nrf2 (NF-E2 relatert faktor 1 og 2) at den regulerer ekspresjonen av mange antioksidant proteiner og NADPH oksidase [18] – [20]. De resulterende forandringer i NOX og antioksidant protein ekspresjon kan være forbundet med øket overlevelse tumor [21] – [23]. Men selv om både Nrf1 og Nrf2 ha betydelige effekter på oksidativt stress signale, deres direkte effekter på AR trans har ikke tidligere blitt undersøkt.
Nrf1 og Nrf2 er master regulatorer av oksidativt stress indusert genekspresjon [18], [ ,,,0],24] – [26]. De er cap-n-kragebasis leucin zipper (CNC-bzip) transkripsjonsfaktorer som, i respons til ulike former for oksidativt stress, kan regulere genekspresjon via elektrofil, responselementet (EpRE). Under normale homeostatiske redoks forhold, Nrf2 sekvestrert av Keap1 (Kelch lignende ECH-assosiert protein 1) i cytoplasma hvor det negativt regulerer Nrf2 via ubikvitin-mediert degradering proteasomal [26]. Ved ROS stimulering, utgivelser Keap1 Nrf2 å tillate sine kjernefysiske lokalisering og trans via EpRE sekvenser. Men selv om mye oppmerksomhet har vært fokusert på rollen Nrf2 i kreft [25], undersøkelser på rollen Nrf1 har vært svært mangelfull.
I motsetning til Nrf2, den N-terminale domenet (NTD) av Nrf1 (TCF11), som forankrer Nrf1 til det endoplasmatiske retikulum (ER) membran og den nukleære membranen, regulerer Nrf1 aktivering og dens translokasjon til kjernen [27] – [29]. Videre kan det humane genet Nrf1 generere både i full lengde 120 kDa Nrf1 (P120-Nrf1) og flere avkortede (36, 55, 65 og 95 kDa) isoformer av Nrf1 [30], [31]. Av disse mindre Nrf1 isoformer, har den N-terminale-avkortet 65 kDa isoform (p65-Nrf1) vist seg å ha betydelige regulatoriske effekter med hensyn til Nrf2 mediert transkripsjon. Interessant, kan håndheves uttrykk for p65-Nrf1 hemme Nrf2 mediert induksjon av EpRE-regulerte gener [30]. Studier har også indikert at både Nrf1 og Nrf2 mediere ROS signale [18], [30]. Således kan ROS signalering og cellulær homeostase skje via regulering av en kritisk balanse mellom Nrf1 og Nrf2 ekspresjon og aktivitet. Imidlertid har deres rolle i AR trans i PCA cellene ikke undersøkt
Flere studier har implisert betydningen av Nrf2 ved PCA [32] -. [34]. Uttrykket av Nrf2 er negativt korrelert med Gleason score i PCA pasienter [32] og reduserte nivåer av Nrf2 har vært knyttet til økt aggressivitet i TRAMP PCa mus modell [33], [34]. Interessant nok har det også blitt foreslått at Nrf1 kan regulere Nrf2 uttrykk gjennom regulering av en EpRE lokalisert i den Nrf2 promoter-regionen [35]. Men til tross for muligheten for Nrf1 å undertrykke Nrf2 mediert transkripsjon [30], er rollen til Nrf1 ved PCA progresjon ukjent. Våre tidligere undersøkelser har vist at den CRPC cellelinjen C4-2B har forhøyet ekspresjon av p65-Nrf1 og redusert ekspresjon av Nrf2, sammenlignet med androgenavhengige LNCaP-celler og ikke-tumorigen RWPE-1 og RWPE-2-celler [36] . Siden både forbedret AR signalering og androgen deprivasjon kan indusere ROS uttrykk, postulerte vi at Nrf1 og Nrf2 kan spille en direkte rolle i regulering AR signalisering i PCA celler [3], [10]. Derfor undersøkte vi om Nrf1 og Nrf2 forskjellig modulere AR trans i androgen avhengige LNCaP celler og i sin androgen uavhengig sub-line, C4-2B.
Siden LNCaP og C4-2B celler er syngene PCA linjer, våre funn i disse cellelinjene indikerer at Nrf1 og Nrf2 kan ha viktige roller ved PCA progresjon gjennom manifestasjon av CRPC fenotype. Våre funn viste tydelig at de motsatte funksjonene Nrf2 og p65 og P120 isoformer av Nrf1 kan regulere DHT-indusert AR trans i PCA celler. Våre studier videre implisere nye mekanismer via hvor Nrf1 og Nrf2 regulering er endret i kastrering motstandsdyktig C4-2B cellelinje for å lette den forbedrede AR trans.
Materialer og metoder
Cell Culture
LNCaP-celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC; Catalog # CRL-1740). Den C4-2B cellelinje er en beinmetastatisk underlinjen stammer fra LNCaP, og var en slags gave fra Dr. Lelund Chung [37]. Begge cellelinjene ble dyrket i RPMI-1640 medium fra Mediatech (Manassas, VA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) fra Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA) og 1% penicillin /streptomycin (Mediatech). DHT behandlinger ble utført i fenol rødt fri RPMI media (Mediatech) med 10% trekull strippet føtalt bovint serum (CS-FBS) fra Innovative Research Labs (Novi, Michigan). Cellene ble trypsinert, belagt og lov til å feste natten i fullstendig media, etter som media ble endret til CS-FBS inneholder RPMI. Etter inkubasjon over natten i CS-FBS inneholder media ble cellene eksponert for DHT (0-10 nM) i CS-FBS media og høstet på angitte tider for å måle RNA, protein, og reporter genuttrykk.
Reagenser
DHT ble hentet fra Steraloids (Wilton, VA). Nrf1 antistoff ble hentet fra Proteintech Group (Chicago, IL). Antistoffer mot Nrf2, AR, og TATA bindende protein (TBP) ble oppnådd fra Abcam (Cambridge, MA). Isotype IgG (ikke-spesifikk kontroll) og alle sekundære anti-humane antistoffer ble oppnådd fra Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Anti-V5-antistoff ble oppnådd fra Invitrogen (Carlsbad, CA). AR-antistoff som brukes for chip-analyser ble oppnådd fra Active motiv (Carlsbad, CA). Den Nrf1 spesifikke siRNA og uspesifikke kontroll (NC1) siRNA ble hentet fra Integrerte DNA Technologies (Coralville, IA,. Cat # HSC.RNAI N003204.12.1-3). Plasmider ble oppnådd fra følgende kilder: p65-Nrf1 ekspresjonsvektor (p65-Nrf1-V5His) var en gave fra Dr. elskverdig Chan [30], den P120-Nrf1-V5His ekspresjonsvektor ble oppnådd fra Dr. Zhang [38] og den psPSA-Luc reporter (ildflue luciferase) vektoren ble hentet fra Dr. Abdel-Mageed laboratorium [39]. PRL-TK (Renilla luciferase) vektoren ble kjøpt fra Promega (Madison, WI). Den Nrf2 ekspresjonsvektor (pCMV6-Nrf2) ble kjøpt fra Origene (Rockville, MD) og pcDNA3.1 kontroll vektor ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, California).
Kvantitativ RT-PCR
etter behandling, ble mRNA isolert ved anvendelse av Trizol reagens i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen). CDNA ble fremstilt ved High Capacity Reverse Transcription Kit fra Applied Biosystems (Foster City, California). RT-PCR-primere ble syntetisert på Midland Certified Reagens Company (Midland, Texas) og SYBR Grønn Master Mix ble kjøpt fra Applied Biosystems (Foster City, CA). De følgende primer-sekvenser ble anvendt for kvantitativ RT-PCR:
AR
: 5′-GGTGAGCAGAGTGCCCTATC-3 «og 5′-GAAGACCTTGCAGCTTCCAC-3»;
GAPDH
: 5′-TCCCATCACCATCTTCCA-3 «og 5′-CATCACGCCACAGTTTCC-3»;
PSA:
5′-AGGCCTTCCCTGTACACCAA-3 «og 5′-GTCTTGGCCTGGTCATTTCC-3»; og
TMPRSS2
:5′-GTCCCCACTGTCTACGAGGT-3 «og 5′-CAGACGACGGGGTTGGAAG-3». Brett endringer i genuttrykk ble beregnet etter normalisering til de tilsvarende GAPDH mRNA nivåer.
Nuclear Protein Extraction
Nuclear pellets for westernfilmer ble isolert ved hjelp av CER-I og CER-II utvinning buffere fra NE-PER Nuclear Extraction kit (Pierce, Rockford, IL). Kjerner ble vasket med HBSS og kjerneprotein ble ekstrahert med en tilpasset kjerneprotein lyseringsbuffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM NaCl, 1% NP-40, 1% natrium-deoksycholat, 0,1% SDS, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), og 1 mM EDTA]. Nuclear protein ble kvantifisert ved hjelp av BCA protein estimering kit fra Thermo Scientific (Rockford, IL).
Immunoblotting
Proteinprøver ble kokt i 01:01 volum av protein og lasting buffer [100 mM Tris (pH 6,8), 25% glycerol, 2% SDS, 0,01% bromfenolblått, 10% 2-merkaptoetanol] i fem minutter. Nukleære proteiner (20-50 ug) ble underkastet elektroforese på Tris-HCl-PAGE-geler og våt overført til nitrocellulosemembraner. Etter blokkering med 5% melk i TBST-buffer (TBS med 0,05% Tween-20), ble membraner hybridisert med de angitte antistoffer. Band ble da påvist ved hjelp av Lumiglo kjemiluminescenssubstrat system (KPL, Gaithersburg, MD). Band intensiteter ble kvantifisert med bilde-J programvare (NIH) og verdier ble normalisert til TBP protein nivåer i sine respektive prøvene.
Transient Transfeksjon og luciferase Analyser
Celler ble sådd i 6-brønners plater natten før transfeksjon med Lipofectamine-2000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, California) og de angitte vektorer. For luciferase-analyser, ble celler transfektert med enten psPSA-
luc
reporter plasmid alene eller i kombinasjon med like mengder av Nrf1 ekspresjonsvektor (p65-Nrf1-V5-His eller P120-Nrf1-V5-His), eller Nrf2 ekspresjonsvektor (pCMV6-Nrf2), eller et kontroll ekspresjonsvektor (pcDNA3.1). Å normalisere for transfeksjon effektivitet, ble cellene også transfektert med PRL-TK (Renilla luciferase) vektoren. Vestlige studier ble også utført med de angitte ekspresjonsvektorer alene. I korte trekk ble celler inkubert over natten i transfeksjon oppløsning (20 ul Lipofektamin, 400 ng luciferase vektor og /eller ekspresjonsvektor, og 100 ng PRL-TK) i 2 ml serum /fenol rød fri medier. Etter inkubering over natten, ble mediet fjernet, og cellene ble utsatt for DHT (0, 1 eller 10 nM) i 24 timer i CS-FBS inneholdende fenol rød fri RPMI. Celleekstrakter ble høstet og luciferase-nivåer ble bestemt ved anvendelse av den doble luciferase reporter Assay kit (Promega, Madison, WI). I hvert eksperiment, ildflue luciferase-verdier (fra psPSA-luc) ble normalisert til Renilla luciferase-verdier (fra PRL-TK). Kjerneprotein ble ekstrahert etter behandling og evaluert ved western for forandringer i atom proteinekspresjon. I parallelle forsøk ble celler også transfektert med Nrf1 og Nrf2 ekspresjonsvektorer alene for å overvåke DHT-indusert ekspresjon av to gener regulert AR, PSA (prostataspesifikt antigen) og TMPRSS2 (transmembrane protease, serin 2).
siRNA Transfeksjon
Kort interfering RNA (siRNA) transfections ble utført med Transfast reagens fra Promega (Madison, WI). I korthet ble cellene inkubert over natten (~18 timer) i transfeksjon løsning som besto av Transfast reagens (2:01 fortynning), og 20 nM av enten Nrf1 siRNA eller NC1 (kontroll) siRNA i serum og fenol rød fri RPMI. For plasmid cotransfections ble celler samtidig transfektert med både siRNA og plasmidet i en 2:01 fortynning av Transfast reagens, som beskrevet i luciferase-assay-delen. Etter over natten transfeksjon, ble mediene fjernet og cellene ble utsatt for de angitte behandlinger. Cellene ble deretter høstet etter 24 timer og luciferase-analyser ble utført. I parallelle prøver, ble RNA og kjernefysisk protein oppnådd å overvåke genuttrykk ved QRT-PCR og ved western.
Immunpresipitasjon
For co-immunoprecipitation og immunoblotting (co-IP /IB) studier, LnCap og C4-2B celler ble behandlet med 0, 1, eller 10 nM DHT i 6 timer. Nukleære pellets ble isolert ved anvendelse av en kjernefysisk isolasjonsbuffer (10 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM MgCl
2, 100 mM EDTA, 500 uM DTT, 0,625% NP-40, protease-inhibitor, og fosfatase-inhibitorer). Etter vasking i PBS to ganger med RIPA-buffer (150 mM NaCl, 10 mM Tris (pH 8,0), 5 mM EDTA, 1% deoksycholat, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, protease-inhibitor, og fosfatase-inhibitorer) ble tilsatt til kjernefysiske pellets og pellets ble ultralydbehandlet for å isolere kjernefysisk protein. Protein ble pre-klarert for 30 minutter med protein-G /protein-A agaroseperler (Calbiochem katt # IP10). AR-antistoff (Abcam; ab74272) ble deretter tilsatt til 100 mikrogram av kjerneprotein i 400 ul RIPA lysebuffer og inkubert ved 4 ° C over natten. Protein-G /protein-A-agarose perler ble deretter tilsatt til protein og inkubert i 2 timer. Etter inkubering ble kulene vasket 3 ganger i RIPA-lyseringsbuffer og lasting fargestoff ble tilsatt til prøven. Prøvene ble deretter kokt i 5 minutter ved 95 ° C, lastet på gelen, og immunoblottet (IB) med de angitte antistoffer.
Chromatin Immunpresipitasjon
For kromatin immunoutfellingsstudier (chip) analyser har vi brukt to forskjellige pakker, den Covaris (Woburn, MA) truChIP kromatin klipping kit med ikke-ionisk buffer og Active Motif (Carlsbad, California) ChIP-IT Høy følsomhet kit. Analysene ble utført i henhold til produsentens protokoller, med mindre modifikasjoner. Kort, DHT behandlet (6 timer) LNCaP og C4-2B celler ble skåret med Covaris truChIP kit bruker en E220 fokusert-ultrasonicator fra Covaris. De kromatin Prøvene ble fortynnet i ChIP buffer fra Active Motif kit. Prøvene ble deretter immunutfelt (IP) med enten Nrf1 antistoff (Proteintech gruppe) eller AR-antistoff (Active Motiv). Resten av analysen ble utført i henhold til de aktive Motiv kit instruksjoner. Er spesifikke QRT-PCR ble utført på IP-DNA ved anvendelse av primere for ARE-II-sekvenser som befinner seg i PSA-promoter (5′-CCACAAGATCTTTTT ATGATGACAG-3 «og 5′-GCTCATGGAGACTTCATCTAG-3»). Endringer i forsterket bandet intensiteter ble kvantifisert.
Elektro Mobility Shift Analyser
2
nd generasjon DIG Gel Shift kit fra Roche (Branford, CT) ble brukt for EMSA studier. Androgen respons element (ER) og TCF11 og TCF11 /MafG (Nrf1 bindende) sekvenser [29] ble syntetisert fra Midland Certified reagens selskap. Sekvensene for hver EMSA oligonukleotid er som følger:
TCF11
:5′-GTCATTT-3 «og 3′-AAATGAC-5»;
ER
: 5′-GATCCTTGCAGAACAGCAA GTGCTAGCTG-3 «og 3′-GAACGTCTTGTCGTTCACGATCGACCTAG-5»; og
TCF11
/
MafG
: 5′-CCCAAATGACAATGCGATTGA-3 «, 3′-TCAATCGCATTGTCATTTGGG-5» (Genomatix MatInspector). I korthet, ble kjerneprotein ekstrahert fra celler behandlet med DHT i 6 timer og bindingsreaksjoner med DIG-merket ER oligonukleotider ble utført. ER oligonukleotider ble inkubert med atom protein (10 ug) i 30 minutter, hvoretter prøveladningsbuffer ble tilsatt og prøver ble underkastet elektroforese på en 5% TBE-PAGE-gel (Bio-Rad, Hercules, CA). Prøvene ble deretter overført til en nylonmembran, inkubert med blokkeringsbuffer, utsettes for et anti-DIG-antistoff, vasket og utviklet ved bruk av ECL-kjemiluminescens-systemet, som beskrevet tidligere. For konkurrerende studier, nukleære ekstrakter ble pre-inkubert med overskudd av (50-ganger) umerkede ER, TCF11, eller TCF11 /MafG oligoer i 30 minutter før den DIG-merkede ER oligonukleotidene ble tilsatt til reaksjonsblandingen. For eksperimenter ved anvendelse av antistoffer, for å konkurrere for binding Nrf1, nukleære ekstrakter ble pre-inkubert med enten Nrf1 antistoff eller med kanin IgG (ikke-spesifikk kontroll) i 30 minutter før DIG-merkede ER oligonukleotidene ble tilsatt til reaksjonsblandingen. Elektroforese, overføring og hybridisering ble utført som beskrevet ovenfor.
Statistical Analysis
Hver behandlingstilstand besto av 2-4 replikater og hvert eksperiment ble utført 2-5 ganger. Relativ ekspresjon ble bestemt ved å sammenligne behandlingsverdier til kontrollverdiene etter normalisering til lasting kontroller. Statistisk signifikans ble evaluert ved to-veis ANOVA ved bruk av GraphPad Prism software. Vesentlige endringer fra kontrollene er angitt med p-verdier på. 0,05
Resultater
AR trans Nivåene er vesentlig høyere i C4-2B Cells enn i LNCaP celler
Å sammenligne DHT-indusert AR trans nivåer i LNCaP og C4-2B celler, gjennomførte vi luciferase analysene i psPSA-
luc
vektor transfekterte celler (fig. 1a). Vi observerte at AR trans var signifikant (p 0,001) høyere i C4-2B celler enn i LNCaP celler. Etter DHT behandling, LNCaP-celler viser en doseavhengig økning i AR transaktivering (5 ganger ved 1 nM og 21 ganger ved 10 nM). I motsetning til dette, i C4-2B-celler, ble en 100 gangers økning observert selv ved 1 nM DHT (p 0,001) og en mer enn 130-ganger økning (p 0,001). Ble observert etter eksponering for 10 nM DHT (fig 1A ). Vi har også gjennomført immunoblotting studier for å bestemme atom AR nivåer under både ustimulerte og DHT-stimulert forhold (Fig. 1B). I begge cellelinjene, ble en 2-5 ganger økning i kjernefysiske AR nivåer sett etter 24 timer DHT-stimulering. Til tross for at lignende atom AR nivåer etter DHT behandling, C4-2B celler viste signifikant høyere AR trans nivåer i forhold til LNCaP celler. Dette indikerte at ytterligere mekanismer som potensierer DHT-stimulert AR transaktivering er til stede i C4-2B cellene.
(A). Cellene ble transfektert med psPSA-
Luc Hotell og PRL-TK (internkontroll). Effekten av 24 timers stimulering med enten en eller nM 10 nM DHT på gangers endring i luciferase-aktivitet (ildflue /Renilla RLU) er vist (n = 3). DHT-indusert transaktivering AR er signifikant (***; p 0,001) høyere i C4-2B celler sammenlignet med LNCaP-celler. (B). DHT-indusert AR kjernefysiske lokalisering i LNCaP og C4-2B celler. Etter 24 timer med DHT (0, 1 og 10 nM) stimulering (n = 4) western immunoblot viser endringer i AR atomnivå. Begge C4-2B og LNCaP celler viste tilsvarende nivåer av atom AR følgende DHT-stimulering. (C). p65-Nrf1 og Nrf2 nivåer etter DHT stimulering. Western immunoblots som viser atom p65-Nrf1 og Nrf2 nivåer etter 24 timers stimulering av DHT (n = 3). Forskjeller i atom p65-Nrf1 og Nrf2 ble observert i LNCaP og C4-2B celler. Brett endringer og ± SEM verdiene representerer relative forskjeller i uttrykket av AR, p65-Nrf1, og Nrf2. I begge (B) og (C), data ble normalisert til TBP nivåer i hver prøve.
DHT mediert Regulering av p65-Nrf1 og Nrf2 Nuclear Localization
Vi først bestemt om DHT behandling endrer Nrf1 og Nrf2 kjernefysiske lokalisering (fig. 1C). Atom nivåer av p65-Nrf1 ble ulikt berørt i LNCaP og C4-2B celler. I C4-2B celler, DHT stimulering økt kjernekraft p65-Nrf1 nivåer, mens i LNCaP celler DHT-stimulering ikke signifikant endre atom p65-Nrf1 nivåer. Imidlertid Nrf2 nukleære lokaliserings ble ikke vesentlig endret av DHT behandling i enten LNCaP eller C4-2B celler (fig. 1C). Derfor undersøkte vi muligheten av p65-Nrf1 og Nrf2 å regulere AR trans i begge PCA cellelinjer.
Modulation av p65-Nrf1 Expression vesentlig endret DHT-indusert AR trans
Vi undersøkte om ektopiske endringer i Nrf1 nivåer kan påvirke AR transaktivering i DHT-stimulerte LnCap og C4-2B celler (fig. 2). Siden atom p65-Nrf1 er konstitutivt høyere i C4-2B celler enn i LNCaP celler [36], brukte vi siRNA til taushet endogene Nrf1 nivåer i C4-2B celler (figur 2A og amp;. 2B) og en V5-His drevet p65- Nrf1 uttrykk vektor (p65Nrf1-V5-His) for å overuttrykke p65-Nrf1 i LNCaP celler (figur 2C . 2D). Nivåene av kjerne Nrf1 i siRNA transfekterte C4-2B celler og nivåene av V5-fusjonsproteiner i Nrf1 overuttrykt LNCaP-celler er vist i figurene 2B og 2D, respektivt. I C4-2B celler transfektert med psPSA-
luc
vektor, og med enten Nrf1 siRNA eller NC1 kontroll siRNA, luciferase analysene viste at Nrf1 undertrykkelse signifikant (p 0,001) reduserer AR trans (Fig 2A.). I LNCaP celler, luciferase analysene viste også at p65-Nrf1 overekspresjon forbedrer DHT-stimulert AR aktivitet ved ca 2 ganger på 1 nM DHT og med ca 4,4 ganger på 10 nM DHT (p 0,001) (figur 2C.). Disse funnene antydet at p65-Nrf1 forbedrer AR trans AR trans i begge PCA cellelinjer.
(A) Effekt av Nrf1 knockdown på AR trans i DHT-stimulerte C4-2B celler. Celler ble ko-transfektert med psPSA-luc vektor og med enten Nrf1 siRNA eller tak siRNA (NC1). Brett endringer i luciferase aktivitet (Firefly /Renilla RLU) etter Nrf1 knockdown vises (n = 3; p 0,01). (B) Kjernefysiske P65-Nrf1 protein nivåer etter siRNA mediert knockdown i C4-2B celler (n = 2). Data ble normalisert til TBP nivåer. (C) Effekt av p65-Nrf1 overekspresjon på DHT-indusert AR trans i LNCaP celler. Celler ble ko-transfektert med psPSA-luc vektor og med enten kontroll-vektor (pcDNA3.1) eller p65-Nrf1 ekspresjonsvektor (p65-Nrf1-V5-His). Fold endring i luciferase aktivitet etter Nrf1 overekspresjon vises (n = 3; p 0,001). (D) Endringer i atom V5 protein (tag) i pcDNA3.1 (kontroll) eller p65-Nrf1-V5-His transfekterte LNCaP celler (n = 2). Brett endringene representerer relative (V5 /TBP) forskjeller i Nrf1.
I parallelle studier, vi også målt uttrykk for to AR regulerte gener, Petroleumstilsynet og TMPRSS2, i celler transfektert med p65-Nrf1 uttrykk vektor (fig. S1-A og S1-B). Våre QRT-PCR data viste klart at p65-Nrf1 signifikant (p 0,01) øker både TMPRSS2 og PSA mRNA nivåer i DHT-behandlede LNCaP celler. Dette fungerte som et bekreftende bevis på at p65-Nrf1 er en potensiell AR coactivator.
Nrf2 Negativt Regulerer AR trans
Effektene av Nrf2 overekspresjon på AR trans ble overvåket i både LNCaP og C4-2B -celler (fig. 3). Nrf2 overekspresjon trykt DHT-stimulert AR aktivitet betydelig. (Fig. 3A) i LNCaP celler, Nrf2 overekspresjon trykt AR trans under både basal (50%; p 0,001) og DHT-stimulert forhold (60%; p 0,0001). Nrf2 overekspresjon også redusert DHT-indusert AR trans nivåer i C4-2B celler (figur 3B.) Med ca 33% ved 1 nM DHT og med 40% ved 10 nM DHT (p 0,05). Nuclear Nrf2 ekspresjon i transfekterte LNCaP og C4-2B celler er vist over hver behandlingsbetingelsene.
Virkningene av Nrf2 overekspresjon på DHT-stimulert AR-aktivitet ble overvåket i begge LNCaP (A) og C4-2B (B) celler. Celler ble transfektert med psPSA-luc reporter plasmid, og med enten Nrf2 ekspresjonsvektoren (pCMV-Nrf2) eller kontroll-vektor (pcDNA3.1) og stimulert med DHT (0-10 nM) i 24 timer (n = 5) . Signifikante forskjeller i luciferase aktivitet (Firefly /Renilla RLU) fra kontrollene er representert som *; p 0,05, ***; p 0,001 og ****; p 0,0001. I begge (A) og (B), paneler over baren grafene representerer endringer i atom Nrf2 nivåer etter transfeksjon med pCMV-Nrf2. I (C) og (D), effekter av Nrf2 overekspresjon på atom nivåer av AR i både ubehandlet og DHT (0, 1, 10 nM) ble behandlet LNCaP (C) og C4-2B (D) celler er vist. Data ble normalisert til atom TBP nivåer. Brett endringer og ± SEM-verdiene representerer forskjeller i atom AR nivåer sammenlignet med ubehandlede celler.
Deretter effekten av Nrf2 overekspresjon på atom AR-nivåene ble målt i begge LNCaP-celler (fig. 3C) og C4-2B celler (fig. 3D). Interessant, i DHT-behandlede LNCaP celler, Nrf2 overekspresjon redusert AR kjernefysiske lokalisering med nesten 79%. Men Nrf2 overekspresjon ikke vesentlig endre atom AR nivåer i DHT-behandlede C4-2B celler. Disse funnene tyder på at Nrf2 kan være en potent negativ regulator av DHT-indusert AR trans i begge PCA cellelinjer. Men i LNCaP-celler, men ikke i C4-2B celler, dette undertrykkende effekten kan formidles via undertrykkelse av AR nukleær lokalisering.
Endringer i Nrf1 og Nrf2 ikke Alter AR-genekspresjon eller AR nukleære lokaliserings
Vi har evaluert ved hvorvidt endringer i Nrf1 og Nrf2 overekspresjon påvirke AR genekspresjon og AR kjernefysiske lokalisering (fig. S2). QRT-PCR-studier viste at ingen av p65-Nrf1 overekspresjon i LNCaP-celler (fig. S2-A) eller p65-Nrf1 knockdown i C4-2B celler (fig. S2-B) er endret AR mRNA-nivåer, under enten basal eller DHT-stimulert forhold. Vestlige immuno-deteksjons- studier viste at DHT-indusert kjernefysiske lokalisering av AR var upåvirket av enten p65-Nrf1 overekspresjon (fig. S2-C) eller Nrf1 knockdown (fig. S2-D). Tilsvarende Nrf2 overekspresjon i DHT-behandlet LNCaP og C4-2B cellene hadde ingen betydelig innvirkning AR genekspresjon (Fig S2-E . S2-F). Dermed gjør Nrf1 ikke endre AR trans gjennom regulering av enten AR genekspresjon eller AR kjernefysiske lokalisering. Videre undertrykkende effekten av Nrf2 er ikke på grunn av endringer i AR genuttrykk.
Protein-protein interaksjoner mellom Nuclear Nrf1 og AR oppstå i både LNCaP og C4-2B Cells
For å finne ut om de Nrf1 proteiner (p65- og p120-) regulere AR funksjons via direkte interaksjon med atom AR protein, utførte vi AR immunoutfellinger (IP) fra atom ekstrakter av ubehandlede og DHT-behandlet LNCaP og C4-2B celler (fig. 4A). IP-proteiner ble så immunoblottet (IB) for enten p65-Nrf1 eller P120-Nrf1. De Co-IP /IB studier viste at både p65-Nrf1 og P120-Nrf1 forbinder med atom AR protein i både LNCaP og C4-2B celler. Men atom AR samhandlet med p65-Nrf1 på et mye høyere nivå enn det som er observert med P120-Nrf1. Faktisk, som vist i fig.
