Abstract
histondeacetylase hemmere (HDACi) representerer en lovende klasse av epigenetiske agenter med kreft egenskaper. Her rapporterer vi at (S) -2, en ny hydroksamat-baserte HDACi, tidligere vist å være effektiv mot akutt myeloid leukemi-celler, var også en potent induser av apoptose /differensiering i humane prostata LNCaP og PC3 kreftceller. I LNCaP-celler (S) -2 var i stand til å utløse H3 /H4 histon acetylering, fosforylering H2AX som en markør for DNA-skade og produsere G
0 /G
en cellesyklus-stans. Konsekvent, (S) -2 førte til økt ekspresjon av både protein- og mRNA-p21-nivåer i LNCaP-celler, men i motsetning til Saha, ikke i normale ikke-tumorigene prostata PNT1A celler. Mekanistiske undersøkelser har vist at (S) -2-indusert apoptose i LNCaP-celler som er utviklet gjennom spalting av pro-kaspase 9 og 3 og av poly (ADP-ribose) -polymerase ledsaget av den doseavhengige tap av mitokondriemembranpotensialet. Faktisk, tilsetningen av den felles kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK sterkt redusert medikament-mediert apoptose, mens den antioksidant
N
-acetyl-cystein var praktisk talt ineffektiv. Viktigere, foreløpige data med nakne mus xenopodet med LNCaP-celler viste at (S) -2 førte til en reduksjon i tumorvolumet og en økning i fosforylering H2AX innen kreftcellene. Videre er svært metastatisk prostatakreft PC3 celler var også følsom for (S) -2 at: i) indusert vekst arrest og moderat apoptose; ii) styrte celler mot differensiering og nøytralt lipid akkumulering; iii) redusert celle invasivitet potensialet ved å redusere mengden av MMP-9 aktivitet og opp-regulering av TIMP-1-ekspresjon; og iv) hemmet cellemotilitet og migrasjon gjennom Matrigel. Overall, (S) -2 har vist seg å være en kraftig HDACi evne til å indusere vekst arrest, celledød og /eller differensiering av LNCaP og PC3 prostata kreft celler, og på grunn av sin lave toksisitet og effekt
in vivo
kan også være av klinisk interesse å støtte konvensjonell prostatakreft terapi
Citation. Laurenzana A, Balliu M, Cellai C, Romanelli MN, Paoletti F (2013) Effektivitet av histondeacetylase Inhibitor (S) -2 mot LNCaP og PC3 menneskelige prostata kreft celler. PLoS ONE 8 (3): e58267. doi: 10,1371 /journal.pone.0058267
Redaktør: Chunhong Yan, Albany Medical College, USA
mottatt: 16 april 2012; Godkjent: 05.02.2013; Publisert: 04.03.2013
Copyright: © 2013 Laurenzana et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra MIUR (Kunnskapsdepartementet, universiteter og forsknings PRIN 2006 til FP, # 200606139), Universitetet i Firenze, Italia (ex 60% 2009 og 2010 til FP og MNR), Ente Cassa di Risparmio di Firenze 2007- 9 (Firenze, Italia; # 2007,1019 til FP) og Associazione Italiana contro le Leucemie, Linfomi e Mieloma (AIL) Sezione di Firenze til FP. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epigenetiske endringene er reversible kromatin rearrangements stand til å modulere genekspresjon i cellen uten å endre DNA-sekvens. Acetylering er den mest studerte post-translasjonell modifikasjon av histonproteinene [1] på grunn av den balanserte aktiviteten av to familier av enzymer, nemlig histon acetyltransferases (hatter) og histon deacetylases (HDACs) som katalyserer acetylering /deacetyleringen av histoner, respektivt og dermed endre kromatin konformasjon og DNA tilgjengelighet til transkripsjonsfaktorer [2], [3], [4]. Videre hatter og HDACs bidra til å modulere genekspresjon ved direkte interaksjon med nonhistone viktige regulatoriske proteiner [5] som p53, GATA1, GATA2, retinsyre reseptor, NF-kB og cytoskeletal proteiner som α-tubulin [6], [7], [8]. Det er ikke overraskende derfor at avvikende aktivitetene til disse enzymene kan undertrykke transkripsjon av spesifikke onko-suppressor gener og bly, til slutt, til tumordannelse [9], [10]. Og faktisk histon hypoacetylation, på grunn av over-ekspresjon av HDACs, har en anerkjent rolle i tumorgenese av forskjellige krefttyper som påvirker mage [11], tykktarm [12], [13], bryst [14] og prostata [15], [ ,,,0],16], [17].
med særlig hensyn til prostatakreft, er dette den mest vanlige diagnosen non-kutan malignitet og den tredje største årsaken til kreft dødsfall hos menn i den vestlige verden. Selv om en rekke terapeutiske alternativer er tilgjengelige for tidlig prostatakreft hos pasienter tilbakefall fra primærbehandling med kirurgi og /eller stråling, eller presentere metastatisk sykdom, forblir androgen deprivasjon bærebjelken i terapi. Men til tross for androgen ablasjon, praktisk talt alle tumorer eventuelt videre med kastrerings-resistente sykdommer, [18], [19], [20], som må behandles med konvensjonelle cytostatika eller epigenetiske midler slik som HDAC-inhibitorer (HDACi). Sistnevnte har dukket opp som en ny klasse av kraftige anticancermidler som er i stand til å indusere tumorcellevekstarrest, differensiering og /eller apoptose [16], [17]
in vitro
og opptre som bestrålingssensibilisatorer i kreftceller ved ned regulerende DNA-reparasjon aktivitet [21], [22], [23]. Noen av disse HDACi viste imidlertid flere begrensninger
in vivo
grunn av deres høye toksisitet, lav oppløselighet, og kort halveringstid [24], [25]. Derfor er utvikling av nye HDACi med kreft egenskaper og lav-toksiske profiler er et viktig mål for translasjonell forskning.
Vi har tidligere rapportert et nytt sett med potent hydroksamat-baserte HDACi kjennetegnet ved en 1,4-benzodiazepin ring ( BDZ) anvendt som hetten og forbundet, gjennom en trippelbinding koplingsenhet, til en lineær alkylkjede bærer en hydroksamsyre funksjon som Zn
++ – chelaterende gruppe [26]. Blant disse hybrider, en spesielt, MC133 (S) -2 [nå av (S)
–
2] viste å være en svært effektiv pro-apoptotiske middel mot annerledes kultivert og primær akutt myelogen leukemi (AML) celler
in vitro Hotell og
ex vivo
, og var nesten sikker på mus
in vivo
opp til 150 mg /kg /uke [27].
i den foreliggende studien undersøkte vi antitumor potensialet av (S) -2 i to av de mest undersøkte humane epitel-prostatacancercellelinjer, nemlig den androgen-følsomme LNCaP og androgen-insensitive og høyt metastatisk PC3, ved hjelp av den menneskelige nontumorigenic PNT1A prostata epitelceller som kontroll. (S) -2 hemmet prostatakreft celleproliferasjon, induserte en større apoptotisk respons i forhold til Saha (eller Vorinostat, en av de beste resultater HDACi godkjent av FDA for behandling av kutant T-cellelymfom) [28], [29] i LNCaP celler og i mindre grad også i svært metastatiske PC3 celler hvis migrasjon og invasivitet egenskaper ble drastisk redusert med stoffet. I motsetning til dette, normalt epitel prostata PNT1A cellene var praktisk talt ufølsom medikament. Viktigere, (S) -2-indusert apoptose i LNCaP celler utviklet gjennom en caspase avhengig mekanisme.
Materialer og metoder
Cell Kultur og behandlinger
ikke-meta LNCaP og metastatisk PC3 prostata kreft celler, og de menneskelige nontumorigenic prostata epitelceller PNT1A celler var en slags gave P. Chiarugi (Dept. Biokjemiske Sciences, University of Florence) som fikk cellelinjer fra den europeiske Innsamling av cellekulturer [30]. Humane prostata-celler ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). Celler ble opprettholdt ved 37 ° C ° i 5% CO
2 fuktig atmosfære. (S) -2 og Saha (eller Vorinostat; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) [28], [29] ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO, Sigma-Aldrich) ved 0,1 M konsentrasjon og lagret i mørket ved romtemperatur (RT). Virkemedikamentløsninger ble oppnådd ved passende fortynning av stamløsningen med kulturmediet. DMSO ble anvendt som kjøretøyet til en endelig dose på ≤0.1% (v /v) i kultur for både (S) -2 og Saha. I caspase inhiberings-forsøkene Z-VAD-FMK (R PARP, γ-H2AX, H2AX, H3 og caspase 9 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA); α-tubulin og acetylert α-tubulin (Sigma-Aldrich), Caspase 3 og p21 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Egnede peroksidase-konjugert IgG-preparater (Sigma-Aldrich) har vært anvendt som sekundære antistoffer; ECL prosedyren ble benyttet for utvikling.
Kvantifisering av mitokondriemembranen potensial
For å avgjøre endringer i legemiddelindusert transmitokondriemembranen potensial (Δψm), cellene har blitt farget med JC-1 (Invitrogen , Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), en kationisk fargestoff som viser potensialet avhengige akkumulering i mitokondriene, angitt med en fluorescens utslipp skifte fra grønt (525 ± 10 nm) til rødt (610 ± 10 nm). LNCaP-celler (0,5 x 10
6) ble behandlet uten /med 2,5 og 5 um (S) -2 i 72 timer og deretter resuspendert i RPMI 1640 inneholdende 15 ug /ml JC-1 fargestoff i 30 minutter ved RT i mørket; etter at cellene ble vasket og fluorescensen ble målt ved flow-cytometri. Mitokondrier depolarisasjon er spesifikt indikert ved en reduksjon i den rød til grønn fluorescens intensitet forholdet [32].
Caspase 3 aktiveringstest
prostata kreftceller (10
5 celle /ml) var inkubert med 2,5 mM (S) -2 i 48 timer og deretter underkastet den karboksyfluorescein FLICA Apoptose Detection Kit Caspase-analyse (Caspase 3 FLICA, Immunochemistry Technology, Bloomington, MN, USA). Celler ble farget med FAM-DEVD-FMK FLICA reagens oppløst i PBS i en time ved 37 ° C, og vasket to ganger i PBS før utførelse av cytofluorimetric analysen.
Gel Zymografi
Analyse av gelatinase (MMP-9) aktivitet ble utført som tidligere beskrevet [33]. Kort sagt ble PC3-celler sådd ut i 6-brønns plater og behandlet med økende mengde av (S) -2 i serum-fritt medium i 24 timer. Aliquoter av kondisjonert medium (CM) ble blandet med 4 x (v /v) prøvebuffer (0,25 mol /l Tris-HCl, pH 6,8, 0,4% SDS, 40% glycerol og bromfenolblått) og deretter applisert på en 10% SDS gel inneholdende 1 mg /ml gelatin (Sigma-Aldrich) og kjørt under ikke-reduserende betingelser ved konstant spenning på 125 V. etter elektroforese ble gelen inkubert i renaturering av buffer (2,5% Triton X-100) ved romtemperatur i 30 min , vasket to ganger med destillert vann (10 min hver gang), og deretter inkubert med det fremkallende buffer (50 mmol /liter Tris pH 8,0, 5 mmol /l CaCl
2, 0,2 mol /l NaCl og 0,02% Brij-35 ) ved 37C ° over natten, beiset i 0,5% Coomassie Blå oppløsning i 2 timer og avfarget med en oppløsning [5% eddiksyre, 10% metanol (v /v) i destillert vann] inntil bånd av gelatinolytisk aktivitet ble visualisert og deretter målt ved densitometrisk analyse med bilde J Software.
sårhelende analysen
PC3 cellene ble dyrket i 6-cm plater inntil samløpet og monolaget ble skrapet med en fin steril pipette tips for å produsere en smal viklet i substratet. Mediet og debris ble sugd bort og erstattet med friskt medium i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av (S) -2. Bildene ble tatt før og 24 timer etter såret ved hjelp av et Nikon E 4500 kameraer (Nikon) på et Nikon TMS-F fase-kontrast mikroskop (Nikon Instruments, Firenze, Italia).
Invasivitet analysen
For disse forsøk ble anvendt Boyden kammere i hvilke de øvre og nedre brønnene ble separert ved Porus polykarbonatfiltere belagt med matrigel (50 ug /filter) (Becton Dickinson, BD, New Jersey, USA). Kulturer ble forbehandlet med /uten (S) -2 (2,5-5 uM) i 24 timer og deretter porsjoner av PC3-celler (20 x 10
3) ble overført i det øvre rom av kammeret. Celle invasiv evne ble undersøkt etter 6 timer, og uttrykt som absolutte tall ± SD av celler tilstede på filtrene; fem forskjellige mikroskopiske felt for hver tilstand er kontrollert.
Oil Red O Farging for nøytrale lipider
Nøytrale lipider ble oppdaget (i) histochemically [34] på cellemonolagene som ble raskt løst med? – 0 ° C metanol, farget med Oil Red O (ORO) (Sigma-Aldrich), og (ii) spektrofotometrisk (Cary 50 Scan, Varian, Victoria, Australia) ved 510 nm ved opptak absorbans av cellebundet ORO følgende utvinning med isopropanol [35], [36]. ORO akkumulering ble uttrykt som relativ absorbans enhet /mg celleprotein.
Kvantitativ Real Time PCR-analyse
QRT-PCR ble utført med omvendt transcripted cDNA av ubehandlet og behandlet celler med Applied Biosystems 7500HT systemet i henhold til standard protokoller. Brett av p21, MMP-9 og TIMP-1 induksjon ble beregnet ved endringer av p21 eller MMP-9 eller TIMP-1 Ct verdier i behandlede
versus
ubehandlede celler og var normalisert til 18S rRNA Ct Amplification var utført med standard PCR innstilling: 40 sykluser med 95 ° C i 15 sek, og av 60 ° C i 60 sekunder ved hjelp av en SYBR Green basert deteksjon (SYBR grønn Master mix; Applied Biosystems), og de følgende primere: for p21, videre 5 « -CTGCCCAAGCTCTACCTTCC-3 «? og revers 5′-CAGGTCCA CATGGTCTTCCT-3′; for MMP-9 forover 5»-GCTACCACCTCGAA CTTTGAC-3 «og 5′-revers TGCCGGATGCCATTCAC-3′; for TIMP-1, fremover 5»-CCAACAG TGTAGGTCTTGGTGAAG-3 «og 5′-revers CTGTGGCTCCCTGGAACA-3»; og for 18S rRNA, frem 5’CGGCTACCACATCCAAGGAA-3 «? og omvendt 5′-GCTGGAATTACCGCGGCT-3».
Preliminary
in vivo
Forsøk med en Murine Xenotransplantat Model
protokollen og resultater vedrørende denne foreløpige tilnærming til
in vivo
eksperiment har blitt rapportert under delen av saksdokumenter (figur S1).
Statistical Analysis
Studentenes
t
-test eller enveis variansanalyse ble benyttet for å vurdere statistisk signifikans av resultater. Forskjellen mellom de verdier som ble betraktet som signifikant på
P
≤ 0,05.
Resultater
(S) -2 Ber LNCaP celler til G
0 /G
en cellesyklus arrest og endringer i morfologi
LNCaP celler dyrket uten /med økende (S) -2-konsentrasjoner (1, 2,5 og 5 mm) opp til 72 timer, gjennomgikk en dose- og tidsavhengig vekststans for å nå 50% inhibering etter to dagers inkubering med 1-2,5 um (S) -2; mens i kulturer som ble behandlet med 5 uM antallet levedyktige celler betydelig redusert til nivåer godt under startpletteringstetthet (figur 1A). Effekten av (S) -2 på LNCaP cellesyklusprogresjon, målt ved strømningscytometri viste at en 24 h-eksponering til 2,5 uM medikament økt betydelig prosentandelen av celler i G
0 /G
1 (fra 59 til 93%) og reduserte cellepopulasjonen i S-fase (29-2%) (figur 1B, øverst). I addittion, etter behandling, den typiske morfologi av LNCaP-celler endret til en spindel-formet, forholdsvis forstørret fenotype, hvilket ga monolag som ble karakterisert ved en partiell celletap og reduserte kontakten mellom gjenværende celler (figur 1B, midten). Konsekvent, cellesyklus inhibitor p21 protein – rapportert å være opp-modulert ved hjelp av HDACi [37] – utvidet på en tidsavhengig måte i respons til 2,5 um (S) -2; proteinet ble påvist å starte fra 6 timer til behandling, øket etter 15 timer og nådde en topp på 24 timer (figur 1B, nederst)
(A) -. Celler (10
5) ble sådd ut i 6- brønners plater og fikk feste seg over natten. På den neste dag (S) -2 ble tilsatt ved de angitte konsentrasjoner (0-5 um) og levedyktige celler (trypan blu-negative) ble talt ved hjelp av et Burker kammer langs de følgende tre dager. (B, øverst) – (S) -2 indusert G
0 /G
en cellesyklus arrest og økt p21 uttrykk. LNCaP-celler (2 x 10
5) ble behandlet med 2,5 uM medikament i 24 timer, deretter ble løsnet og aliquoter av cellesuspensjoner ble inkubert med en propidiumjodid (PI) løsning i 30 minutter og deretter analysert ved flow-cytometri (DNA beløp, X-aksen, totalt hendelser, Y-aksen). Prosentandelen av celler i de forskjellige faser av cellesyklusen ble beregnet ved ModFit program og vist i hvert panel. (B, midten) – fasekontrast bilder av ledsager kulturer indikerte at (S) -2 induserte morfologiske endringer og en markert nedgang i celletetthet. (B, nederst) – Celler ble behandlet med 2,5 mikrometer stoff for de angitte tidspunkter og p21 protein nivåer ble overvåket av immunoblotting; GAPDH ble også undersøkt for å sikre lik lasting av prøver i hvert kjørefelt. (C) – LNCaP cellevekstarrest var ikke strengt er avhengig av den kontinuerlige tilstedeværelsen av narkotika. Celler har blitt sådd i 6-brønns plater (10
5 celle /brønn) og fikk feste seg over natten. Dagen etter ble kulturene tilsatt uten /med 2,5-5 pM (S) -2 for 3d og deretter erstattet med medikamentfritt medium for ytterligere 3d og sammenlignet med kulturer, hvor medikamentet ble jevnt opprettholdt opp til 6d når levedyktige celler ble tellet. Hver søyle representerer middelverdi oppnådd fra triplikatbrønner ± SD.
Videre er vekststans av LNCaP utsatt for (S) -2 ikke var strengt avhengig av den stadige tilstedeværelse av medikament. Denne antakelsen som stammer fra overvåkings celle nummer i kulturer som ble behandlet uten /med 2,5 eller 5 mM (S) -2 for 3d og deretter erstattet med medikamentfritt medium for ytterligere 3d, mens i følgekulturer medikamentet ble jevnt opprettholdt for 6d. Celler forble praktisk talt arrestert, selv etter at stoffet fritt medium erstatning hvilket ga verdier som var lik de kulturer kontinuerlig utsatt for stoffet (figur 1C).
(S) -2-indusert apoptose i LNCaP-celler Avhengig aktivering av caspase Cascade og Forstyrrelse av mitokondrie Integrity
Blant de tidlige HDACi-indusert hendelser på DNA-nivå var det dannelsen av dobbelttrådbrudd (DSB) og fosforylering av H2AX å gi γ-H2AX som hjelpemidler i DNA-skader reparasjon [38]. Responsen av LNCaP-celler til (S) -2 bestemt ved hjelp av immunfarging viste at 2,5 uM medikament betydelig økt γ-H2AX signal i løpet av 6 timer og disse nivå ble opprettholdt opp til forholdsvis 24 timer, ved å følge et mønster som ligner på den for narkotika indusert acetyl-H4 (figur 2A, øverst). Videre angrep av apoptose, som markert ved spaltning av caspase substratet poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), ble detektert fra 15 timer til behandling og økte jevnt opp til 48 timer (figur 2A, nederst) når omtrent 80% av LNCAP celler viste: (i) legemiddel-mediert aktivering av kaspase 3 (figur 2B) og (ii) doseavhengig forskyvning i JC-1 rød /grønn fluorescens-forholdet for å betegne en progressiv forsvinning av mitokondriell transmembranpotensialet (ΔΨm ) (figur 2C)
(A) -. Celler ble inkubert med legemiddel (2,5, 5 uM) for de angitte tidspunkter. Hel-celle-ekstrakter ble analysert ved Western-immunoblot å detektere: fosfo-H2AX, at den utløses etter DNA-skade; PARP og dens spaltet fragment å betegne apoptotisk activaction; og acetyl-H4 som på grunn av hemming av HDAC aktivitet. GAPDH og α-tubulin ble brukt som laste kontroller. (B) – Ubehandlet eller medikamentbehandlede celler (2,5 uM i 48 timer) ble inkubert i løpet av de siste 60 min med FAM-DEVD-FMK carboxyfluoresceine, deretter skylt to ganger med PBS og deres grønn fluorescens ble målt ved flow-cytometri. Frekvensen histogram over antall hendelser (Y-aksen)
versus
fluorescein intensitet (X-aksen) viste to topper: kaspase-negative celler (umerkede celler) ble på venstre side av den P2 region; mens kaspase-positive celler som var merket med Flica skjedde innenfor den P2 region. (C) – Behandling med (S) -2 førte til en doseavhengig mitokondriell transmembranpotensial (ΔΨ) spredning. Denne virkning ble vurdert ved hjelp av JC-1-fargestoff, som samler i normale mitokondrier og avgir rød fluorescens, men det kan ikke hope seg opp i mitokondriene som har mistet sin transmembranpotensialet, og avgir derfor en diffus cytoplasmatic grønt signal i døde celler. Mitokondriell depolarisasjon er indikert ved en reduksjon i den rød /grønn (R /G) fluorescensintensiteten forholdet [32]. Verdiene er normalisert ved hjelp av styresignalet (bare bæreren) som en vilkårlig verdi på 100%. Hver søyle er gjennomsnittet av to uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. (D) – LNCAP celler ble behandlet med (S) -2 (2,5-5 uM) eller med (S) -2 (5 mM) pluss 15 mM N-acetylcystein (NAC), anvendt i 2 timer før tilsetning medikament. Aktivering av apoptose ble avslørt av spalting av PARP og fosforylering av H2AX og disse hendelsene samt narkotika-mediert α-tubulin acetylering ble ikke i kontrast til NAC. GAPDH ble anvendt som referanseprotein. (E) – Z-VAD-FMK forhindret legemiddel-indusert spaltning av PARP og fosforylering av H2AX. LNCAP celler ble behandlet som ovenfor, men i stedet for NAC ble kulturene preinkubert med 30 pM Z-VAD-FMK i 2 timer forut for å bli behandlet i 24 timer med stoffet. Cellelysater ble analysert for spaltning av PARP, aktiveringen av caspase 3 og 9, H2AX fosforylering samt acetylering av H4 og α-tubulin; α-tubulin ble anvendt som kontroll lasting.
Videre, for å undersøke mekanismen av (S) -2-indusert apoptose i celler LNCAP, effekten av anti-oksidant N-acetyl-cystein ( NAC) og av den pan-caspase inhibitor Z-VAD-FMK ble undersøkt separat. En annen måte enn den som er rapportert for AML-celler [27], er tilstedeværelsen av 15 mM NAC i kulturmediet var ikke i stand til å avtagende medikament-indusert spaltning av PARP således utelukker en stor rolle av reaktive oksygenarter (ROS) i legemiddel-mediert apoptose (figur 2D). I stedet eksperimenter utført uten /med 30 uM pan-kaspaseinhibitor Z-VAD-FMK viste at denne forbindelse var i stand til å forebygge legemiddel-mediert aktivering av kaspase 9 og 3, så vel som av spaltingen av PARP og økning i γ-H2AX [ ,,,0],39], og dermed tyder på at (S) -2-indusert apoptose i LNCaP-celler utviklet gjennom et caspase-avhengig mekanisme (figur 2E). Det er verdt å merke seg at legemiddelindusert acetylering av H4 og α-tubulin ikke var hemmet av Z-VAD-FMK.
(S) -2 Targets LNCaP celler, men ikke Normale Prostata PNT1A Cells
Den potensielle verdi av (S) -2 ble vurdert ved å sammenlikne aktivitetene til både (S) -2 Saha, og med hensyn til induksjon av apoptose og histon acetylering på LNCaP-celler og normale prostata epitelceller immortaliserte PNT1A celler. (S) -2 førte til en markert økning i nivåene av spaltede PARP-fragment, γ-H2AX og acetyl-H3 i LNCaP-celler med mye større effektivitet enn Saha (figur 3A, venstre). Dessuten, (S) -2 syntes å være relativt trygt til normale celler PNT1A at i stedet, var et følsomt mål på Saha som avsløres ved spalting av PARP ved behandling med 5 uM medikament (figur 3A, til høyre), mens acetyl-H3 nivåer i PNT1A celler holdt seg relativt stabil uavhengig av enten indusere
(A) -. LNCAP og PNT1A celler ble inkubert i 24 timer med økende mengder av enten (S) -2 og Saha. Celleekstrakter ble utsatt for Western immunblotting for å detektere fosfo-H2AX, PARP og dens spaltede fragment og acetyl-H3; a-tubulin ble brukt som lasting kontroll. (B) – p21 mRNA nivåer fra LNCAP og PNT1A celler inkubert uten /med (S) -2 eller Saha i 24 timer ble målt ved hjelp av kvantitativ real-time PCR. Normale PNT1A celler var tilsynelatende mindre følsom for (S) -2 sammenlignet med Saha. Kolonner, gjennomsnitt av tre uavhengige utvalg: barer ± SD; signifikant forskjell (
P
≤0.05). (C) -. PARP-spaltning og γ-H2AX nivåer som induseres i LNCaP og PNT1A celler ved en 24 h-behandling uten /med (S) -2 ble sammenlignet på samme blott
Videre er vekst arrest i (S) -2-behandlede LNCAP celler var assosiert med en markert doseavhengig økning (7-13 ganger) i p21 mRNA-nivåer som var også forbedret med Saha, men med en mindre doseavhengig progresjon (figur 3B, venstre) . Det bør bemerkes at p21-ekspresjon i PNT1A celler var upåvirket av (S) -2, mens påfallende oppregulert ved 5 uM Saha (figur 3B, til høyre). Videre har resultatene oppnådd ved å sammenlikne på samme blott effektene av (S) -2 i LNCaP-celler og PNT1A har tydelig vist at LNCaP definitivt var mer følsomt enn normalt PNT1A celler i form av PARP-spaltning og γ-H2AX nivåer (figur 3C) .
(S) -2 induserer cellesyklus arrest, apoptose og differensiering av PC3 celler
effekten av (S) -2 på spredning av de svært metastatisk prostatakreft PC3 celler har også vært evaluert. Celler dyrket i tre dager uten /med økende mengder av (S) -2 gikk en dose-avhengig hemming av proliferasjon (figur 4A) i samsvar med den betydelige økningen i andelen av celler arrestert i G
0 /G
en fase (46-75%) og reduksjon (40-15%) av celler i S-fasen (Figur 4B). Konsekvent, p21 var signifikant oppregulert på 15 og 24 timer med behandling (Figur 4C). Av interesse, (S) -2-indusert acetyl-H3-nivåer ble allerede forbedret på 24 timer og økte ytterligere etter 48 timer, bare når effekten av Saha begynte å avta (figur 4D).
(A) – Celler (10
5) ble utsådd i 6-brønners plater og tillatt å feste over natten. Dagen etter (S) -2 tilsatt ved de angitte konsentrasjoner og celletallet ble bestemt langs de neste tre dagene. (B) – Celler ble inkubert i 24 t med 2,5 mM (S) -2 for å bestemme% av PI-fargede celler i forskjellige faser av cellesyklusen, som bestemt ved flow-cytometri. Bilder fra enten ubehandlede og behandlede kulturer ble tatt ved hjelp av et fasekontrastmikroskopi. (C) – p21 mRNA-nivåer i PC3-celler fra kulturer som ble behandlet uten /med (S) -2 ble målt ved hjelp av kvantitativ real-time PCR. (D) – Sammenlignende Western blot-analyse av acetyl-H3-nivåer i celleekstrakter fra PC3 behandlet med enten (S) -2 eller Saha; α-tubulin ble brukt som lasting kontroll.
Men PC3 celler, til tross for deres følsomhet for (S) -2-mediert cytostase, syntes å være mer motstandsdyktig enn LNCaP celler til medikamentindusert apoptose som vist ved det faktum at et lignende mønster av spaltet PARP, γ-H2AX og acetyl-α-tubulin i de to cellelinjene kunne oppnås bare ved å behandle PC3-celler med to ganger den som anvendes for LNCaP-celler (figur 5A) dosering. Videre er det fluorescerende analysen for caspase 3 aktivering ved 2,5 um (S) -2 indikerte at omtrent 23% av PC3-celler gjennomgikk apoptose etter en 48 h-behandling (figur 5B)
ie
mindre enn en tredjedel relativ å behandlede LNCAP celler. I tillegg, PC3-celler som er igjen på fatet etter inkubering i 72 timer med økende mengder av legemiddel ble større i størrelse i forhold til kontrollene og akkumulert i cytoplasma nøytralt lipid-dråper, farving positivt med olje-Red O (ORO) som et resultat av medikament -indusert adipogenic differensiering (figur 5C) som allerede var rapportert å forekomme i disse celler [40]
(A) -. prøver fra PC3 og LNCaP-celler behandlet uten /med (S) -2- (2,5 og 5 uM) i 24 timer ble analysert ved hjelp av Western blot og immunpåvist for: PARP og dens spaltede fragment, γ-H2AX og acetyl-α-tubulin, mens α-tubulin ble anvendt som kontroll lasting. (B) – Celler, enten ubehandlet eller behandlet med 2,5 mM (S) -2 i 48 timer ble inkubert med 1 t før høstes med FAM-DEVD-FMK carboxyfluoresceine og deretter skylt to ganger med PBS og deres grønn fluorescens ble målt ved flow cytometri (se kommentar til punkt B i figur 2). (C) – Mikroskopisk vurdering av effektene av (S) -2 på akkumulering av nøytrale lipid-dråper innenfor PC3-celler behandlet i tre dager. Etter fiksering ble cellene farget med en ORO oppløsning; kvantifisering av ORO farging ble utført som beskrevet i materialer og metoder.
(S) -2 Reduserer Invasivitet, Migrasjon og motilitet av PC3 Cells
Matrix metalloproteinaser (MMP) utgitt av tumorceller i det ekstracellulære miljøet er avgjørende for kreft-promo vev degradering og invasjon sammen med metastatisk prosess [41], [42], [43]. MMP-9 fra det kondisjonerte medium av PC3 kulturer ble sendt til gelatin zymografi og viste en doseavhengig reduksjon av MMP-9 aktivitet (figur 6A) som ble ledsaget av en svak, men ikke signifikant, reduksjon i MMP-9-ekspresjon (figur 6B, til venstre). I stedet ekspresjon av vevsinhibitor av metalloproteinase-1 (TIMP-1) – kjent for å utøve anti-metastatiske virkninger av kontrast aktiviteten til MMP-9 og andre MMP’er [44], [45] – ble påfallende forbedret etter 24 timers behandling (figur 6B, høyre)
(A) -. Porsjoner av kondisjonert medium fra PC3 kulturer inkubert uten /med (S) -2 i fravær av FCS ble sendt til gelatin zymografi og densitometrisk analyse av MMP -9 aktivitet (prosentandel av kontroll). (B) – MMP-9 og TIMP-1 mRNA-nivåer fra PC3-celler behandlet uten /med (S) -2 i 24 timer ble bestemt ved kvantitativ real-time PCR. (C) – (S) -2 inhiberte PC3 cellemotilitet
in vitro
. Konfluente kulturer ble «såret» ved hjelp av en steril plast spiss og vedlikeholdes uten /med økende mengder av medikament i 24 timer. En fasekontrastmikroskopi ble brukt til å ta bilder av monolagene. (D) – (S) -2 redusert invasivitet av PC3. Kulturer ble forbehandlet med /uten (S) -2 (2,5-5 uM) i 24 timer og deretter porsjoner av PC3-celler (20 x 10
3) ble overført i det øvre rom av kammeret. Celler migrerte gjennom Matrigel på filtrene i Boyden kamre ble talt opp etter 6 timer og uttrykt som absolutte celletallet ± SD; fem forskjellige mikroskopiske felt (forstørrelse: x200) for hver tilstand ble undersøkt og signifikant forskjell mellom prøvene ble etablert på
P
≤0.05
Videre resultatene av «sårtilheling».
