Abstract
Den type jeg transmembrane protein med epidermal vekstfaktor og to follistatin motiver 2 ( TMEFF2), uttrykkes hovedsakelig i hjernen og prostata. Ekspresjon av TMEFF2 er deregulert i prostata cancer, hvilket antyder en rolle for denne sykdommen, men den molekylære mekanisme (r) som er involvert i denne effekten er ikke klar. Selv om androgener fremme
tmeff2
transkripsjon, androgen levering til kastrerte dyr bærer CWR22 xenografter øker TMEFF2 proteinnivåer i fravær av mRNA endringer, noe som tyder på at
TMEFF2
kan også være etter transcriptionally regulert. Her viser vi at oversettelsen av
TMEFF2
er regulert av androgener. Tilsetning av fysiologiske konsentrasjoner av dihydrotestosteron (DHT) i prostatacancercellelinjer øker translasjon av endogene
TMEFF2
eller transfektert
TMEFF2-luciferase
fusjoner, og denne effekten krever tilstedeværelse av oppstrøms åpne leserammer ( uORFs) i 5′-utranslaterte område (5′-UTR) av
TMEFF2
. Ved hjelp av kjemiske og siRNA hemming av androgen reseptor (AR), viser vi at androgen effekt på
TMEFF2
oversettelsen er mediert av AR. Viktigere, DHT fremmer også fosforylering av α underenheten av translasjons-initierings-faktor to (eIF2α) i en AR-avhengig måte, parallelt med effekt på
TMEFF2
oversettelse. Videre endoplasmatiske retikulum (ER) stress forhold som fremmer eIF2α fosforylering, også stimulere
TMEFF2
oversettelse. Disse resultatene indikerer at androgen signale fremmer eIF2α fosforylering og påfølgende oversettelse av
TMEFF2
via en mekanisme som krever uORFs i 5′-UTR av
TMEFF2
Citation:. Overcash RF, Chappell VA, Grønn T, Geyer CB, Asch AS, Ruiz-Echevarría MJ (2013) androgen signale Fremmer Oversettelse av
TMEFF2
i prostata kreft celler via Fosforylering av α-subenheten av Oversettelse Initiation Factor 2. PLoS ONE 8 (2): e55257. doi: 10,1371 /journal.pone.0055257
Redaktør: Hari Koul, University of Colorado, USA
mottatt: 23 juli 2012; Godkjent: 27 desember 2012; Publisert: 06.02.2013
Copyright: © 2013 Overcash et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av et stipend fra National Cancer Institute (1R15CA155873). Ingen ekstra ekstern finansiering ble mottatt for denne studien. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesse eksisterer
Innledning
Androgener signaliserer gjennom AR spille en viktig rolle i normal prostata utvikling og bidra til utviklingen av prostatakreft. Binding av androgener til AR fremmer en konformasjonsendring som til slutt fører til sin translokasjon til kjernen og regulering av transkripsjon av et spesifikt sett av androgen-responsive gener. Kliniske og eksperimentelle bevis foreslår at prostatakreft progresjon skjer ved endring av den normale androgen-signalering, noe som reduserer spesifisitet eller mengden av AR ligand som kreves for proliferasjon og overlevelse [1]. Viktigere, nylige resultater indikerer at funksjonen av AR er spesifikk for sykdommen trinnet, utløser en annen genekspresjon program i androgen-avhengige forhold til androgen-uavhengig prostatacancer [2]. Mens rollen til AR signaleringsaksen i transkripsjonsregulering er godt dokumentert, er svært lite kjent angående dens rolle i translasjonsinitiering foreslått i tidlige studiene [3], [4].
I transmembranprotein med epidermal vekstfaktor og to follistatin motivene 2 (TMEFF2) er en enkelt passering trans protein. TMEFF2 er uttrykt i embryo [5], [6] og selektivt i den voksne hjernen og prostata [7] – [9]. En rolle for TMEFF2 i prostata cancer ble foreslått av studier som indikerer at TMEFF2 ekspresjon endres i en betydelig andel av primære og metastatiske prostatakreft [5] – [10]. I tillegg har vi nylig demonstrert at TMEFF2 samvirker med sarkosin dehydrogenase (SARDH), enzymet som er ansvarlig for omdannelsen av sarkosin til glycin [11]. Viktigere sarcosine ble identifisert som en markør for prostatakreft progresjon i en storstilt skjerm av metabolitter fra menneskelige prostata prøver [12]. Økte plasma og urin Sarcosine nivåer skilles prostatakreft fra godartet prostatavevet, og ble ytterligere forhøyet i metastatisk kreft. I tillegg ble sarkosin metabolisme og som er involvert i den (dvs. SARDH) enzymer vist seg å virke som regulatorer av celleinvasjon og metastase [12]. Derfor er interaksjonen av TMEFF2 med SARDH antyder videre en rolle for TMEFF2 i prostata cancer progresjon. Faktisk har vi også fastslått at full-lengde TMEFF2 fungerer som en tumor suppressor og at denne rollen korrelerer, i det minste delvis, sammen med dets evne til å interagere med SARDH og modulere de cellulære nivåer av sarkosin [11].
i denne studien vi rapportere at oversettelse av
TMEFF2
er regulert av androgener, og denne effekten krever en funksjonell AR. Resultater ved bruk av xenograft-modeller og prostatakreftcellelinjer etablert at TMEFF2 ekspresjon endres i respons til androgener og /eller androgen-avhengige eller-uavhengig tilstand av cellene [8], [10]. Som demonstrert av Gery et al., [8] disse endringene er delvis på grunn av transkripsjonen aktivering av
tmeff2
i respons til androgener. Men økt TMEFF2 protein nivåer i fravær av en tilsvarende økning i mRNA nivåer er observert etter tilsetting av androgener til kastrerte dyr bærer CWR22 xenografter, noe som tyder på at
TMEFF2
kan også være etter transcriptionally regulert [10].
TMEFF2
mRNA har flere potensielle oppstrøms åpne leserammer (uORFs) i sin leder regionen, og sekvensanalyse tyder på at de er godt konservert blant pattedyrene. Selv om det bare er til stede i 5-10% av den cellulære mRNA, uORFs er vanlig i de ledende områder av mRNA som koder for oncoproteiner eller proteiner som er involvert i kontrollen av cellevekst og differensiering, og de fungerer ved å modulere translasjon av disse essensielle gener [13]. Etter å ha blitt oversatt, uORFs generelt blokkere oversettelse av hoved nedstrøms kodende region ved å tråkke oversettelse reinitiation ved hoved oversettelse startkodonet. Imidlertid kan uORFs fremme selektiv translasjon av nedstrøms kodende område under cellulært stress eller andre tilstander som øker fosforylering av α subenhet av eukaryote translasjonsinitieringssete faktor to (eIF2α) [13].
eIF2 i sin GTP- det kreves bundne form for valg av den translasjons-startkodonet. Fosforylering av α underenheten av eIF2 ved Ser-51 (eIF2α-P) hindrer utveksling av eIF2-BNP til eIF2-GTP, hindrer erkjennelse av det initierende kodon og avtagende global translasjonsinitiering [14]. Imidlertid, som nevnt ovenfor, uORF-inneholdende mRNA er aktivt settes under disse betingelser. To mekanismer har blitt foreslått for å forklare denne effekt. I den første, eksemplifisert ved
ATF4
mRNA som inneholder to uORFs, oversettelse reinitiation ved den hemmende nedstrøms uORF er forbigått under betingelser med eIF2α-P, på grunn av det faktum at lavere nivåer av eIF2-GTP økning den tiden som kreves for skanning ribosomer å kjøpe tilbake eIF2-GTP og gjenoppta oversettelse [15]. I den andre, observert i mRNA-er inneholdende en enkelt uORF, skanning av ribosomer omgå hemmende uORF grunn av den reduserte effektiviteten av translasjon ved initierings- kodon med et dårlig Kozak konsensussekvens [16]. I begge tilfeller uORF bypass resulterer i et økt antall ribosomer med start oversettelse ved initieringskodonet av hoved kodende sekvensen, for derved å øke syntesen av det bestemte protein.
I denne studien viser at vi
TMEFF2
oversettelsen er regulert av androgener. Androgen-regulering av
TMEFF2
oversettelse krever tilstedeværelse av uORFs i lederen regionen i
TMEFF2
mRNA og er avhengig av eIF2α-P. Videre er denne effekten mediert av AR siden det ikke er observert når AR nivåer er redusert med RNAi eller AR antagonist bikalutamid, eller i cellelinjer som ikke uttrykker det. Disse resultatene støtter en ny reguleringsmekanisme av androgen signale der uORF-inneholder mRNA er translatorisk aktivert i respons til eIF2α-P.
Materialer og metoder
Cell Culture
LNCaP og 22RV1 celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection og ble opprettholdt i RPMI 1640 (Gibco) supplementert med enten 10% FBS (Gemini Bio-produkter) eller 10% trekull-strippet serum (Atlanta Biologicals). PC3-celler (ATCC) ble erholdt fra Dr. D. terrian (East Carolina University) og ble også holdt i RPMI 1640. Mus embryonale fibroblaster som uttrykker villtype og mutant (Ser51 til Ala) eIF2 ble oppnådd fra Dr. R. Kaufman ( Sanford /Burnham Medical Research Institute), og har tidligere blitt beskrevet [17]. Disse cellene ble dyrket i DMEM. Dihydrotestosteron, ble bikalutamid, og actinomycin D kjøpt fra Sigma-Aldrich.
konstruerer og reporter Analyser
PCR-mutagenese ble brukt til å mutere startkodonene av uORFs fra august til Gug i
TMEFF2
5 «UTR. Primerne anvendt for mutagenese, er oppført i tabell 1. De 5 «UTR ble satt inn oppstrøms for Gaussia
luciferase
genet i pCMV-Gluc-vektoren (New England Biolabs). Den TMEFF2-myc-His-fusjonskonstruksjon som har blitt beskrevet tidligere (11). For uORF analyser, ble celler dyrket til 70-90% konfluens i 6-brønners plater og transfektert med 1,5 pg av hver konstruere per brønn, og den samme mengde av pSEAP-Control Vector II (BD Biosciences). Cellene ble transfektert med Lipofectamine 2000 (Invitrogen) etter produsentens protokoll og bruke 4 ul /brønn Lipofectamine reagens. Celler og supernatanter ble samlet 24 timer etter transfeksjon, og luciferase-aktiviteten ble bestemt fra supernatantene ved hjelp av Biolux sett (New England Biolabs). SEAP nivåene ble målt ved hjelp av Great Escape SEAP Chemiluminescence Kit 2.0 (Clontech Laboratories). For begge analysene, ble luminescens oppdaget ved hjelp av en 20/20
n luminometer (Turner Biosystems).
For DHT-stimulert reporter analyser ble cellene hormon-sultet i 48 timer i fenol rød- fritt medium inneholdende 10% trekull-strippet serum (CSS) før stimulering med DHT. Tjuefire timer etter hormon fjerning cellene ble transfektert hjelp Fugene HD transfeksjon reagens (Promega) etter produsentens anbefalinger. Kort sagt ble 10 ug av hver konstruksjon og 10 ug pSeap2 fortynnet i serumfritt RPMI med 30 pl Fugene HD-reagens med et totalvolum på 500 ul. 100 ul av denne transfeksjon blandingen ble det tilsatt per brønn i en 6-brønns plate. Den følgende dag ble DHT eller etanol kjøretøy tilsatt til frisk CSS-RPMI og cellene ble inkubert i ytterligere 48 timer før høsting av cellene og supernatantene. For å måle Gaussia luciferase mRNA nivåer, ble RNA isolert fra cellene ved hjelp av RNAqueous kit (Ambion) etter den medfølgende protokollen. cDNA ble så syntetisert med iScript kit (BioRad Laboratories), og luciferase mRNA nivåene ble målt ved QRT-PCR bruker IQ SYBR Grønn Supermix og IQ5 Real-Time PCR Detection System (BioRad Laboratories). Luciferase mRNA nivåer ble normalisert til p-
aktin Hotell og genekspresjon ble analysert ved hjelp av IQ5 Optical System Software (BioRad Laboratories). Se tabell 1 for primere som brukes for QRT-PCR.
DHT Stimulering Time-retters
Celler ble hormon-sultet i fenol rød-frie medier som inneholder 10% CSS natten før stimulering med 10 nM DHT eller DMSO kontroll. Actinomycin D ble anvendt ved en konsentrasjon på 5 nM. RNA ble isolert fra celler ved bruk av RNeasy Kit (Qiagen) og cDNA ble syntetisert ved anvendelse av Superscript II revers transkriptase (Invitrogen).
TMEFF2
beskjed nivåene ble målt ved QRT-PCR forsterkning ved hjelp av TaqMan
TMEFF2
primere (Hs00249367_m1, Applied Biosystems), og normalisert til
GAPDH
beskjed nivåer (forsterket med Hs99999905_m1, Applied Biosystems).
androgen Receptor knockdown
AR uttrykk ble redusert i 22RV1 celler ved hjelp av ON-TARGET pluss SMART basseng for menneskelig AR (Thermo Scientific). Non-targeting siRNA ble inkludert som en kontroll. I korthet ble 5 ul lyddemping RNA og 7,5 ul av DharmaFECT Transfection Reagent (Thermo Scientific) ble hver for seg fortynnet i 300 ul serumfritt, fenolrødt-fritt RPMI. Etter 5 minutters inkubasjon, ble oppløsningene blandet og inkubert i ytterligere 20 minutter ved romtemperatur, deretter tilsatt til en 85% sammenflytende cellemonolag i en T-25-kolbe inneholdende 2,4 ml komplett, fenolrødt-fritt RPMI.
Immunoblotting
Cellelysater ble fremstilt med radioimmunopresipitasjon Assay (RIPA) buffer [25 mM Tris-HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% ernæring X-100, 1% natriumdeoksykolat, 0,1% SDS] supplert med 0,1 mM β-glycerofosfat og 0,5 mM natrium-ortovanadat og protease-inhibitor cocktail (Sigma). Tjue mikrogram av lysatene ble separert på Mini-protean TGX gels (BioRad) og overført til PVDF membraner. Disse ble deretter blokkert i 30 minutter i 5% NFDM fortynnet i TBS-T og inkubert med det primære antistoff over natten ved 4 ° C. Inkubasjoner med en 1:10,000 fortynning av HRP-konjugert sekundært antistoff (Santa Cruz Biotechnology) ble i 1 time ved romtemperatur. Deteksjon ble utført med SuperSignal West Pico kjemiluminescenssubstrat (Thermo Scientific) i 5 min. I noen tilfeller ble blotter strippet med Restore PLUS Western Blot Stripping Buffer (Thermo Scientific) etter produsentens anbefalinger. Antistoffer mot TMEFF2, PSA, og eIF2α-P (Ser51) var fra Abcam, eIF2α og CREB2 /ATF4 antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, og P-eIF2α (Ser51) antistoffer var fra Cell Signaling Technology.
Polysome Analyse
cellemonolagene ble vasket en gang med kald 1 x PBS og skrapt med lyseringsbuffer [100 mmol /l KCl, 10 mmol /l HEPES (pH 7,4), 0,5% NP40, 5 mmol /l MgCl
2, 100 ug /ml sykloheksimid], og inkubert på is i 10 minutter, etterfulgt av en 5 min sentrifugering ved 10 000 rpm ved 4 ° C for å pelletere cellerester. Like proteinkonsentrasjoner av cytoplasmiske ekstrakter (1,8 mg) ble deretter lagt over en lineær sukrosegradient [15-45% (w /v) 10 mmol /l HEPES (pH 7,4), 100 mmol /L KCI, 5 mmol /l MgCl
2] og sentrifugert ved 35000 rpm i 2 timer ved 4 ° C i en SW41-Ti rotor uten brems. Ved anvendelse av en ISCO UA-6, ble fraksjoner oppsamlet under kontinuerlig UV-overvåking ved 254 nm. RNA ble isolert fra fraksjonene ved hjelp av Trizol reagens (Ambion). Tjuefem mikrogram RNA ble deretter anvendt for cDNA-syntese ved bruk av en iScript kit (BioRad Laboratories). En prøve av 0,1 mikrogram av hvert cDNA forberedelse ble brukt til å forsterke
TMEFF2
,
ATF4
, og
β-actin
av PCR der Platinum Taq HiFi DNA Polymerase system ( Invitrogen). PCR produktene ble deretter visualisert på en 1% agarosegel og analysert ved hjelp av den offentlige sfæren NIH Image J program (utviklet ved det amerikanske National Institutes of Health og tilgjengelig på internett på https://rsb.info.nih.gov/nih- image /).
Immunoflourescence
celler ble sådd ut ved en tetthet på 10.000 celler /brønn i Lab-Tek 8 vel kamret bakker (Nalge Nunc International) og inkubert over natten i en fuktet 37 ° C inkubator med 5% CO
2. Cellene ble vasket i PBS og fiksert i 4% paraformaldehyd i 10 minutter, vasket i PBS og permeabiliserte med 0,1% Triton-X100 i PBS og blokkert med 5% normalt geiteserum i 0,1% PBST. Prøvene ble inkubert i 1 time med de angitte primære antistoffer. De tilsvarende sekundære antistoffer ble tilsatt i en 1:500 fortynning i 5% geiteserum i PBS-T (0,1% Tween 20): geit-anti-kanin-IgG-AF488 (Invitrogen) og geite-anti-mus-IgG-AF488 (Invitrogen). Cellene ble vasket 3 ganger i PBS-T (0,1% Tween 20). Slides ble lufttørket og montert i medium som inneholder DAPI.
subcellulære fraksjonering
Utdrag fra celler dyrket i nærvær av 10 nM DHT, eller DMSO som kontroll, ble fraksjonert i cytosol, membran, kjernekraft og cytoskeletal fraksjoner ved hjelp av subcellulære Proteome Extraction kit (Calbiochem).
Statistical Analysis
data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Forskjeller ble analysert ved hjelp av paret, tosidige t-tester. P-verdier ≤ 0,05 (*) eller ≤0.01 (**) ble betraktet som signifikant.
Resultater
TMEFF2
5′-UTR inneholder flere uORFs at Block Oversettelse av den TMEFF2 Protein
5 «UTR av
TMEFF2
mRNA inneholder flere potensielle uORFs (figur 1A) at dersom oversatt ville potensielt blokkere oversettelse av
TMEFF2
hoved koding sekvens, og derfor bidra til regulering av
TMEFF2
uttrykk. For å undersøke hvilken rolle de uORFs i regulering TMEFF2 protein uttrykk, spurte vi om å blokkere oversettelse av uORFs vil påvirke oversettelsen av TMEFF2 protein i menneskelig prostata kreft cellelinjer. En TMEFF2-Gaussia Luciferase (Gluc) reporter ble generert for dette formålet ved å klone
TMEFF2
5′-UTR, inkludert fire uORFs, oppstrøms av Gluc sekvenser (pTM1234-Gluc, figur 1B).
TMEFF2
-Gluc fusjon ble satt under kontroll av CMV arrangøren. Det regulatoriske bidraget av uORFs til
TMEFF2
oversettelsen ble evaluert av mutere startkodonene (AUGs) av de fire mulige uORFs (august Gug, figur 1B) og bestemme deres virkning på Gluc uttrykk i androgen-avhengige prostatacancer LNCaP-cellelinje og dens ben-metastatisk, androgen-uavhengig derivat C4-2B cellelinje. Det ble observert en seks til sju ganger høyere luciferaseekspresjon når AUGs fra alle fire uORFs ble mutert (pTMXXXX-Gluc, figur 1C). Enkeltmutasjoner på AUGs av det andre, tredje eller fjerde uORFs fremmet en 3-4 gangers økning i ekspresjon Gluc, mens mutere den august av den første uORF hadde en meget liten effekt, noe som tyder på en rolle minimal, om noen, i regulering av TMEFF2 uttrykk. Følgelig, kombinert mutasjoner av uORFs 2, 3 og 4 resulterte i fem til seks ganger høyere luciferaseekspresjon av reporteren, lik den som er observert når alle de fire uORFs ble mutert (figur 1C). Lignende resultater ble oppnådd i andre androgen-responsive (22Rv1) og-uavhengig (PC3) prostatacancercellelinjer. Mutasjon av uORFs resulterte i økt ekspresjon av luciferase reporter den Gluc, om enn i varierende gangers induksjon (figur 1D). I de konstruksjoner som benyttes for disse forsøk, ble ekspresjon av fusjonsgenet styrt av CMV-promoteren, og luciferase-aktiviteten ble normalisert til mRNA-nivåer. Til sammen tyder disse resultater på at uORFs i 5′-UTR av
TMEFF2
mRNA funksjon synergi for å undertrykke oversettelse av hoved nedstrøms ORF.
A) Skjematisk representasjon av 394 nt oppstrøms av
TMEFF2
hoved kodende region og relativ lokalisering av fire mulige uORFs (aa = aminosyre) innenfor 5′-UTR. B) Skjematisk fremstilling av TMEFF2-Gaussia Luciferase reporter og mutante konstruksjoner. The X indikerer mutasjon av august til en GUG å hindre oversettelse av muterte uORFs. Én og flere mutasjoner ble innført. C) luciferase-aktivitet demonstrert ved pTM1234-Gluc og de ulike mutante konstrukter i LNCaP og c4-2 celler. D) Luciferase aktivitet demonstrert ved pTM1234-Gluc og konstruksjon med alle uORFs muterte (pTMXXXX-Gluc) i PC3 og 22Rv1 celler. I C) og D) luciferaseaktivitet ble målt i supernatanten og beregnet ved først å normalisere til mRNA-nivåer for hver enkelt konstruksjon, og deretter til den luciferase-aktivitet demonstrert ved pTM1234-Gluc reporter konstruksjon, som ikke har mutasjoner i uORFs, anses vilkårlig som 1. viste data er gjennomsnitt ± SD av minst to uavhengige forsøk med flere gjentak. *,
p
0,05, og **,
p
. 0,01
Oversettelse av en TMEFF2-luciferaserapportørplasmid er regulert av androgener gjennom en mekanisme som krever tilstedeværelse av uORFs i mRNA Leader omegn
transkripsjon av
tmeff2
genet reguleres av androgener [8]. Imidlertid har det vært antydet at androgener også påvirke
TMEFF2
uttrykk på post-transcriptional nivå [10], spørre oss om å undersøke om
TMEFF2
oversettelsen ble påvirket av androgener. 22Rv1 celler ble valgt for disse eksperimentene siden: i) de har vist seg å være en verdifull modell for AR-mediert reportergen assays [18], ii) de viste den høyeste gangers økning i luciferase reporter gen-ekspresjon når uORFs ble mutert ( se figur 1D), og iii) de uttrykker påvisbare nivåer av endogen TMEFF2 protein. 22Rv1-celler ble transfektert med den pTM1234-Gluc reporter, dyrket i fenolrødt-fritt media supplementert med trekull-strippet (CS) FBS – for å fjerne steroid hormones- og behandlet med forskjellige konsentrasjoner av dihydrotestosteron (DHT). Luciferase-aktivitet ble målt fra supernatanten og normalisert til mRNA-nivåer. Tilsetning av DHT øket Luciferase-ekspresjon i en doseavhengig måte (figur 2A), som indikerer at androgener stimulere translasjonen av hoved ORF. Viktigere, ble denne effekt observert ved DHT-konsentrasjon innenfor de fysiologiske nivåer som finnes i humant serum [19]. Luciferase-aktivitet fra celler som bærer den pTMXXXX-Gluc reporter konstruksjon, hvor de AUGs fra alle fire uORFs ble mutert, ikke endre seg i respons til DHT, selv om, som forventet, var mye høyere (figur 2A). Disse resultatene indikerer at oversettelse av hoved ORF nedstrøms av
TMEFF2
5’UTR er regulert av androgener i en uORF avhengig måte.
A) Luciferase aktivitet demonstrert ved pTM1234-Gluc og den pTMXXXX-Gluc mutant konstruere i 22Rv1-celler i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av DHT. B) Luciferase-aktivitet demonstrert ved pTM1234-Gluc konstruere i 22Rv1 celler i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av DHT og DHT 20 uM bikalutamid (BIC), en AR-agonist. C) Luciferase-aktivitet demonstrert ved pTM1234-Gluc konstruere i PC3-celler i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av DHT. For alle disse forsøk ble cellene hormon-sultet i fenol rød-fritt medium inneholdende trekull strippet serum. Luciferase-aktivitet ble normalisert til mRNA-nivåer for hver konstruksjon og deretter til den luciferase-aktivitet demonstreres ved hver og en av konstruksjonene uttrykt i celler dyrket i fravær av DHT, ble satt til 1. Viste data er gjennomsnitt ± S.D. av minst tre uavhengige eksperimenter med flere paralleller. *,
p
0,05, og **,
p
. 0,01
For å finne ut om DHT effekt på oversettelsen er mediert av AR , eksperimentene beskrevet ovenfor ble gjentatt i nærvær av bikalutamid for å blokkere AR aktivering. Tilsetning av dette stoffet reduserte DHT-formidlet induksjon av pTM1234-Gluc reporter Luciferase-ekspresjon i nærheten av basalnivåer, selv om en liten to- til tre-gangers induksjon kunne observeres ved 10 nM DHT (figur 2B). Disse resultater indikerer at effekten av DHT på oversettelsen av reporter-konstruksjonen krever AR signalering. Etter avtale med disse resultatene, gjorde vi ikke observere DHT-indusert oversettelse av pTM1234-Gluc reporter i PC3 prostatakreftceller som ikke uttrykker AR (figur 2C). Til sammen disse resultatene indikerer at DHT-indusert oversettelse av
TMEFF2
krever aktivering av AR og formidles av de uORFs i leder regionen av mRNA.
Oversettelse av de endogene TMEFF2 Protein er regulert av androgener
endringer i ekspresjon av det endogene proteinet TMEFF2 i respons til androgener ble også analysert. For dette formål ble 22Rv1 celler dyrket i fenolrødt-fritt media supplementert med CS-FBS ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av DHT, og lysatene ble analysert for ekspresjon TMEFF2 ved western blotting. I fravær av androgener, ekspresjon av TMEFF2 var knapt synlig. Men tilsetning av DHT øket TMEFF2 uttrykket (figur 3A), og resulterte i de høyeste nivåer i området fra fysiologiske DHT konsentrasjoner. DHT-indusert ekspresjon av endogen TMEFF2 ble også observert i androgen-responsive prostata cancer LNCaP-celler (figur 3A). Ekspresjonen av prostataspesifikt androgen (PSA), en AR mål anvendt som kontroll for androgen transkripsjonen aktivitet, ble forbedret ved tilsetning av DHT (figur 3A). Behandling av cellene med bikalutamid særlig hemmet DHT-indusert TMEFF2 og PSA uttrykk som kun ble observert ved de høyeste konsentrasjonene av DHT (figur 3A). Hemming av DHT-indusert TMEFF2 uttrykk ble også oppnådd etter banket ned uttrykk for AR hjelp siRNA (figur 3B). Til sammen indikerer disse resultater at ekspresjonen av det endogene proteinet TMEFF2 reguleres av AR-signalering.
A) Representative Western blot som viser en økning i ekspresjon TMEFF2 i respons til DHT tilsetning i 22Rv1 og LNCaP-celler (α = antistoffet ). Samtidig tilsetning av 20 mikrometer bikalutamid til 22Rv1 celler (midten panel) forhindret økningen i TMEFF2 uttrykk observert ved fysiologisk konsentrasjon av DHT. PSA ble anvendt som positiv kontroll, siden dens ekspresjon induseres av androgen i en AR-avhengig måte. β-tubulin ble anvendt som en kontroll lasting. B) Western blot som viser effektiv knock down av de to former av AR i 22Rv1 celler ved anvendelse av siRNA (til høyre). Representative western blot som viser at tilsetning av DHT har ingen effekt på ekspresjonen av TMEFF2 i celler hvor AR-nivåene ble redusert med RNAi. PSA ble anvendt som kontroll og, som forventet, var dens ekspresjon ikke påvirkes av DHT i AR-siRNA behandlede celler. β-tubulin ble anvendt som en kontroll lasting. C) Endringer i
TMEFF2
mRNA nivåer i LNCaP og 22Rv1 cellelinjer i respons til DHT målt ved QRT-PCR. Verdier ble normalisert til p-tubulin-mRNA. Hvert eksperiment ble gjentatt minst tre ganger, og for de representative bilder presentert, ble membranene strippet og re-probet med de forskjellige antistoffene eller de samme prøvene ble gjen kjørt i en annen gel. β-tubulin ble anvendt som en kontroll lasting hver gang prøvene ble kjørt.
Det ble observert en økning i
TMEFF2
mRNA-nivåer i respons til DHT målt ved QRT-PCR ( Figur 3C), i samsvar med en tidligere rapport som indikerer at androgener stimulerer
tmeff2
transkripsjon [8]. Imidlertid ikke beskjeden økning i mRNA-nivåer ikke sannsynlig forklare den observerte DHT-formidlet økning i proteinekspresjon. For å utelukke at økningen i endogene TMEFF2 protein observert i respons til DHT var utelukkende skyldes økt transkripsjon, brukte vi actinomycin D for å blokkere transkripsjon og vurderes nivåene av TMEFF2 protein og mRNA i 22Rv1 cellene ved ulike tidspunkt etter tilsetting av DHT, for å indusere
tmeff2
ekspresjon og /eller actinomycin D. tMEFF2 proteinnivåene økt dramatisk 60-120 minutter etter tilsetningen av DHT, men ikke DMSO, bilen kontroll (figur 4A). Viktigere, i nærvær av actinomycin D, tilsetning av DHT fortsatt fremmet en økning i TMEFF2 proteinekspresjon, om enn på et lavere nivå enn observert i fravær av transkripsjonen inhibitor. Som det fremgår av analysen av
TMEFF2
mRNA nivåer av QRT-PCR, tillegg av actinomycin D hemmes basal og DHT-indusert
tmeff2
transkripsjon (figur 4B). Tilsetning av DHT alene fremmet en viss innledende økning i transkripsjon (1,2-ganger etter 20 minutter) som gradvis ble redusert til basalnivåer etter 60 minutter av behandlingen (ikke vist). Derfor er disse resultatene viser at androgener regulerer ikke bare transkripsjon av
tmeff2
genet men også oversettelse av den endogene
TMEFF2
mRNA, støtter resultatene presentert ovenfor ved hjelp av en TMEFF2-luciferase reporter.
A) Representative western blot som viser den TMEFF2 proteinet ved de indikerte tidspunkter etter tilsetning av 10 nM DHT i nærvær eller fravær av 5 nM actinomycin D (Act D) for å blokkere transkripsjon. Enten DMSO eller DHT og actinomycin D ble tilsatt samtidig. Kvantifisering av blottene er vist nedenfor western blot. Båndintensitetene av prøvene som ble behandlet med DHT ble normalisert første p-tubulin og deretter til verdiene oppnådd for prøvene DMSO ved de tilsvarende tidspunkter. B) Endringer i
TMEFF2
mRNA-nivåer i 22Rv1 celler i respons til DHT eller DMSO og actinomycin D behandling som målt ved QRT-PCR. Verdier ble normalisert til
GAPDH
. Viste data er representative for to uavhengige eksperimenter.
Andre proteiner inkludert β-catenin og occludin translocate til kjernen eller regioner av cellular kontakt etter androgen behandling. Men våre resultater indikerte at androgen behandling ikke endre subcellulære lokalisering av TMEFF2 (figur S1).
Androgen Signa Fremmer eIF2α Fosforylering
Fosforylering av eIF2α reduserer den globale oversettelse, men gir også en mekanisme som selektivt forsterker oversettelse av uORF-inneholdende mRNA [13], [20]. Vi har derfor en hypotese om at DHT fremmer endogen
TMEFF2
oversettelse gjennom fosforylering av eIF2α. Effekten av DHT på eIF2α fosforylering ble undersøkt ved western blot-analyse i prostata cancer 22Rv1 og PC3-celler dyrket i fenolrødt-fritt media supplementert med CS-FBS og behandlet med forskjellige konsentrasjoner av DHT. Økte nivåer av eIF2α-P ble klart påvist, på en doseavhengig måte, i lysater fra DHT-behandlede 22Rv1 celler, men ikke i lysater fra DHT-behandlede AR-null PC3-celler (figur 5A), som indikerer at androgener fremme eIF2α-P og at denne effekten er avhengig av tilstedeværelsen av en funksjonell AR. Etter avtale med disse resultatene, forbehandling av 22Rv1 celler med AR antagonist bikalutamid forhindret DHT-mediert økning i eIF2α fosforylering (figur 5B). DHT tillegg fremmes også en økning i ekspresjon av ATF4 protein, en transkripsjonsfaktor regulert ved fosforylering eIF2α (figur 5A).
A) Representative Western blot som viser en økning i eIF2α-P i respons til DHT i tillegg 22Rv1 celler. Denne effekten ble opphevet i PC3 celler som ikke uttrykker AR (til høyre). ATF4 proteinnivåer ble målt som en positiv kontroll, siden det blir indusert ved eIF2α-P. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. B) Tilsetning av 20 uM bikalutamid til 22Rv1 cellene forhindret økningen i eIF2α-P observert etter tilsetning av DHT.
