Abstract
Mann kjønn er en risikofaktor for utvikling av leverkreft (HCC), men mekanismene er ikke fullt ut forstått. RNA bindende motiv gen på Y-kromosomet (RBMY), som koder for en mannlig bakterie celle-spesifikke RNA-spleising regulator under spermatogenesis, er abnormt aktivert i menneskelige mannlige leverkreft. Denne studien undersøkte
in vitro
onkogene effekt og mulig mekanisme RBMY i menneskelig hepatoma cellelinje HepG2 og dens
in vivo
effekt med hensyn til leveren hos mennesker og transgene mus. RBMY uttrykk i HepG2 celler ble slått ned av RNA interferens og kreftcellen fenotype var preget av soft-agar-kolonidannelse og følsomhet for hydrogen-peroksid-indusert apoptose. Resultatene viste at RBMY knockdown reduseres transformasjonen og anti-apoptotiske effektiviteten av HepG2-celler. Ekspresjonen av RBMY, androgenreseptoren (AR) og dets hemmende variant AR45, AR-målrettede gener insulin-lignende vekstfaktor 1 (IGF-1) og insulin-lignende vekstfaktorbindende protein 3 (IGFBP-3) ble analysert ved kvantitativ RT -PCR. Oppregulering av AR45 variant og reduksjon av IGF-1 og IGFBP-3-ekspresjon ble bare påvist i RBMY knockdown-celler. Videre uttrykkes RBMY positiv human hann HCC lavere nivå av AR45 i forhold til RBMY negativ HCC vev. De onkogene egenskaper RBMY ble videre undersøkt i en transgen musemodell. Lever-spesifikke RBMY transgene mus utviklet lever forstadier til kreft, adenom og HCC. RBMY også akselerert kjemisk carcinogen-indusert hepatocarcinogenesis i transgene mus. Sammen er disse funnene tyder på at Y-kromosom-spesifikke RBMY er sannsynligvis involvert i reguleringen av androgen reseptor aktivitet og bidrar til mannlig overvekt av HCC
Citation. Tsuei DJ, Lee PH, Peng HY, Lu SL, Su DS, Jeng YM, et al. (2011) Mann Germ Cell-spesifikke RNA Binding Protein RBMY: A New Oncogene Forklare mannlig dominans i leverkreft. PLoS ONE 6 (11): e26948. doi: 10,1371 /journal.pone.0026948
Redaktør: John D. Minna, University of Texas Southwestern Medical Center i Dallas, USA
mottatt: 27 juni 2011; Godkjent: 06.10.2011; Publisert: 04.11.2011
Copyright: © 2011 Tsuei et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd NHRI-EX93-117BN, NHRI-EX95 (96, 97, 98) -9418BI fra National Health Research Institute of Taiwan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
leverkreft (HCC) er en av de ledende kreft i verden [1]. De viktigste identifiserte risikofaktorer inkluderer hepatitt B-virus (HBV) eller hepatitt C virus (HCV) infeksjon, eksponering for aflatoksiner, og mannlig kjønn [2]. Den mannlige-til-kvinne forholdet mellom HCC velig gjennomsnitt 4-5:1 og er særlig høyere i HBV-relaterte HCC (5-11:1) [3]. Epidemiologiske studier har vist at et forhøyet nivå av serumtestosteron ble signifikant assosiert med en økt risiko for HCC i hann HBV-bærere [4]. Imidlertid er mannlig dominans med en ratio på 3-4:1 også observert i barndommen HCC med tidlig debut, så unge som 10 år før puberteten, og kan ikke forklares direkte av androgen effekt [5], [6] .
androgenreseptoren (AR) er blitt vist å bidra til den mannlige preferanse for hepatocarcinogenesis i HBV og HCV-bærere [7], [8]. AR-protein formidler virkningen av androgener og kan bidra til utvikling av hann HCC i mus [9]. Etter binding til ligandene danner AR homodimerer og aktiverer transkripsjon av mål-gener som insulinlignende vekstfaktor 1 (IGF-1) og insulin-lignende vekstfaktorbindende protein 3 (IGFBP-3) [10], [11]. AR funksjon reguleres av ko-aktivatorer eller ko-repressorer [12], den hemmende isoformen AR45 [13], og kortere CAG gjentakelser (som fører til høyere aktivitet AR) i det første ekson av AR-genet [14]. HBV-X-proteinet er et velkjent AR ko-aktivator [15], [16], og ble rapportert å bidra til mannlig dominans i HBV-relaterte humane hann HCC [17]. I ikke-HBV HCC, har andre ukjente kjønnsspesifikke faktorer som fremmer HCC dannelse hos menn blitt et stort problem.
feilregulering av Y kromosom-spesifikke gener er funnet i mannlig HCC, men deres roller i den mannlige dominansen av HCC så langt ikke har vært adressert [18], [19]. RNA-bindende motiv gen på Y-kromosomet (RBMY) er en mannlig bakterie celle-spesifikke uttrykk gen som inneholder RNA anerkjennelse motivene på N-terminalen [20]. Dens uttrykk er begrenset til kjernen av mannlige kjønnsceller og dens sletting kan føre til pågripelsen av kjønnsceller ved meiotisk stadium av sædcelle [21]. RBMY fungerer som en hann bakterie-celle-spesifikke spleising regulator ved å modulere aktiviteten av konstitutivt uttrykt spleise faktorer [22], [23]. Dens avvikende aktivering blir detektert i omtrent 1/3 av mannlige HCC og hepatoblastoma tumorvev, men ikke i parvise ikke-tumor levervev, kvinnelig HCC, eller andre typer kreft [24]. Selv RBMY kan samhandle med AR co-aktivator Sam68 [25], [26], dens rolle i AR signalveien har ennå ikke blitt rapportert.
Denne studien forsøkte å evaluere transformasjon og anti-apoptotisk effekt av RBMY i menneskelige hepatomceller, og leverkarsinogent effekt av RBMY i transgene mus, og å utforske dens mulige underliggende molekylære mekanismer. Våre resultater
in vitro
,
in vivo
, og i klinisk menneskelig mannlig HCC vev foreslår at RBMY kan forsterke AR aktivitet og hepatocarcinogenesis ved å redusere uttrykket av AR hemmende variant AR45.
Materialer og metoder
Menneske vevsprøver
Paret svulst og ikke-tumor leveren vev ble samlet inn fra 66 kirurgisk HCC mannlige pasienter (44 HBV-relatert, 10 HCV-relatert, 5 HBV /HCV-relatert, og syv ikke-HBV /HCV-relatert) ved National Taiwan University Hospital (NTUH) i 2007. Alle kliniske prøver ble oppnådd etter godkjennelsen av forskningsetiske komité for NTUH (NTUHREC godkjenning nr 9361701139) .
Cell kultur og transfeksjon
den menneskelige leverkreft cellelinjer HepG2 og Hep3B ble opprinnelig hentet fra Bioresource Collection og Research Center (BCRC, Taiwan). HepG2, Hep3B og Huh7 (fra Dr. Hui Lin Wu av NTUH hepatitt Research Center) celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplementert med 10% føtalt kalveserum (HyClone, Logan, UT). Transfections ble utført ved hjelp av Lipofectamine (Invitrogen /Life Technologies, Carlsbad, California) i henhold til produsentens protokoll.
RNA interferens
pSUPER-basert strategi ble brukt til å knockdown RBMY uttrykk. RBMY liten hårnål RNA (shRNA) ble generert ved å ligere tre 19-nukleotidsekvenser spesifikke for RBMY SRGY region (eksoner 7-10) i vektoren (OligoEngine, Inc., Seattle, WA). Sekvensene er vist i tabell S1. Celler ble dyrket til 80% konfluens for transfeksjon og transfekterte celler ble selektert med 300 ug /ml geneticin.
Semi-kvantitativ RT-PCR og kvantitativ PCR
Total RNA ble ekstrahert ved bruk av RNeasy Mini Kit (QIAGEN, GmbH, Hilden, Tyskland) og utsatt for revers transkripsjon ved hjelp av Superscript III revers transkriptase (Invitrogen). Primersekvensene og reaksjonsbetingelser er vist i tabell S1. Kvantitativ PCR ble utført ved hjelp av TaqMan Gene Expression analyse mix for målet RBMY (Hs00359074_m1) eller endogen kontroll hypoxantin fosforibosyltransferase 1 (Hs99999909_m1) (Applied Biosystems, Foster City, California). Kvantitativ PCR for AR, AR45, IGF-1, IGFBP-3 og endogene kontroll S26 ble utført ved anvendelse av MasterMix Plus for SYBR grønn (Applied Biosystems). Forsterkning signaler ble oppdaget av en ABI prism7700 eller 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems).
Soft agar og overlevelsesanalyser
For myk agar assay, 2500 celler per brønn i vekstmedium inneholdende 0,35% agarose ble plassert i 6-brønns plater med 0,5% agarose basen. Etter 14 dagers inkubering ble koloniene farget med 0,005% krystallfiolett ved romtemperatur i 1 time og telles for hver plate.
For overlevelse analyse, er HepG2-celler transfektert med shRNA plasmider ble behandlet med 0,5 eller 0,75 mM hydrogenperoksid for 24 timer å indusere apoptose. Celleviabilitet ble målt ved hjelp av Cell Proliferation Kit I (MTT) (Roche Diagnostics, Tyskland). Absorbans ble målt ved 590/690 nm ved anvendelse av en mikroplateleser MRX (Dynex Technologies, Inc., VA) og celleoverlevelse ble uttrykt som absorbans forhold til den for ubehandlet kontroll.
Bestemmelse av androgen-reseptor-CAG-repeterende lengden i menneskelige HCC vev
genomiske regionen som inneholder CAG trinucleotide gjenta var PCR-forsterket og merket med FAM, utsatt for ABI 3700 Genetic Analyzer, og scoret med GeneMapper programvare (Applied Biosystems). Standardkurven for å beregne CAG gjenta nummeret var basert på fire kontrollprøver med CAG gjenta tall fra 17 til 35. Sekvense analyse ble utført på HCC vev fra 66 forsøkspersonene med CAG gjenta tall ut av standardkurven.
Etablering av RBMY transgene mus og oppfølging histopatologi
RBMY kodende sekvensen ble forsterket og sub-klonet inn PBS-HCRHPI-A vektor med en leverspesifikk α1-antitrypsin promoter. Konstruksjonen ble fordøyd med
Spel
å generere et transgen fragment for injeksjon i pro-kjerner av befruktede egg av FVB /N mus. Institutional Animal Care og bruk komité College of Medicine og College of Public Health, godkjent National Taiwan University dyret omsorg og eksperimentelle prosedyrer (IACUC Godkjenning nr 20060217).
Musene ble ofret på 4-24 måneder gamle. Leveren deres ble fiksert i 10% nøytral-bufret formalin eller innebygd i oktober forbindelse (Sakura Finetek, Torrance, CA). Parafinsnitt ble farget med hematoksylin og eosin for histopatologi undersøkelse, mens frosne snitt ble farget med olje rød O for å oppdage fatty dråpe akkumulering. Alvorlighetsgraden av steatose ble anslått av andelen positiv farging bruke en morfologisk semi-kvantitativ metode og klassifisert i klasse 1 ( 33%), klasse 2 (33-66%), eller grad 3 ( 66%) som beskrevet tidligere [27].
Diethylnitrosamine behandling og histopatologi i mus
i den kjemiske kreftfremkallende modellen, 14 dager gamle RBMY transgene eller kontroll mus tilfeldig mottatt en eneste intra-peritoneal injeksjon av diethylnitrosamine ( DEN) (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO) ved 10 mg /kg kroppsvekt eller saltoppløsning av samme volum, henholdsvis. Musene ble avlivet etter 26 og 34 uker etter behandling. I tillegg ble tidligere offer på 14 uker spesifikt vedtatt for hannmus som var angivelig svært utsatt for DEN-indusert hepatocarcinogenesis. Målinger av tumormasser synlige på leveren overflaten ble registrert. Mikroskopiske lesjoner ble talt fra to representative seksjoner (50 mikrometer avstand) av hver mus leveren.
Immuno-histokjemi
Immuno-histokjemisk farging for RBMY antigen ble utført på frosne leversnitt. Etter antigen gjenfinning og bråkjøling av endogent peroksidering, ble kanin-anti-SRGY antistoff [24] inkubert med seksjoner ved 1:400 fortynning over natten ved 4 ° C. HRP-DAB ble brukt som et deteksjonssystem (R 0,05 ble ansett som statistisk signifikant, mens en
p
verdi mellom 0,05 og 0,1 ble ansett som å ha en tendens til forskjell
Resultater
RBMY knockdown redusert transformasjon og anti-apoptotiske effektiviteten av HepG2 celler
Grunnlegg uttrykt RBMY i menneskelig hepatoma cellelinje HepG2 ble forstyrret av shRNA spesielt rettet til SRGY domenet RBMY. Kvantitativ RT-PCR, viste at mer enn 95% av RBMY transkripter ble hemmet i pSUPER-680 og pSUPER-914 transfekterte HepG2-celler, mens pSUPER-778 hadde ingen knockdown virkning sammenlignet med vektor-transfiserte celler (figur 1A.). Immuno-histokjemi analyse ytterligere bekreftet effektiv knockdown av RBMY i pSUPER-680 og pSUPER-914 transfekterte celler (Fig. 1B). De vektor bare transfektanter uttrykt tilsvarende nivåer av RBMY forhold til foreldre HepG2 celler og ble derfor brukt som kontroller for
in vitro
celleforsøk.
(A) Kvantitativ RT-PCR analyse av RBMY i foreldre (G2), vektor plasmid (VC), pSUPER-680, pSUPER-778, og pSUPER-914 plasmider transfektert HepG2 celler. (B) Immuno-histokjemisk farging av HepG2 og de tilsvarende transfektanter for RBMY protein. (C) kolonidannelse av foreldre eller transfekterte HepG2 celler i bløt agar. (D) Prosent av celle levedyktighet ved MTT-analyse post 0.5 eller 0,75 mm hydrogenperoksid (H
2o
2) behandling. Resultatene ble angitt som middelverdi ± SD i fire uavhengige forsøk. *
p
0,05; **
p
. 0,01
Forankrings uavhengighet analysen viste at RBMY-uttrykker HepG2 celler hadde sterkere klonogene evne i forhold til RBMY knockdown celler (
p
0,0001, enveis ANOVA). Kolonien antall pSUPER-680 og pSUPER-914 transfekterte celler på soft agar ble redusert med 45% og 40%, henholdsvis, sammenlignet med tomme vektor transfektanter (Fig. 1C). Koloni dannelsen av RBMY-uttrykke pSUPER-778 transfektanter var også betydelig høyere enn knockdown transfektanter (680 vs 778,
p
0,0001; 914 vs 778,
p
= 0,001).
De anti-apoptotiske evner RBMY-uttrykke og knockdown HepG2 transfektanter ble analysert ved overlevelsesanalyse etter hydrogen peroxide behandling. Sammenlignet med tom vektor transfektanter, ble levedyktigheten til pSUPER-680 shRNA transfektanter med 0,5 eller 0,75 mM hydrogenperoksyd behandling redusert med 46% og 53% (
p
0,05), respektivt, og de av pSUPER- 914 transfektanter ble redusert med 34% og 54% (
p
0,05) henholdsvis (figur 1D.). Levedyktigheten til RBMY-uttrykkende transfektanter pSUPER-778 var 16-19% lavere enn for vektor transfektanter (
p
= 0,5).
RBMY knockdown øket ekspresjon av inhibitoriske androgen reseptor variant AR45 og redusert AR trans-aktivering aktivitet, mens RBMY overekspresjon trykkes AR45 nivåer
Det har blitt rapportert at Sam68, som et alternativ spleising regulator og samspill protein av RBMY, kan modulere AR-regulert transkripsjonen aktivitet i prostatakreftceller [ ,,,0],25]. For å undersøke om uttrykket forholdet mellom AR og dens hemmende isoform AR45 ble påvirket av RBMY, ble semi-kvantitativ RT-PCR utføres for RBMY-uttrykke eller knockdown HepG2 celler. Densitometry analyse viste en tredobling av AR45 nivåer i RBMY knockdown transfektanter (pSUPER-680 og pSUPER-914) sammenlignet med vektor bare (VC) transfektanter (
p
0,05) (Fig. 2A) . AR45 nivåer i foreldre HepG2 celler og pSUPER-778 transfektanter var lik de i vektor transfektanter. Det var ingen signifikant endring i AR nivåer mellom RBMY-uttrykke og knockdown celler. De AR /AR45 forhold i RBMY knockdown transfektanter (pSUPER-680 og pSUPER-914) ble redusert med 2 til 2,5 ganger i forhold til vektor bare (VC) transfektanter (Fig. 2A).
(A ) Semi-kvantitativ RT-PCR og densitometrisk analyse av RBMY, AR og AR45 i foreldre (G2), vektor plasmid (VC), pSUPER-680, pSUPER-778, og pSUPER-914 plasmider transfektert HepG2 celler. (B) Kvantitativ RT-PCR-analyse av RBMY, AR45, IGF-1 og IGFBP-3 i RBMY knockdown-transfektanter (680 og 914) og ikke-knockdown transfektanter (VC og 778). Verdier ble normalisert mot intern kontroll S26. Data er gjennomsnitts ± SD glende vektor kontroll (VC). (C) Kvantitativ RT-PCR analyse av AR og AR45 i vektor kontroll eller RBMY transfektert Hep3B og Huh7 celler. Data er gjennomsnitts ± SD glende vektor kontroll (VC). (D) Semi-kvantitativ RT-PCR-analyse av RBMY i tumoren (T) og ikke-tumor (N) deler av humane hann HCCs. S26 er en intern kontroll og alpha fetoprotein (AFP) som en svulst markør. (E) Immuno-histokjemisk farging av atom RBMY protein i HCC vev bare (× 400). (F) AR og AR45 mRNA-ekspresjon i 7 RBMY-uttrykkende og 5 ikke-uttrykkende humant hann HCC vev. Resultatene var gjennomsnittet av tre forskjellige eksperimenter. *
p
0,05; **
p
. 0,01
Som AR45 ble rapportert å undertrykke AR transaktivering aktivitet [13], et uttrykk for AR målgener IGF-1 og IGFBP-3 ble vurdert og sammenlignet mellom RBMY-uttrykke og knockdown HepG2 celler. Kvantitativ RT-PCR-analyse viste at RBMY knockdown celler uttrykte høye nivåer av AR45 men betydelig redusert IGF-1 (
p
0,05) og IGFBP-3 (
p
0,01) nivåer (fig. 2B), som viser at RBMY knockdown korrelert med forbedret AR45 uttrykk og undertrykt AR aktivitet.
Videre undertrykkelse av AR45 uttrykk med over-uttrykke RBMY ble også demonstrert i Hep3B og Huh7 celler. AR45 ble redusert til 42% i RBMY transfektert Hep3B og 60% i Huh7 celler (
p
0,05) (Fig. 2C). Det var ingen signifikant endring i AR nivåer mellom RBMY-transfektert og vektor-transfekterte celler.
RBMY uttrykk korrelert med redusert AR45 nivåer og kortere AR-CAG gjentar i menneskelig mannlige HCC vev
Basert på de ovenfor nevnte resultatene viser at RBMY ekspresjon ble forbundet med lavere AR45 nivåer i HepG2-celler, ble AR og AR45 uttrykk ytterligere sammenlignet i RBMY-uttrykkende og ikke-uttrykkende humant hann HCC vev. Semi-kvantitativ RT-PCR viste at RBMY ble påvist i 35% (23/66) hann HCC tumorvev, som ble bekreftet ved ekspresjon av tumor-markør alpha fetoprotein (fig. 2D). Immuno-histokjemisk farging bekreftet atom uttrykk for RBMY bare i HCC tumorvev (fig. 2E) sikret positiv rate på RBMY transkripsjoner var 36% (16/44) i HBV-relatert HCC, 40% (4/10) i HCV -relaterte HCC, 20% (1/5) i HBV /HCV-relaterte HCC, og 29% (2/7) ikke-viral relatert HCC. Det var ingen påvise RBMY transkripsjoner eller proteiner i de ikke-tumor deler av de 66 HCC leveren vev.
uttrykk for AR og AR45 variant i sju RBMY-uttrykke og fem ikke-uttrykk mannlige menneskelige HCC vev ble bestemt av 2exp
(- ΔΔCt) metode for relativ kvantifisering. MRNA-nivåer i HCC vev ble normalisert mot den innvendige styre S26 og sammenlignet med nivåene i vektor bare HepG2-transfektanter. ble påvist signifikant lavere nivåer av AR45 i RBMY-uttrykke mannlige HCC sammenlignet med ikke-RBMY uttrykker HCC vev (
p
0,05) (figur 2F.), noe som reflekterer RBMY undertrykkelse på AR45 transkripsjon. Det var ingen signifikant forskjell på AR nivåer mellom RBMY-uttrykke og ikke-uttrykke HCC vev.
For å vurdere sammenhengen mellom RBMY og AR aktivitet, CAG-repeat lengden på AR genet, en AR aktivitets- videre assosiert faktor, ble bestemt i RBMY-uttrykkende eller ikke-uttrykkende hannlige menneskelige HCC vev. Gjennomsnittlig CAG-repeat lengde på 49 HBV-relatert mannlig HCC vev (RBMY positive /negative = 17/32) var signifikant kortere i de med enn i de uten RBMY uttrykk (21,0 ± 2,8 vs. 22,9 ± 2,8,
p
0,05). Foreningen for CAG-repeat lengde og RBMY uttrykk avdekket en trend av forskjell (21,4 ± 2,54 vs. 22,7 ± 2,75,
p
= 0,064) når ikke-HBV HCC vev ble inkludert (RBMY positive /negative = 23 /43).
RBMY transgene mus utviklet lever fet endring og neoplastiske lesjoner
Transgene mus med leverspesifikke uttrykk for RBMY ble etablert (fig. 3A). Western blot viste lav RBMY uttrykk i transgene stifter RF1 og RF2, men høy RBMY nivå i RF4 og RF6 (Fig. 3B). Det var ingen transgen RBMY påvist i hjerne, hjerte, nyre, lunge, milt, mage, eller testikkel ved RT-PCR (fig. 3C), som indikerer en leverspesifikk ekspresjon av RBMY i transgene mus. Kvantitativ RT-PCR resultatene ytterligere støttet RF4 som en høy uttrykk grunnlegger (Fig. 3D). IHC-farging viste at RBMY er hovedsakelig lokalisert i kjernen av transgene mus leveren vev (fig. 3E).
(A) genetisk kart av den 4,2 kb RBMY transgenet, inkludert en hepatisk locus kontrollregion fra apolipoprotein-E- gen (ApoE-HCR), lever-spesifikke α1-antitrypsin-promoter (haat-Pr), avkortet faktor IX intron (hFIX-IA), og bovint veksthormon polyadenyleringssignal (bghpA). (B) Western blot analyse av RBMY tilberedt av de lever av individuelle transgene (RF1-6, RF2-265, RF4-89, RF6) og kontroll (NT1, NT2) mus. (C) Liver-spesifikk ekspresjon av RBMY i transgene mus ved RT-PCR ved anvendelse av GAPDH som en intern kontroll. Reaksjoner uten mal RNA (RTC) eller cDNA (NTC) var negative kontroller. (D) Uttrykk for RBMY i transgen (RF1-176, RF1-278, RF2-62, RF2-390, RF4-19, RF4-21) og kontroll (NT1, NT2) mus ved kvantitativ RT-PCR. (E) Immuno-histokjemisk farging av transgene (RF4-89) og kontroll (NT) mus leveren vev for RBMY. Transgen mus viste atom farging for RBMY (× 400). (F) Olje røde flekker viste lever fet endringer i kontrollmusene (NT1 og NT2), lav RBMY (RF2-62 og RF2-390) og høy RBMY (RF4-19 og RF4-21) transgene mus (× 400).
hepatocellulære endringer ble analysert fra lever deler av 79 transgene mus og 30 kontroll FVB /N mus. Høye RBMY-uttrykke RF4 grunnleggere (RF4-19 og RF4-21) vises mer alvorlig fatty innskudd enn lave RBMY-uttrykke RF2 grunnleggere (RF2-62 og RF2-390) (Fig. 3F). I RBMY transgene mus var forekomsten av utvikling av moderat til alvorlig hepatisk steatose var 60-89% (gjennomsnitt 73%), som ble ~2.5 ganger høyere enn den for kontrollgruppen (gjennomsnittlig 30%,
p
0,001) (tabell 1). RBMY uttrykk økte ikke fibrose eller cirrhose i transgene mus modell.
Blant de 45 transgene mus som var eldre enn 15 måneder, tre av dem utviklet lever til kreft (tabell 1). En knute (1 mm i diameter) ble funnet i den høyre flik av RF1-278 mus (15 måneder) og histologisk undersøkelse avslørte en pre-neoplastisk lesjon (Fig. 4A-C). Den RF4-21 mus (24 måneder) hadde en adenom nodul (4 mm i diameter) i den høyre lapp (fig. 4D-F), mens RF2-390 (21 måneder) hadde moderat differensierte HCC (6 mm i diameter) i median lapp (fig. 4G-I). ble observert middels til alvorlig fett endringer i tumor deler av de tre mus. Ingen av 17 kontrollmusene som er eldre enn 15 måneder utviklet lever til kreft.
(A-C) Pre-neoplastisk lesjon i en 15 måneder gammel hannmus RF1-278. (D-F) Adenom (AD) i en 24-måneder gamle hunnmus RF4-21. (G-I) HCC i en 21-måneder gamle hannmus RF2-390. Forstørrelse: B, E, H, × 50; C, F, I, × 200.
RBMY akselerert dietyl nitrosamin-indusert hepatocarcinogenesis
De kreftfremmende effekten av RBMY ble videre undersøkt i den kjemiske kreft modell. På grunn av den høye følsomheten i hannmus til DEN, ble mannlige grupper ofret på 14 uker etter behandling. En høyere forekomst av cancerøse lesjoner ble observert i transgene hannmus i forhold til den i kontrollgruppen (12/14 versus 5/12,
p
0,05). På 34 uker etter behandling, mannlig RBMY transgene mus utviklet flere svulster med diameter 3 mm sammenlignet med kontrollgruppen (52 vs. 19,
p
0,05) (tabell 2). Det var også en høyere forekomst av trabekulære til kreft i kvinnelige transgene mus sammenlignet med kontrollgruppen på 26 uker (7/9 vs 1/10,
p
0,01) og 34 uker (9/10 vs 3/13,
p
. 0,01) etter DEN behandling (tabell 2)
Diskusjoner
RBMY regnes som en testikkel-spesifikk skjøting faktor i spermatogenesis [22], [23]. Det har blitt rapportert å bli uttrykt i mer enn en tredjedel av humane hann HCC vev [24]. Denne studien viser videre at RBMY knockdown korrelerer med økt AR45 variant uttrykk og redusert forankringsuavhengig vekst og anti-apoptotiske evner av menneskelig hepatoma cellelinje HepG2. AR45 isoform er rapportert å virke som en dominant-negativ inhibitor for AR funksjon gjennom dannelsen av AR-AR45 heterodimerer [13]. Vi viser også at RBMY knockdown reduserer AR-transaktiveringsaktivitet i HepG2-celler. Derfor kan RBMY fungere som en mannlig-spesifikk onkogen og øke risikoen for menneskelige mannlige hepatocarcinogenesis gjennom regulering av AR genekspresjon og aktivitet.
AR genet, snarere enn androgen, har vist seg å spille en nøkkelrolle i den mannlige overvekt av HCC i en transgen musemodell HBV [17]. Humant AR er sammensatt av N-terminale trans domene, en sentral DNA-bindende domene og et C-terminale ligandbindende domene. AR45, en naturlig forekommende variant form av human androgen receptor, mangler den N-terminale domene som kreves for full ligand aktivert transkripsjonen aktivitet [13]. Den inverse sammenslutning av AR og AR45 uttrykk har blitt observert i menneskelige hjerte og muskler med de høyeste nivåene av AR45 og de laveste nivåene av AR [13]. I denne studien RBMY knockdown øker uttrykk av AR45 i menneskelig hepatoma HepG2 cellelinje, mens RBMY overekspresjon reduserer AR45 nivåer i Hep3B og Huh7 cellelinjer. Videre RBMY-positive menneskelige mannlige HCC vev uttrykker lavere AR45 nivåer sammenlignet med RBMY-negative HCC. Nedregulering av AR målgener IGF-1 og IGFBP-3 i RBMY knockdown HepG2 celler illustrerer videre den forsterke effekten av RBMY på AR-transaktiveringsaktivitet. HBV X-proteinet har blitt rapportert å virke som et virus som koder for AR ko-aktivator som i betydelig grad bidrar til den mannlige overvekt av HBV-relaterte humane HCC [16]. Men det kan ikke forklare kjønnsforskjeller av ikke-HBV-relaterte HCC. Lignende forhold på RBMY ekspresjon i HBV-relaterte, HCV-relatert, og ikke-viral-relaterte hann HCCs antyder at RBMY kan være en felles risikofaktor økende hann mottakelighet for leverkreft. Våre funn tilveiebringe en ny mekanisme for å tolke den mannlige overvekt i alle typer av leverkreft gjennom Y-kromosom-spesifikke RBMY genet.
AR45-spesifikke exon 1B ligger mellom den første og andre exon av AR-genet. To hypotetiske reguleringsmekanismer for AR45 syntese er blitt foreslått, blant annet en transkripsjonen kontroll av en ny promoter oppstrøms for exon 1B eller et alternativ spleising arrangement [13]. RBMY fungerer som en testikkel-spesifikk skjøting regulator og velig samhandler med RNA-bindende protein Sam68 i testiklene [26]. Sam68 er et allestedsnærværende spleising regulator og også en nedstrøms mål for Src-signalveien [28], [29]. Det er så langt uklart hvorvidt RBMY enten direkte regulerer AR45 transkripsjon /spleising eller via samspill med Sam68. I tillegg er Sam68 ansett som en AR ko-aktivator som det kan modulere transkripsjonen aktivitet AR i prostata cancer [25]. Src-signalveien har også vist seg å være kritisk for HBV-X-protein-medierte økning av AR funksjon [30]. Enten RBMY er involvert i Sam68-mediert Src signalveien er en interessant sak å bli studert i fremtiden.
onkogenisitet av RBMY har blitt vist av transformasjonen av musfibroblastcellelinje NIH3T3 [24]. Denne studien viser videre at RBMY forbedrer leveren kreft
in vivo
i en transgen musemodell. De rapporterte spontan leveren tumor vekstratene er 3% og 0% i 24 måneder gamle mannlige og kvinnelige villtype FVB /N mus, henholdsvis [31]. RBMY transgene mus utviklet leversvulster hos 8,7% (2/23) av mannlige og 4,5% (1/22) av hunnmus eldre enn 15 måneder, som er mer enn to ganger høyere enn den spontane leveren kreft hendelser.
i modellen av dEN-indusert hepatocarcinogenesis, er betydningen av RBMY fremmende effekt på kreft lesjon formasjonen observert så tidlig som 14 uker etter behandling hos mannlige transgene mus. I tillegg større svulster (diameter ≥3 mm) utviklet i transgene hannmus på 34 uker, noe som indikerer RBMY forbedring på DEN-indusert hepatocarcinogenesis. Selv kvinnelige RBMY transgene mus har også betydelig økt forekomst av kreft lesjoner på både 26 og 34 uker etter behandling. Selv om villtype hunn-mus er resistente overfor DEN carcinogenese på grunn av den beskyttende virkningen av østrogen-mediert inhibering av IL-6-produksjon av Kupffer-celler [32], [33], resultatene her demonstrerer levering og aktivering av en hann-spesifikk RBMY genet akselerert leverkreft utvikling selv i kvinnelige transgene mus.
i konklusjonen, utløser RBMY knockdown hemmende effekter på transformasjon og anti-apoptotiske evner av menneske hepatoma cellelinje HepG2. Den inhiberende virkning av RBMY på AR45 nivåer er demonstrert i RBMY knockdown HepG2-celler og RBMY over-uttrykker Hep3B og Huh7 celler. Derfor kan den onkogene mekanismen for RBMY være knyttet til reguleringen av AR-transaktiveringsaktivitet ved økningen av AR45 variant, den hemmer av AR. AR45 uttrykk påvist i RBMY-uttrykke menneskelige mannlige HCC er også betydelig lavere sammenlignet med ikke-uttrykke HCC vev. Videre oppviser RBMY tumor-fremmende aktivitet
in vivo
i en transgen mus modell og akselererer utviklingen av neoplastiske lesjoner i et diethylnitrosamine-indusert hepatocarcinogenesis dyremodell. Den kreftfremkallende effekt i hepatoma cellelinje og menneske HCC vev, sammen med
in vivo
tumorvekst i de transgene mus, gir en ny rolle RBMY som en mannlig-spesifikk onkogen å forklare den mannlige dominansen av leverkreft.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Primer sekvenser i shRNA plasmid konstruksjon, semi-kvantitativ og real-time RT-PCR.
