Abstract
Mål
I denne studien utforsket vi bruk av mekanisk høy intensitet fokusert ultralyd (M-HIFU) som en neo-adjuvant behandling før kirurgisk reseksjon av primærtumor . Vi har også undersøkt hvilken rolle signal svinger og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3) i M-HIFU fremkalte anti-tumor immunrespons ved hjelp av en transplantasjon svulst modell av prostatakreft.
Metoder
RM 9, en mus prostatakreft-cellelinje med konstitutivt aktivert STAT3, ble inokulert subkutant i C57BL /6J mus. De tumor-bærende mus (med en maksimal diameter på tumor 5~6 mm) ble behandlet med M-hifu eller sham eksponering to dager før kirurgisk fjerning av den primære tumoren. Etter gjenvinning, hvis ingen tumorresidiv ble observert i 30 dager, ble tumor ytterligere behandling utført. Veksten i de gjenopptok behandlingen svulst, overlevelse og anti-tumor immunrespons av dyret ble evaluert.
Resultater
Det ble ikke observert tumorresidiv og fjernmetastaser i begge behandlingsgrupper som benytter M-HIFU + kirurgi og kirurgi alene. Men sammenlignet med kirurgi alene, M-hifu i kombinasjon med kirurgi ble funnet å hemme veksten av reintroduksjon tumorer, nedregulerer intra-tumoral STAT3 aktivitet, øke cytotoksiske T-celler i miltene og tumordrenerende lymfeknuter (TDLNs), og forbedre verten overlevelse. Videre ble M-HIFU kombinert med kirurgi funnet å betydelig redusere nivået av immunsuppresjon med samtidig økt antall og virksomhet dendrittiske celler, sammenlignet med kirurgi alene.
Konklusjon
Våre resultater viser at M -HIFU kan hemme Stat3 aktiviteter, og kombinert synergi med kirurgi, kan gi en ny og lovende strategi for behandling av prostatakreft
Citation. Huang X, Yuan F, Liang M, Lo HW, Shinohara ML , Robertson C, et al. (2012) M-HIFU hemmer tumorvekst, Undertrykker STAT3 Aktivitet og Forbedrer Tumor spesifikk immunitet i en Transplant Tumor Model av prostatakreft. PLoS ONE syv (7): e41632. doi: 10,1371 /journal.pone.0041632
Redaktør: Mitsunobu R. Kano, University of Tokyo, Japan
mottatt: 24 februar 2012; Godkjent: 22 juni 2012; Publisert: 24.07.2012
Copyright: © 2012 Huang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av National Institutes of Health gjennom tilskuddet #: 5R21CA135221-02 (https://www.nih.gov/), med en prostatakreft Pre-SPORE stipend fra Duke Comprehensive Cancer Center, med en bevilgning fra DoD ( PC100266), av en bevilgning fra bekymring Foundation, og ved en bevilgning fra Morris Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den vanligste kreftformen hos menn med ca 230 000 tilfeller diagnostisert hvert år i USA [1]. Blant ulike behandlingsstrategier som brukes klinisk, prostectomy forblir den første helbredende alternativ for pasienter med prostatakreft [2], [3]. Imidlertid er kirurgi ikke er egnet for behandling av fjernmetastaser, og blir således ofte anvendt i konsert med stråling og /eller kjemoterapi hos pasienter med avansert prostatakreft. Mens stråling og kjemoterapi etter kirurgi er ofte nyttig, kan de ikke være aktuelt for alle pasienter, avhengig av kreft stadium og pasientens toleranse. I tillegg er tilstedeværelsen av blod-prostata barrieren hindrer levering av kjemoterapeutiske midler til prostata kreftceller [4]. Enda viktigere, den lave spesifisitet av stråling og kjemoterapi i målretting kreftceller ofte føre til betydelige bivirkninger. Derfor er det meget ønskelig å kombinere kirurgi med et lokalt målrettet terapi, for eksempel høy intensitet fokusert ultralyd (hifu, også kjent som høy-intensitet terapeutisk ultralyd, hitu) som er godt tolerert av pasienter, for å utrydde primærtumor og samtidig gi fordelen i å undertrykke svulst tilbakefall og fjernmetastaser.
i det siste tiåret, HIFU har dukket opp som en lovende ikke-invasiv behandling modalitet for lokaliserte godartede og ondartede solide tumorer [5]. Omfattende dyre- og kliniske studier har vist at HIFU er godt egnet for termisk ablasjon av lokaliserte tidlig stadium tumorer og for berging behandling etter tidligere behandlingssvikt ved stråling eller kjemoterapi [6] – [8]. Ved å fokusere en høy intensitet ultralydstrålen på et veldefinert område inne i en pasient, kan den konvergerende akustiske energi bli absorbert av målet tumorvevet, noe som resulterer i en hurtig temperaturstigning over 65 ° C i noen få sekunder, noe som fører til koagulative cellenekrose [9] – [11]. Dessuten, når hifu blir brukt i en pulset modus med lav duty cycle (mindre enn 2%) gjennom en prosess kjent som mekanisk hifu (M-hifu), kan den produsere ikke-termisk, mekanisk skade på tumorvevet via akustisk kavitasjon [ ,,,0],12]. Disse egenskapene gjør hifu en iboende ikke-invasiv, ikke-ioniserende terapi som er generelt godt tolerert av pasienter. I motsetning til stråling og kjemoterapi, kan hifu behandling administreres gjentatte ganger uten å øke risikoen for systemisk toksisitet [5].
I tillegg til termisk ablasjon av tumorvev, hifu har vist seg å utløse en anti-tumor immunrespons både i mus som bærer neuroblastom [9] og hos pasienter med sene stadier av faste tumorer [13]. Det har blitt foreslått at hifu-ablateres tumor avfall og rester av tumorassosierte antigener kan stimulere dendrittiske celler (DCS) og påfølgende T-celleaktivering, som fører til utvikling av anti-tumor immunresponser [14], [15]. Denne hypotesen støttes av flere kliniske studier som viser økt lymfocytt cytotoksisitet, bedre overlevelse og redusert tumorresidiv og fjernmetastaser [16].
Sammenlignet med konvensjonelle HIFU som er avhengig primært på termisk ablasjon, vi har vist tidligere at M-HIFU kan indusere sterkere frigjøring av endogene faresignalene [17], forbedre DC og cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) aktiviteter [12] med redusert fjernmetastaser [18]. Til tross for disse oppmuntrende observasjoner, er det totale anti-tumor immunrespons fremkalt ved hifu fremdeles utilstrekkelig, antagelig på grunn av immuntoleranse utviklet i løpet tumorigenesis [19], i hvilket signal transduser og aktivator av transkripsjon 3 (STAT3) er blitt vist å spille en kritisk rolle [20] – [22]. STAT3 er kjent for å bli aktivert av immunundertrykkende cytokiner som IL-10, noe som i sin tur kan ytterligere øke ekspresjon av IL-10. I tillegg aktivert STAT3 (p-STAT3 /Y705) hemmer ekspresjon av pro-inflammatoriske cytokiner så som IL-12 [23] og induserer ekspresjon av foxp3, en vesentlig transkripsjonsfaktor for regulatoriske T-celler (treg) utvikling [24] . Selv STAT3 har vist seg å spille en sentral rolle i tumordannelse og immuntoleranse, dens rolle i M-HIFU fremkalte anti-tumorresponser er ikke undersøkt.
I denne studien har vi utforsket strategien med å bruke M -HIFU som en neo-adjuvant behandling før kirurgisk reseksjon av primær prostata svulst å vurdere virkningene av denne romanen kombinasjonsbehandling på tumor lokalt tilbakefall og fjernmetastaser. Spesielt har vi fokusert på rollen STAT3 i moduler HIFU-indusert anti-tumor immunresponser. Våre resultater viser at, sammenlignet med kirurgi alene, kan en kombinasjon av M-hifu og kirurgi i betydelig grad hemme tumor gjentakelse, undertrykke veksten av tumorer eksponeres samtidig forbedre overlevelse. Videre ble disse observasjonene bekreftes av redusert p-STAT3 aktivitet med samtidig økt anti-tumorrespons. Til sammen våre resultater tyder på at M-HIFU i kombinasjon med kirurgi kan gi en ny terapeutisk alternativ i forvaltningen av prostatakreft.
Resultater
M-HIFU desintegrerer RM-9 tumorvev, hemmer tumor Vekst, og Forbedrer Host Survival
Figur 1A viser representative B-mode ultralyd bilder av RM-9 svulst under M-HIFU behandling. Fokus for HIFU svinger ble markert med et kors symbol. M-HIFU behandling ble startet på midten og kommet med 1 mm skritt mot svulsten grensen. En sikkerhetsmargin på minst 1 mm ble brukt under HIFU behandling for å unngå skade på tilstøtende hud, muskel og ben. Etter hver eksponering, kan en lysende flekk av hyperechogenicity observeres (angitt ved piler i de øvre paneler), svarende til produksjonen av treghets kavitasjonsbobler i tumorvevet [12]. Fordi pulset HIFU med en lav driftssyklus på 2% ble anvendt i M-hifu, den resulterende temperatur i tumorvevet var mindre enn 45 ° C etter en 20-s eksponering. Derfor termiske effekten var ubetydelig. Undersøkelse av skåret tumorvev avslørt oppløsningen av svulstvev og dannelse av hulrom som er karakteristiske for mekanisk lyse produsert av treghet bobler i HIFU behandlet regionen (panel i figur 1A nederst til høyre).
A,
ultralydavbildning guidet M-HIFU behandling. Kavitasjon aktivitetene indusert av M-hifu i tumorvevet er vist i regioner med hyperechogenicity, angitt ved piler i de B-mode-bilder (øvre panel) og i det utskårede tumorer (nedre panel Venstre:. Hud på toppen av svulsten var intakt etter M-HIFU behandling, midten: fjernet svulst viser intakt ytre overflaten etter M-HIFU behandling, riktig. bisected tumor viser mekaniske lesjoner i indre regionen etter M-HIFU behandling
B
, tumor vekstkurve post reintroduksjon . 2 × 10
4 RM-9 celler ble subkutant injisert i det kontralaterale bakbenet 30 dager etter at M-HIFU behandling når musene ble fullt restituert fra kirurgisk reseksjon av primærtumor. Volum av de gjenopptok behandlingen svulster ble beregnet basert på caliper målinger av tumorstørrelse på 3-dagers intervaller med start fra dag 7 etter svulst reintroduksjon * p. 0,05, ** p .. 0,01
C, etter Akkumulert overlevelse kurven følgende svulst reintroduksjon Mus som når humane endepunktet avlivet. det var 10 mus i kirurgi-gruppen og 12 i den HIFU + kirurgi gruppe. P-verdi på 0,019 ble bestemt ved log-rank test. Data ble hentet fra tre uavhengige eksperimenter.
To dager etter at M-HIFU behandling, de primære svulster ble resected fra mus i begge grupper. Denne tidsforsinkelse ble valgt basert på vår forrige observasjon at M-HIFU 2 dager før kirurgisk reseksjon av primærtumor kan redusere risikoen for fjernmetastaser i en murine melanoma modell [18]. Oppfølging observasjon i løpet av de neste 30 dagene viste ingen lokal svulst tilbakefall, antagelig som et resultat av den strenge og omfattende fjerning av tumorvev ved kirurgi. På denne tiden ble svulst reintroduksjon utført og fremveksten av de gjenopptok behandlingen svulster ble fulgt opp i ytterligere 30 dager. Som vist i figur 1B, er det et klart skille i vekstkurver med reintroduksjon svulster i M-HIFU + kirurgi gruppen betydelig mindre enn de som brukes i kirurgi gruppen. Vesentlige forskjeller i tumorvolumet mellom de to gruppene ble observert fra dag 10 til slutten av følgende periode.
Etter reintroduksjon, ingen dyr døde. Musene med reintroduksjon svulster ble bare ofret når de humane endepunkter for tumorvekst ble nådd. Lungevev ble høstet og undersøkt under et mikroskop disseksjon, men ingen metastatisk nodul ble observert. Når operasjonen ble utført, ble RM-9 tumorknuter seg å være godt omgitt av en kapsel av bindevev, noe som indikerer en mulig årsak for fraværet av fjernmetastaser. Den kumulative overlevelse i M-HIFU + kirurgi gruppen ble funnet å være statistisk høyere enn i den kirurgi gruppen (figur 1C), som indikerer en potensiell tumor undertrykkende effekt av M-hifu i kombinasjon med kirurgisk fjerning av den primære tumoren.
Prostate Cancer RM-9 Cells konstitutivt Express p-Stat3, som kan reduseres ved M-HIFU behandling
Phospho-STAT3 (Y705), den aktiverte form av STAT3, spiller en nøkkelrolle i å få fram immunovervåkning, tumorutvikling og tumor-metastase [20], [22], [25]. Derfor hemme eller rive aktiv STAT3 er av interesse for både direkte anti-svulst behandling og tumor spesifikke immunterapi. Før belyse rollen til M-hifu på STAT3 aktivering, undersøkte vi flere tumorcellelinjer for STAT3 aktivitet og funnet at et høyt nivå av p-STAT3 ble uttrykt i RM-9-celler. Som vist ved IF farging og fluorescens mikroskopi (figur 2A), ble nesten alt av de RM-9 celler farget positivt for p-STAT3, som indikert av den rosa fusjonerte signaler (piler). Dette
in vitro
observasjonen ble ytterligere bekreftet
in vivo
. Som vist i figur 2B, undersøkte vi RM-9 tumorer høstet ved tre forskjellige tidspunkter (10-, 15-, og 20-dager) etter inokulasjon for p-STAT3 ved hjelp av IHC og resultatene tyder på konstitutiv aktivering STAT3 i RM-9 tumorer i løpet av de 20 dager av tumorutvikling. Disse observasjonene indikerer også at RM-9 celler og svulster er ideelle for å undersøke effekten av M-HIFU på STAT3 aktivitet.
A, etter Expression of p-STAT3 i RM-9 celler. RM-9-celler ble utsatt for IF farging for p-STAT3 og DAPI farging for kjerner. Under fluorescerende mikroskopi, ble p-STAT3 merket med rød fluorescens mens kjerner ble merket med blå signaler. De p-STAT3-positive kjerner ble angitt med sammenslåtte rosa signaler. Heltrukne piler peker på representative p-STAT3-positive kjerner, mens den stiplede pilen markerer en p-STAT3-negativ kjernen.
B, etter Ekspresjon mønster av p-STAT3
in vivo. Hoteller, RM-9 tumorer ble fjernet ved tre forskjellige utviklings tidspunkter som er angitt og utsatt for IHC-farging for p-STAT3. Etter kontra av hematoxylin, ble p-STAT3-positive kjerner angitt med mørke brune signaler (piler), mens p-Stat3-negative kjerner var i blått.
C, etter Redusert p-Stat3 nivåer i RM-9 svulster etter M-HIFU behandling. To dager etter at M-HIFU behandling, ble RM-9 svulster fjernet og utsatt for IHC farging for p-STAT3. Tre svulster i hver gruppe ble analysert og de representative tall vises. IHC ble uavhengig gjennomført tre ganger. Dataene ble presentert som gjennomsnitt ± SD. Studentens
t
-test ble utført for å bestemme p-verdier. * P 0,05.
D, etter Expression nedregulering av tre Stat3 nedstrøms målgener av M-HIFU behandling. To dager etter M-HIFU behandling, RM-9 svulster ble fjernet og mRNA ble isolert. RT-PCR ble deretter utført for å påvise nivåer av cyklin D1, Bcl-xL, IL-10 og β-aktin. Band signaler ble kvantifisert ved hjelp av NIH ImageJ programvare. Representative bilder fra tre uavhengige eksperimenter er vist.
Deretter vurderte vi effekten av M-HIFU på STAT3 aktivering ved hjelp av RM-9 tumorbærende mus. To dager etter M-HIFU-behandling, ble RM-9 tumorer fjernet fra musene og underkastet p-STAT3 IHC (n = 3 per gruppe). Som vist i figur 2C, ble p-STAT3 nivå signifikant redusert med 1,8-fold følgende M-hifu, noe som indikerer at administrering av M-hifu effektivt kan hemme STAT3 aktivering i RM-9 tumorer. Videre, i samsvar med den observerte reduksjon av p-STAT3 av M-hifu, ekspresjonsnivåene av tre STAT3 målgener ble signifikant redusert ved M-hifu så vel som indikert ved resultatene av RT-PCR i Figur 2D. Til sammen disse resultatene viser at STAT3 aktivering kan påvises i RM-9 prostatakreftceller
in vitro Hotell og
in vivo, etter og at M-HIFU reduserer nivåene av STAT3 aktivering og STAT3- målrettede gener i RM-9 svulster.
M-HIFU øker tumor-spesifikke cytotoksisitet
for å undersøke om M-HIFU behandling resulterer i økningen av CTL responser [26], vi analysert endring i hyppigheten av CD8
+ T-celler og deres IFN-γ produksjon, både i M-HIFU + kirurgi gruppe og i kirurgi alene gruppen. Vi fant ut at 2 dager etter inngrepet antall CD8
+ T-celle ble økt i M-HIFU + kirurgi gruppen (figur 3A og B), sammenlignet med gruppen som hadde kirurgi alene. Tumor-spesifikke IFN-γ produksjon i de tumorbærende verter ble ytterligere bekreftet ved ELISPOT-analyse. Splenocytter ble høstet 12 dager etter inngrepet fra tre mus pr gruppe, og prøvene ble slått sammen og ko-dyrket med enten RM-9 eller irrelevante EL-4 tumorceller (splenocytter sammenlignet med tumorceller på 10:01 forhold), og deretter analysert for å bestemme IFN-γ produksjon. M-HIFU behandling økte betydelig IFN-γ produserende CTL til 4 ganger av det ikke-HIFU kontroll (p 0,001) (figur 3C, D). Denne forhøyede respons ble ikke observert i EL-4-celler, noe som indikerer at IFN-γ produksjon var RM-9 tumorspesifikke av den tumorbærende vert. Disse resultater antyder at M-hifu behandling kan fremme dannelse av IFN-γ produserende CTL, en av de mest kritiske faktorer i anti-tumor-immunitet.
A,
2 dager etter behandling, milter fra tre mus behandlet med og uten M-hifu ble samlet og slått sammen. Andelen av milten CD8
+ T-celler ble bestemt ved flow-cytometri. Representative resultater fra tre uavhengige eksperimenter er vist.
B, etter Statistisk signifikant økning av CD8
+ celle befolkningen ved å kombinere HIFU med kirurgi. * P 0,05
C
, Tolv dager etter kirurgi eller M-hifu plus kirurgi behandling, tre mus fra hver gruppe ble avlivet, og deres milter ble samlet og slått sammen. IFN-γ ELISPOT-analyse ble utført med de samlede splenocytter. Mitomycin-C-behandlede RM-9-celler ble tilsatt som stimulatorer på forholdet 1:10 (RM9: splenocytter). EL-4-celler ble anvendt som et irrelevant cellekontroll. Representative resultater fra tre uavhengige eksperimenter er vist.
D
, Bestemmelse av IFN-y-positive celler og, og statistisk analyse basert på ELISPOT-analysen resultater. *** P. 0,0001
M-HIFU behandling Øker befolkning på CTL og DC i Milter og TDLNs
DC er den eneste profesjonelle antigenpresenterende celler som kan prime naive T-celler, og spiller en viktig rolle i generering av tumor-spesifikk CTL. DC kan identifiseres med ekspresjonen av CD11c som en celleoverflatemarkør. Siden p-STAT3 er en sentral suppressor av DC aktivisering [27], [28], vi evaluert hyppigheten av CD11c
+ cellepopulasjonen i milten og TDLNs 6 dager etter M-HIFU behandling i mus med RM-9 transplantert svulster . Som vist i figur 4A til 4D, andelene av CD11c
+ celler ble signifikant økt i milter og TDLNs til mer enn tre ganger og 1,2-ganger av kontrollgruppen uten hifu behandling, henholdsvis (i begge tilfeller er p 0,001 ). Vi evaluerte også andelen av CD11c
+ cellene ved det tidspunkt på 2 dager etter M-HIFU-behandling, men det viste seg å være for tidlig å observere en økning av populasjonen DC (data ikke vist). I tillegg M-HIFU behandling forbedret uttrykk for co-stimulerende molekyl, CD80 og CD86, på DCs (Figur 4E og 4F). Kollektivt, vises M-hifu behandling for å forbedre rekruttering og /eller utvidelse av DC, i tillegg til DC modning.
Tre mus fra hver gruppe ble avlivet seks dager etter kirurgi eller kirurgi hifu pluss behandling. Enkeltcellesuspensjon ble fremstilt fra de sammenslåtte milt eller TDLNs; og CD11c
+-cellepopulasjonen ble bestemt ved flow-cytometri. Representative resultater fra tre uavhengige eksperimenter er vist.
En
,
C
, Representasjonsstrømningsmønster i å oppdage CD11c
+ celler i milten (
A
) og TDLNs (
C
).
B
,
D
, Statistisk signifikans i økningen av DC befolkningen i milt (
B
) og TDLNs (
D
) basert på resultatene av
A Hotell og
C, etter henholdsvis.
E
,
F
, Evaluering av DC stimulering ved å påvise CD80-positive (
E
) og CD86-positive (
F
) CD11c
+ celler i milten og TDLNs. * P 0,05, *** p. 0,0001
M-HIFU Enhanced Anti-tumor Response er delvis forårsaket av bekjempelse av treg Cell Generation
STAT3 også spiller en viktig rolle i å forbedre utviklingen av CD4
+ regulatoriske T-celler (Tregs) [24]. Tregs inhibere immunresponser og har vært implisert i å indusere toleranse i anti-tumor-immunitet. Her søkte vi å finne ut om M-HIFU behandling undertrykker generasjon eller utvidelse av Tregs i tumor transplantert mus. Splenocytter og TDLNs Cellene ble høstet 6 dager etter M-hifu behandling som tidligere nevnt for å evaluere hyppigheten av Tregs. Resultatet er vist i figur 5 avslørte at M-HIFU behandling utløste en betydelig nedgang i Treg befolkning med ca 50% i milten (p 0,001), og ca 10% i TDLNs (p 0,001). Ligner på observasjon fra DC, endringer i Treg befolkningen var ikke signifikant to dager etter M-HIFU-behandling (data ikke vist). Disse resultater indikerer at, i tillegg til å utvide DC befolkning og økende DC modning, M-hifu behandling redusert populasjonsstørrelse av Tregs, som er kjent for å ned-regulere utviklingen av anti-tumor-immunitet.
enkelcelle suspensjon ble fremstilt fra de sammenslåtte milt eller TDLNs. Befolkningen i CD4
+ foxp3
+ celler ble deretter bestemt som treg ved flowcytometri. Tallene viste er representanter fra tre uavhengige farging og etterfølgende strømningsanalyse.
En
,
C
, Representasjonsstrømningsmønster i å oppdage Tregs i milten (
A
) og TDLNs (
C
).
B
,
D
, Andel av treg befolkningen i milt (
B
) og TDLN (
D
) basert på resultatene vist i
En
og
C
, henholdsvis. ** P 0,01, *** p. 0,0001
Diskusjoner
Denne undersøkelsen ble gjennomført for å få en bedre forståelse av de mekanismer som M-HIFU utløser anti- svulst effekter og å utforske strategier for optimal bruk av M-HIFU i prostata kreft behandling. Vårt langsiktige mål er å etablere begrunnelser for bruk av M-HIFU basert kombinasjonsbehandling som en forbedret behandling modalitet for prostatakreftpasienter. Total, våre resultater tyder på at M-hifu kan hemme STAT3 aktivering, noe som fører til en anti-tumorrespons gjennom to mulige mekanismer. Først reduksjon av p-STAT3 i tumorene hemmer direkte tumorvekst. For det andre, en reduksjon i STAT3 aktivitet fører til et økt antall tumor-spesifikke CTL og DC, så vel som et redusert antall treg, og deretter en forsterkning av anti-tumorimmunitet.
konstitutiv aktivering av STAT3 er hyppig observert i mange humane tumorer, inkludert melanom, brystkreft, hode og nakke kreft, glioma og prostata kreft [20], [22], [25]. Det er vel kjent at vedvarende aktivert STAT3 fungerer som en viktig regulator av molekylære og biologiske hendelser som fremmer tumorigenesis [29]. Avvikende STAT3 aktivitet spiller en sentral rolle i feilregulert vekst og overlevelse av kreftceller, samt å fremme angiogenese. Videre fremmer avvik STAT3 invasjon og metastase, og dermed bidra til tumorprogresjon [20], [22], [30]. I løpet av tumorgenese, aktiviteten av STAT3 også forhøyet i tumorassosierte lymfocytter [31], [32]. Inhibering STAT3 i enten tumorceller eller tumor-infiltrerende myeloide celler fremkaller Th1 anti-tumor immunresponser, samtidig med et økt antall CTL og redusert Tregs [33]. Således undertrykker aktivering av STAT3 ved fysisk (
det vil si, etter hifu) eller farmakologiske metodene er av stor interesse for både direkte anti-tumor behandling og tumorspesifikke immunterapi.
Med utgangspunkt i den forannevnte forståelse om STAT3, søkte vi å bestemme effekten av M-HIFU på STAT3 aktivering i en
in vivo
transplantasjon modell av prostatakreft. Faktisk, nivået av intratumoral p-STAT3 ble betydelig redusert ved behandlingen av M-hifu. I en tidligere studie av B16 melanom transplantasjon modell, ble p-STAT3 nivå også funnet å være signifikant nedregulert av M-HIFU behandling [34], noe som tyder på effekten av M-HIFU på STAT3 aktivisering kan være vanlig blant ulike svulster.
funksjonell nedregulering av p-STAT3 ble ytterligere bekreftet ved det reduserte ekspresjon av nedstrøms målgener. Cyklin D1, som er oppregulert ved hjelp av aktiv STAT3, er en allosterisk regulator av cyklin-avhengige kinaser 4 og 6 (CDK4 /6) og fremmer G1 /S overgang gjennom CDK4 /6-mediert fosforylering og inaktivering av retinoblastom-proteinet [ ,,,0],32], [35]. Inhibering av ekspresjonen av cyclin D1 vil hemme cellesyklus i G1 fase fra å gå inn i S-fasen, og dermed i betydelig grad redusere tumorcelle-proliferasjon [36] – [40]. Bcl-xL, også en større STAT3 målgen, er en anti-apoptotiske molekyl av Bcl-2-familien og forbedrer tumorprogresjon [32], [41], [42]. Bcl-xL overekspresjon ofte finnes i et bredt spekter av cancere inkludert prostata kreft [43], [44]. Nedbryting av den dominerende Bcl-xL ekspresjon reduserer levedyktigheten av tumorceller følgende apoptotiske stimuli [45] betraktelig. I denne studien våre resultater fra RT-PCR tydelig vist at den nedregulering av p-STAT3 ble ledsaget av redusert ekspresjon av cyclin D1 og Bcl-xL i tumorvev etter M-hifu behandling. Disse resultatene indikerte at M-HIFU er istand til å hemme den avvikende STAT3 aktivitet, og derved kan indusere vekststans og apoptose av tumorceller, samt regresjon av prostatakreft
in vivo
.
I tillegg til den intratumoral onkogene rolle, p-STAT3 er involvert i immunundertrykkelse ved å forstyrre like stimulering ved å inhibere ekspresjonen av proinflammatoriske cytokiner og kjemokiner som stimulerer DC [28]. Alternativt fremmer p-STAT3 tumorceller til å produsere flere onkogene cytokiner, slik som IL-10, noe som i sin tur aktiverer STAT3 signalering gjennom en positiv tilbakekoplingssløyfe og hemmer funksjonell DC stimulering [28], [32], [33]. DC stimulering er avgjørende for effektiv antigen presentasjon og utvikling av anti-tumor immunrespons av T-celler. Våre tidligere undersøkelser ved hjelp av MC38 tumormodell har vist at hifu-genererte mekaniske skader på tumorceller kan føre til DC stimulering [17], og deretter økte CTL-aktivitet [12]. I denne studien har vi ytterligere bekreftet at M-HIFU kan øke funksjon av DC
in vivo
, som dokumentert av betydelig økt bestand av DC med samtidig oppregulert uttrykk for co-stimulerende molekyler som CD80 og CD86.
en annen immunundertrykkende funksjon av p-STAT3 er knyttet til sin rolle i å forbedre generasjon av tregs, som undertrykke immunresponser mot selv antigen inkludert tumorassosiert antigen. STAT3 spiller også en viktig rolle ved samordning av en rekke kritiske aspekter av T-celle funksjon i betennelse og homeostase. Spesielt ekspresjon av foxp3, som er avgjørende for de regulatoriske funksjoner av treg, kommer an på STAT3 aktivering [24]. STAT3 inhiberende aktivitet reduserer omdannelsen av foxp3-negative T-celler til tumorassosiert Tregs og øker CD8
+ T-celle-infiltrasjon i tumor – en strategi som har blitt brukt til å inhibere primær tumorvekst [46]. Tilsvarende i vår studie, ble M-HIFU behandling funnet å betydelig redusere andelen av treg i både milt og TDLNs, samtidig med undertrykkelse av STAT3 aktivitet i disse vev. Derfor våre resultater tyder på at M-HIFU kan redusere Treg-fremkalte immuntoleranse i RM-9 modell.
I sammendraget, vi har avdekket en spesifikk mekanisme for M-HIFU indusert anti-tumor immunrespons, noe som er formidlet gjennom hemming av STAT3 aktivering
in vivo
. Videre har vi funnet at M-HIFU utført på et passende tidspunkt (dvs. 2 dager for RM-9 modell) før kirurgisk fjerning av primærtumor kan forbedre beskyttelsen av verts mot tumorresidiv, og kan derfor øke overlevelsen av pasienter fra malignitet av prostatakreft. Selv om det i denne studien har vi fokusert på mekanismen forbundet med STAT3, involvering av andre mekanismer for M-HIFU indusert anti-tumor immunitet er også mulig, og vil bli undersøkt i fremtiden. Til sammen har vi vist at M-HIFU er en lovende neo-adjuvant behandling som kan kombineres synergistisk med kirurgi for prostatakreft behandling.
Materialer og Metoder
Animal Model
C57BL /6J mus, 6~8 uker gamle, ble kjøpt fra Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) og plassert i Duke Vivarium før og etter M-HIFU behandling og /eller operasjon. Alle dyrene ble håndtert i samsvar med den etablerte dyr omsorg politikk og alle dyreforsøk ble godkjent av Duke University Institutional Animal Care Bruk komiteen.
Cell Line og Cell Culture
Murine prostatakreft cellelinje RM-9, etablert av Dr. Thompson i Baylor College of Medicine, var en gave fra Dr. Mouraviev. EL4 muslymfom cellelinje ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Alle cellelinjene ble holdt i fullstendig Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), supplert med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, UT, USA), 2 mM L-glutamin, 50 IU /ml penicillin og 50 mikrogram /ml streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ved 37 ° C med 5% CO
2.
Antistoffer, Kits og kjemiske reagenser
følgende kit og antistoffer ble kjøpt fra eBiosciences (San Diego, CA, USA): mus regulatoriske T-celler Farging Set (FJK-16 s), PE-konjugert anti-mus CD8 antistoff, og anti-mus CD16 /32-antistoff. APC-konjugert anti-mus-antistoff CD11c, FITC-konjugert anti-mus CD80, og PE-konjugert anti-mus CD86 var fra BD Bioscience (San Jose, CA, USA). Kanin anti-mus fosfor-STAT3 (Y705) antistoff ble kjøpt fra Cell Signaling (Danvers, MA, USA). Mouse interferon-y ELISPOT kit var fra MABTECH Inc (Cincinnati, Ohio, USA). Texas Red-konjugert geite-anti-kanin-antistoff ble anskaffet fra Vector Laboratories Inc (Burlingame, CA, USA). Monterings medium løsning med eller uten DAPI, blokkering løsning, Vectastain Elite ABC Kit (kanin IgG) og AEC kit var fra Vector Lab. SV total RNA isolert system ble kjøpt fra Promega (Madison, WI, USA). DNA syntese enzymer var fra Invitrogen med mindre annet er angitt.
Tumor Model, HIFU behandling, kirurgisk fjerning, og postoperativ behandling og Målinger
RM-9 tumormodell ble etablert av subkutant injisert 8 × 10
4 RM-9 celler i høyre bakben av C57BL /6J mus. Tumorene fikk vokse i ca. 7 dager inntil de nådde 5~6 mm i diameter.
