Abstract
Betydningen av Piwi-samspill RNA (Pirna) vei for bakterie celle vedlikehold, genom integritet, DNA metylering og retrotransposon kontroll hever mulige roller av denne veien i kreft. Faktisk avvikende uttrykk for menneskelige Piwi ortologer og
Maelstrom
har blitt observert i ulike kreftformer. I denne studien utforsket vi uttrykket og funksjon av Pirna pathway gener i menneskelig eggstokkreft, basert på vår siste arbeid, som viste utbredt uttrykk for Pirna pathway gener i pattedyr. Vårt arbeid viser at
PIWIL1 Hotell og
MAEL
uttrykk er betydelig økt i ondartet EOC (n = 25) sammenlignet med godartede tumorvev (n = 19) og normal eggstokkvev (n = 8) . Uttrykket av
PIWIL3
er lavere i ondartede og godartede vev sammenlignet med normal eggstokk. Sekvensering av
PIWIL1
transkripsjon viste at i mange tumorer delesjon av exon 17 fører til innføring av et for tidlig stoppkodon i den Piwi domene, sannsynligvis på grunn av en skjøtefeil.
In situ
hybridisering på tumorsnitt viste at
L1
,
PIWIL1
,
2 Hotell og
MAEL
er spesielt uttrykt i epitel celler (kreftceller) i EOC. Videre
PIWIL2 Hotell og
MAEL
er co-uttrykt i stromale celler i tilknytning til kreftceller. Siden
PIWIL1 Hotell og
MAEL
er opp regulert i ondartet EOC og uttrykt i epitelceller, vi undersøkt om disse to genene påvirker invasivitet av eggstokkreft cellelinjer som normalt ikke uttrykke disse genene.
PIWIL1 Hotell og
MAEL
var forbigående løpet uttrykt i eggstokkreft cellelinje SKOV3, etterfulgt av sanntidsmålinger av cellen invasivitet. Overrask både
PIWIL1 Hotell og
MAEL
løpet uttrykk redusert invasivitet av SKOV3 celler. Våre funn støtter en økende mengde bevis som viser at gener i denne veien er oppregulert i kreft. I eggstokkreft vi viser for første gang at
Piwil1
transkripsjon kan ofte være unormal fører til mang funksjonelt produkt. I motsetning til hva som har blitt observert i andre celletyper, fant vi at
PIWIL1 Hotell og
MAEL
ha en undertrykkende effekt på cellen invasivitet
Citation. Lim SL, Ricciardelli C, Oehler MK, De Arao Tan IMD, Russell D, Grutzner F (2014) Overuttrykte Pirna Pathway Genes i ovarialcancer. PLoS ONE 9 (6): e99687. doi: 10,1371 /journal.pone.0099687
Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA
mottatt: 16 januar 2014; Godkjent: 19 mai 2014; Publisert: 16 juni 2014
Copyright: © 2014 Lim et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av Universitetet i Adelaide. F.G. støttes av en ARC (Australian Research Council) fellesskap. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er den mest dødelige gynekologisk kreft, og den femte største årsaken til kreft dødsfall blant kvinner i den vestlige verden [1]. De fem-års relativ overlevelse for kvinner med eggstokkreft er bare rundt 40% [1]. Eggstokk-kreft er heterogene tumorer som oppviser distinkte morfologiske egenskaper, genetiske mutasjoner og opprinnelse. Det er tre hovedtyper av eggstokkreft – epitel, bakterie celle og sex ledningen stromal tumor. Eggstokk bakterie celle svulster og kjønn ledningen stromale tumorer utgjør 10% av ovariekreft, og er avledet fra primitive ovarie kimceller eller mesenchymale celler i sex-ledningen avledet vev i ovarier, henholdsvis [2]. EOCs utgjør mer enn 90% av eggstokkene malignitet. Basert på histologi EOCs er klassifisert i fire hoved undergrupper (serøs, mucinous, endometroide og tydelige cellekreft) med over 70% av tilfellene diagnostisert som serøs karsinom (SCS) [3].
Endringer av epigenetisk landskapet som for eksempel global DNA hypometylering og gen spesifikke DNA hypermethylation blir ofte rapportert hos kreftceller [4]. Globalt DNA hypometylering påvirker i stor grad de intergeniske og intronic regioner i genomet, spesielt gjentatte sekvenser og transposable elementer (TES), som står for ca 55% av det menneskelige genom [5], inkludert 17%
L1
gjentar [ ,,,0],6]. I somatiske celler, er DNA metylering av tes avgjørende for å hindre at deres uttrykk som kan true integriteten av genomet. Under bakterie celle utvikling, det er en forbigående periode med global DNA hypometylering som resulterer i midlertidig aktivering av tes [7].
Pirna veien er evolusjonært svært konservert i metazoer og består av 21-26 nt piRNAs som binder Piwi proteiner for å mediere posttranslational kontroll av TE ekspresjon og spille en rolle i epigenetiske endringer (for eksempel DNA-metylering) via interaksjon med andre proteiner (slik som MAEL eller HP1) [8], [9]. Hos pattedyr er det flere
Piwi som product: (
Piwil
) gener (tre i mus, fire i mennesker). Uttrykk for
Piwil
gener og Pirna pathway forbundet gener har blitt vist på ulike stadier av bakterie celle utvikling spesielt i testikkel.
Piwil1 product: (
Miwi
) har tidligere blitt identifisert som et gen utelukkende uttrykt i mus testikkel og viktig for spermatogenese [10]. Mer nylig uttrykk for
Piwil1
er også demonstrert i mus og human eggstokk [11]. Mutasjon av
Piwil2
,
Piwil4 Hotell og
Mael
i mus fører til lignende fenotyper inkludert eliminering av TE DNA metylering og mannlig sterilitet [8]. Det er nå økende bevis for Pirna aktivitet også i pattedyr eggstokk, men slå ut eksperimenter Pirna sti genet i mus så langt har bare ført til mannlig sterilitet [12] -. [14]
Det er montering bevis Pirna pathway aktivitet i ulike kreftformer. Uttrykk for
PIWIL1 Hotell og
PIWIL2
er funnet i et bredt spekter av menneskelige kreftformer som mage, bryst, mage-tarmkanalen og endometrium [15] – [18] og nylig også i ovarialcancer [19]. Økt uttrykk for
PIWIL1
er assosiert med økt tumorvekst [20] økt kreft karakterer [21], dårlige diagnostiske utfall [22] og dødelighet [23].
PIWIL2
er allment uttrykt i tidlig stadium brystkreft og livmorhalskreft og forstadier til kreft stamceller er involvert i tumordannelse [18]. Uttrykket mønster av
PIWIL3 Hotell og
4
er bare studert i tykktarm kreft [24].
Maelstrom product: (
MAEL
) er en kjent testikkel kreft genet [25].
Våre funn av uttrykk i eggstokkene somatiske celler [11] sammen med redusert DNA metylering ved
L1
promoter regionen assosiert med utviklingen av livmorhals og livmor kreft [26] og dårlig prognose i eggstokkene karsinomer [27] ledet oss til å undersøke om Pirna pathway gener kan spille en rolle i EOCs. I denne studien undersøkte vi uttrykket av
PIWIL1 Anmeldelser –
4 Hotell og
MAEL
i 25 EOC, 19 godartet svulst prøver, og 8 normale eggstokkene vev. Vi fant signifikant forhøyet uttrykk for
PIWIL1 Hotell og
MAEL
i EOC forhold til godartede og normal eggstokk vev. Men
PIWIL1
transkripsjoner i EOC kan ikke være funksjonell på grunn av slettinger identifisert i Piwi domenet av denne karakterutskrift. Videre overekspresjon av
PIWIL1 Hotell og
MAEL
antyder en rolle av disse genene i å redusere eggstokkreft celler invasivitet
in vitro
.
Materialer og metoder
vev
Total RNA fra human testikkel og pre-menopause eggstokkreft vev ble kjøpt fra Stratagene (USA). Ondartet, godartede og normal eggstokk vev (Tabell 1 og Tabell S3) ble samlet inn med informert skriftlig samtykke fra pasienten og godkjenning av Etisk komité for Royal Adelaide Hospital, Adelaide, South Australia.
Cell linjer
Menneskelige eggstokkreft cellelinjer SKOV3 og OVCAR3 ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, USA) mens OVCAR5 ble hentet fra Dr. Thomas Hamilton (Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, Pennsylvania) Johnson et al Cancer Res 57: 850-856 1997. Cellelinjene linjene~~POS=HEADCOMP ble opprettholdt i RPMI 1640 medium supplert med L-glutamin (2 mM), penicillin-streptomycin (100 U /ml, 100 ug /ml) (Sigma). SKOV3 og OVCAR3 celler ble supplert med 5% FBS (Invitrogen), mens OVCAR5 celler ble supplert med 10% FBS og 7,5 pg /ml insulin. Alle cellelinjer ble holdt ved 37 ° C i et fuktig kammer med 5% CO
2.
RNA isolering og cDNA-syntese
RNA ble isolert fra vev og cellelinjer ved hjelp av TRIzol reagens (Invitrogen) etter produsentens anvisninger. RNA ble resuspendert i nuklease fritt vann, og lagret ved -80 ° C. RNA ble behandlet med DNase I (New England Biolabs) før revers transkripsjon. 1 ug RNA ble brukt for å oppnå cDNA ved hjelp av Super Script III First-strand Synthesis System (Invitrogen) etter produsentens protokoll. I korthet RNA ble inkubert med 1 ul av 50 uM oligo (dT)
20 og 1 ul 10 mM dNTP i 10 minutter ved 65 ° C. Etter inkubering, ble 4 ul 5x RT-buffer, 2 ul av ditiotreitol (DTT, 0,1 M), 1 ul av RNaseOUT (40 U /pl) og 1 ul av Super Script III RT enzym (200 U /ul) tilsatt og inkubert i 50 minutter ved 50 ° C. Reaksjonen ble avsluttet ved 85 ° C i 5 minutter. cDNA ble lagret ved -20 ° C.
Genekspresjon analyser
RT-PCR ble utført for å bestemme nivået av mRNA for de fem Pirna sti-genene (tabell S1) og beta-aktin (
ACTB
) i 52 pasientprøver og 3 eggstokkreft cellelinjer. Hver 25 ul reaksjon inneholdt 200 ng av cDNA, 5 ul 5x Go Taq Grønn Master Mix (Promega), 1 ul av 5 mM dNTP-løsning (Roche), 0,5 ul av hver primer (20 pmol /pl) og 0,5 ul Taq DNA-polymerase. PCR-betingelsene var de samme for alle gener, med unntak av glødetemperaturen (tabell S1), og var som følger: initial denaturering ved 95 ° C i 2 minutter, 95 ° C i 30 sekunder, annealing ved gen-spesifikk temperatur i 30 sekunder ( tabell S1), forlengelse ved 72 ° C i 1 minutt, 32 sykluser. PCR av
ACTB
kontroll ble utført med 27 sykluser, etterfulgt av 5 minutter av finalen forlengelse ved 72 ° C. PCR-produktene ble synliggjort på en 1,5% agarosegel farget med etidiumbromid. Bånd intensitet ble målt (Antall Et program, Version 4, Bio-Rad), og den relative intensiteten til hvert gen ble normalisert til den av
ACTB
. PCR produktene ble bekreftet ved sekvensering (Big Dye Terminator v3.1 syklus sekvense kit, Applied Biosystems). RT-PCR ble utført i tre eksemplarer for hver primer par.
Statistiske analyser av genuttrykk
Data er presentert som median relativ uttrykk (første kvartil til tredje kvartil). Utskriften nivået av hvert gen ble normalisert mot
ACTB
. Kolmogorov-Smirnov og Shapiro-Wilk prøver antydet at ekspresjonsnivået av hvert gen fra alle de 52 prøvene ikke er normalfordelt. Således kan en Kruskal-Wallis test, som bruker en ikke-parametrisk metode, ble anvendt for å sammenligne den gen-ekspresjon fra ondartede, benigne og normale grupper. Den Spearmans korrelasjonstest ble utført for å undersøke korrelasjonen mellom pasientens alder og påfølgende genekspresjon. R-verdi nærmere 1 indikerer en sterkere positiv korrelasjon, mens en R-verdi nærmere -1 viser en sterkere negativ korrelasjon. I Kruskal-Wallis og Spearmans tester, en P-verdi på 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
RNA
in situ
hybridisering
prober ble merket med digoxigenin-. 11-UTP (Roche Diagnostics) i henhold til produsentens protokoll. Formalin-fikserte paraffin-vevssnitt ble deparaffinised i xylen og deretter vasket i gradert etanol. Alle løsninger ble utarbeidet i dietylpyrokarbonat (DEPC) -behandlet H
2o å inaktivere RNase aktivitet. mRNA-bundet nukleoproteiner ble fjernet ved proteinase K inkubasjon (1.2μg /ml) (Roche Diagnostics) i 30 minutter ved 37 ° C. Objektglassene ble vasket med 1 x PBS og acetylert (1 M triethanolamin /0,178% HCl /0,25% eddiksyreanhydrid). Objektglassene ble prehybridisert ved 65 ° C i 2 timer med prehybridiseringsbuffer (50% deionisert formamid /2 x SSC /1x Denhardfs løsning /0,005 M fosfat-buffer /10% dekstransulfat /1 mg /ml gjær total RNA /1 mg /ml laksesperma- DNA) og hybridisert med omtrent 200 ng av cRNA-probe i prehybridiseringsbuffer over natten ved 50 ° C i et fuktig kammer. Platene ble vasket i 2 x SSC, 1 x SSC, 0,5x SSC og 0,1X SSC i 15 minutter hver ved 50 ° C. For å fjerne ubundne cRNA prober, ble vevet utsatt for RNase A (150μg /ml) fordøyelse i 30 minutter ved 37 ° C. Spesifikt bundet cRNA prober ble påvist ved anvendelse av et anti-DIG-antistoff koblet til alkalisk fosfatase med nitrobluetetrazolium klorid /X-fosfat-5-brom-4-klor-3-indolylphosphate (NBT /BCIP) (Roche Diagnostics) som kromogent substrat.
Kloning og konstruere forberedelse til invasjon analyser
MAEL plakater (CCDS1257) og
PIWIL1 plakater (CCDS9268) cDNA-sekvensene ble hentet fra NCBI CCD database. Full-lengde cDNA-sekvensen ble amplifisert ved bruk av Expand High Fidelity PCR-system (Roche) i henhold til produsentens protokoll og klonet inn i en pcDNA3.1 pattedyr-ekspresjonsvektor. Plasmid DNA inkludert pcDNA 3.1 (Invitrogen) eller pEGFP-N1 tomme vektorer (Clontech) ble transfektert inn SKOV3 celler ved hjelp Lipofectamine LTX (Invitrogen) etter produsentens anvisninger. SKOV3-celler ble valgt på grunn av deres endogene
L1
ekspresjonsnivåer og det faktum at de viste ingen Pirna sti-genekspresjon (Fig. 1C). For hver transfeksjon, 8 x 10
4 SKOV3-celler ble sådd ut på en 24-brønners plate 14 timer før transfeksjon, og ble dyrket i RPMI 1640/5% FBS uten Penicillin-streptomycin. Plasmid DNA (500 ng) ble fortynnet i 100 ul av OPTI-MEM medium (Invitrogen) og inkubert med 0,5 ul pluss reagens (Invitrogen) og 2 ul Lipofektamin LTX (Invitrogen) i 30 minutter før den ble tilsatt til hver brønn. Etter 6 timer ble cellekulturmediet erstattet med ny RPMI 1640/5% FBS medium og cellene ble inkubert i 24 timer ved 37 ° C, 5% CO
2 før høsting for
in vitro
invasjon analyser. Transfeksjon av pEGFP-N1 tomme vektorer inn i SKOV3-celler tillatt transfeksjonseffektiviteten som skal måles, som med hell transfekterte cellene uttrykte proteinet GFP. Den pEGFP-N1-vektoren ble underkastet de samme vekstbetingelser og transfeksjon som beskrevet ovenfor, for å bestemme transfeksjonseffektiviteten som var ca. 70% etter 24 timer.
RT-PCR-analyser av
PIWIL1-4
og
MAEL
uttrykk i (A) ondartet EOC, godartet eggstokkreft (B) normale eggstokker og (C) eggstokkreft cellelinjer. Dette er en representasjon av 4 ut av 25 maligne EOC og 19 benigne ovarialcancer vev. Økt uttrykk for
PIWIL1, 2, 4 Hotell og
MAEL
, men ikke
PIWIL3
, er funnet i ondartede kreftformer i forhold til godartede svulster. Alle normale eggstokker viser
PIWIL2 Hotell og
PIWIL4
uttrykk, men bare noen har
PIWIL1, 3 Hotell og
MAEL
uttrykk. Ingen endogen
PIWIL1, 2, 4 Hotell og
MAEL
uttrykk er oppdaget i OVCAR3 og SKOV3 celler. Ova * viser vev fra en 20 år gammel premenopausal eggstokk mens andre eggstokkene er fra personer i alderen 44-76 år.
In vitro
invasjon analyser med xCelligence
Cell invasjonen ble testet med sanntid invasjonen assay overvåking ved hjelp av CIM enheter og xCelligence DP-systemet (Roche Diagnostics) [28]. Kort, 4 timer før invasjonen analysen, ble en CIM plate (Roche) belagt med 01:20 utvannet vekstfaktor redusert Matrigel basalmembran matrix (~450μg /ml) (BD Biosciences). Deretter 40000 celler, utransfekterte eller transfektert med tom vektor (EV) eller
MAEL
eller
PIWIL1
vektorer, ble sådd i hver belagt godt. -Celleaktivitet ble fulgt over et tidsrom på 72 timer ved å måle impedansen signal i CIM plate. Cellen ble registrert aktivitet hvert minutt i de første 12 timer og hver 5 minutter for følgende 12 timer. Deretter fra 24 timer og utover til slutten av forsøket, ble celleaktivitet registrert hvert 30 min. I hver CIM plate, ble tre paralleller av hver gruppe utført for å skaffe gjennomsnitt og standardavvik. Forsøket ble gjentatt tre ganger.
PIWIL1
avskrift sekvense
Piwi domenet
PIWIL1
avskrift ble PCR forsterket og produkter av forskjellig størrelse ble klonet inn i pGEM-T Easy vektor (Promega). Totalt 30 positive kolonier fra forskjellige PCR-bånd ble utvalgt fra hvert ligeringsreaksjonen og plasmid-DNA ble renset ved anvendelse av standard alkaliske lyseringsmetoder (Qiagen) [29]. 200 ng av plasmid DNA ble sekvensert (Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems) med SP6 og T7 universelle primere.
Resultater
Uttrykk av Pirna pathway gener økes i ondartet EOC forhold til godartede svulster eller normale eggstokkreft vev
Pirna pathway gener er konsekvent uttrykt i pattedyr eggstokk [11]. For å undersøke en mulig rolle av denne veien i EOC, vi utførte semi-kvantitativ RT-PCR for å undersøke uttrykk for
PIWIL1
,
PIWIL2
,
PIWIL3
,
PIWIL4 Hotell og
MAEL
i avansert stadium serøs EOC (n = 25), godartet ovarietumorer (n = 19) og normal eggstokkvev (n = 8) (Tabell 1, Tabell S3 og fig. 1A, B). Semi kvantitativ analyse viste at de relative uttrykk nivåer av
PIWIL1 Hotell og
MAEL
var signifikant høyere i ondartet EOC forhold til godartede og normalt vev (Fig. 2A, B). De relative uttrykk nivåer av
PIWIL2 Hotell og
PIWIL4
i maligne gruppene var ikke signifikant forskjellig fra at i godartede eller normale eggstokkene vev (Fig. 2C, D). Men uttrykket av
PIWIL2 Hotell og
PIWIL4
er betydelig lavere i godartede svulster i forhold til normal eggstokkvev, noe som tyder på en endring av genuttrykk under utviklingen av EOC. Den relative uttrykk for
PIWIL3
er annerledes enn andre
PIWIL
gener slik at uttrykket av dette genet er signifikant høyere i normal eggstokk i forhold til både ondartede og godartede vev (Fig. 2E) . Videre er den relative uttrykk for
PIWIL3
i normal eggstokk er positivt korrelert med pasientens alder i de normale eggstokk vev (n = 8) (r = 0,750, p = 0,05) (tabell 2). I motsetning til
PIWIL3
,
PIWIL1
uttrykket er negativt korrelert med pasientenes alder (r = -0,737, p = 0,037).
PIWIL1
er uttrykt i voksende follikler i pre-menopausale eggstokkene, men i denne studien halvparten av eggstokkene testet var fra kvinner under 50 år og vil trolig være premenopausale.
Semi-kvantitativ RT-PCR analyse av mRNA uttrykk (i forhold til
ACTB
) av (A)
PIWIL1
, (B)
MAEL
, (C)
PIWIL2
, (D)
PIWIL4 Hotell og (E)
PIWIL3
. (F) P-verdien for hver sammenlikningsgruppe. Ondartet EOC (n = 25), benigne eggstokkreft vev (n = 19) og normale eggstokkene (n = 8). Kruskal-Wallis test ble utført for å sammenligne genekspresjon nivået mellom to grupper. Fylt dot angir middelverdien for hver gruppe. * Viser 0,001 P 0,05; *** Indikerer P 0,001; NS, ikke signifikant.
L1 Kjøpe og Pirna pathway gener er over uttrykt i EOC celler
For å analysere uttrykk mønster av Pirna sti gener og
L1
i EOC, RNA
in situ
hybridisering ble utført i ondartet EOC (n = 5) og godartede ovarietumorer (n = 2) (Tabell 3, fig. S1). Vi fant sterkt uttrykk for
L1
i epitelcellene men
L1
var fraværende i stromale celler i alle prøvene (Fig. 3A, E). Også vi bemerket at uttrykket av
L1
er variabel i forskjellige pasienter (fig. 3A). Sterk uttrykk for
PIWIL1
ble funnet i epitelceller i alle EOC vev (Fig. 3B, F), mens
MAEL Hotell og
PIWIL2
viste sterkt uttrykk i epitelceller og stromale celler fra alle EOC undersøkt (fig. 3C, G og D, H henholdsvis).
In situ
analyse av (A, A «, E)
L1
, (B, B «, F)
PIWIL1
, (C, C», G)
MAEL
, (D, D «, H)
PIWIL2
i to ondartet EOC (AD fra SC3 mens EH fra SC2). (A»-D «) Amplification bilder av A-D henholdsvis. Sterk uttrykk for Pirna pathway gener og
L1
ble funnet i plateepitel-til-cuboidal som epitelceller både ondartet EOC unntatt
PIWIL1
som bare uttrykt i SC2, men ikke SC3.
L1
har usammenhengende uttrykk i noen EOC slik at noen epitelceller synes å ha sterkere
L1
uttrykk i forhold til andre.
MAEL Hotell og
PIWIL2
men ikke
PIWIL1
er også uttrykt i stromale celler i begge EOC. (E»-H «) Negative kontroller med sans sonde av
L1
,
PIWIL1
,
MAEL Hotell og
PIWIL2
hhv. Ep = epitelceller; S = stromale celler. Scale bar = 50 pm.
flere
PIWIL1
transkripsjon varianter finnes i ondartet EOC
PCR forsterkning av Piwi domene fra EOC cDNA produsert to forskjellige band sammenlignet med cDNA fra normal testikkel eller eggstokk (fig. 4), noe som tyder på tilstedeværelsen av flere
PIWIL1
transkripsjon varianter i ondartet EOC. PCR-produkter fra testikkel og ondartet EOC ble pakket ut, klonet og sekvensert. Flere justeringer av klon sekvenser viste mange endringer innenfor Piwi domene på nukleotidnivå i forhold til testis og publisert
PIWIL1
cDNA-sekvensen. Enkelt basepar endringer har blitt identifisert i
PIWIL1
transkripsjoner av ondartede EOCs (tabell S2). I tillegg er de fleste av disse klonene har exon delesjon og unspliced introner som innfører premature stoppkodoner. Viktigere en 75-nt delesjon som omfattet hele ekson 17 ble funnet i de fleste av de sekvenserte kloner i 5 av 28 EOC pasienter (fig. 4B). I tillegg vil enkelte kloner viste delvis spleising av introner 15 og 16 (fig. 4B), slik at 17 bp og 20 bp fra 5′-enden av intron 15 og 16, henholdsvis, er unspliced. For å bekrefte at mutasjoner er på grunn av skjøting, ble genomisk DNA av tumorprøver isolert og sekvensert ved den tilsvarende regionen. Ingen mutasjoner ble identifisert mellom eksoner 15-18 (der spleise feil oppstod) i genomisk
PIWIL1
sekvens (fig. S2). For å forutsi om de ovenfor post-transkripsjonelle endringer påvirke PIWIL1 funksjon, ble sekvensene oversatt og sammenlignet med kontrollen (testis cDNA) og publisert peptidsekvens (AAC97371.2). Tap av hele ekson 17 (73-nt sletting) i 11 kloner innført et for tidlig stoppkodon i Piwi domene (fig. S3). Tilsvarende stoppkodonene ble funnet i kloner som har unspliced introner (ikke vist).
(A)
PIWIL1
ekspresjon i kontroll vev (human testis, normal ovarie (ov) 1, 2) og EOC vev SC1 og 2. i den positive kontroll ble et 500 bp bånd forsterket, men i ondartet SC1, ble to bånd erholdt. (B) cDNA multippel oppstilling (delvis) viser at mesteparten av klonene har en delesjon av exon 17 (ΔΔ3) og 3 kloner har delvis skjøting av intron 15 og 16 (). PIWIL1_ccds: publisert cDNA av
PIWIL1 plakater (CCDS9268); Testikkel C1: testis avskrift klone en; B1-3, B6, B9-B14, C6, C8, C9, C10-C15, D1-D10: kloner med
PIWIL1
transkripsjoner
Over uttrykk for Pirna sti gener. reduserer invasivitet
in vitro
for å undersøke hvilken rolle Pirna pathway gener i kreft progresjon, full-lengde
PIWIL1
eller
MAEL
transkripsjoner ble klonet og transfektert midlertidig inn i eggstokkreft cellelinje SKOV3 og analysert for invasivitet etter 24 timer med transfeksjon. RT-PCR ble utført for å bekrefte innføringen av plasmider i disse cellene. RT-PCR bekreftet
GFP
,
PIWIL1
eller
MAEL
løpet uttrykk (Fig. S4A). Uttrykk for
MAEL Hotell og
PIWIL1
konstruerer holdt seg høy i de transfekterte cellene 50 timer etter transfeksjon (Fig. S4A).
MAEL
,
PIWIL1 Hotell og tom vektor (EV) transfekterte celler og utransfekterte SKOV3 celler ble brukt til xCELLigence system for å undersøke deres effekt på cellen invasivitet [30]. Overraskende, invasivitet av
MAEL Hotell og
PIWIL1
transfekterte celler var lavere sammenlignet med ikke-transfekterte eller tomme vektor celler (Fig. 5). Cell invasivitet fra hver gruppe begynte å nå et platå etter 30 timer, og dermed bare celleaktivitet av de første 30 timer er vist. Våre resultater tyder på at overekspresjon av
PIWIL1 Hotell og
MAEL
ha en undertrykkende effekt på SKOV3 celle invasivitet.
PIWIL1 Hotell og
MAEL
transfekterte celler har lavere invasivitet sammenlignet med ikke-transfekterte celler og
Ev
transfekterte celler. I hvert forsøk, ble hver gruppe utført in triplo, og dette eksperimentet ble gjentatt tre ganger. Dette er en kombinert data tomt på tre uavhengige eksperimenter for alle grupper. Feilfelt representerer standardavvik.
WT
indikerer utransfekterte SKOV3 celler; tom vektor (EV),
MAEL Hotell og
PIWIL1
indikere celler transfektert med
MAEL
eller
PIWIL1
vektorer.
Ingen
indikerer godt uten celler.
Diskusjoner
Pirna veien er viktig for TE stanse, epigenetisk regulering og stamcelleselvfornyelse i et bredt spekter av organismer [31], [32]. Global DNA hypometylering og TE derepresjon, slik som
L1, er
et felles trekk ved kreft genomer [33], [34] hos mennesker
PIWIL1 Hotell og
2
overekspresjon har blitt observert i tumorer fra forskjellige vev [15] – [18], [21] – [23]. Det er imidlertid fortsatt uklart om Pirna pathway gener er forskjellig uttrykt i eggstokkreft eller har en rolle i eggstokkene tumor progresjon. Vi undersøkte uttrykk for Pirna pathway gener
PIWIL1 Anmeldelser –
4
,
MAEL Hotell og
L1
i ondartet EOC, godartede svulster og normal eggstokk vev, og også undersøkt mulige roller
PIWIL1 Hotell og
MAEL
i eggstokkreft cellelinjer
uttrykk for
PIWIL1 Anmeldelser -.
2
har blitt undersøkt i ulike kreft vev [15] – [18], [21], [23], [35], men ikke
MAEL
,
PIWIL3 Hotell og
PIWIL4
. Selv om uttrykket av
PIWIL2 Hotell og
4
dukket høy i tumorprøver dette ikke var signifikant, trolig på grunn av det faktum at
PIWIL2 Hotell og
PIWIL4
ble sterkt uttrykt i normale eggstokk-vev (fig. 1B) og deres ekspresjon hos maligne vev er svært variabel. Uttrykket av
PIWIL1 Hotell og
MAEL
men er betydelig økt i ondartet EOC sammenlignet med godartede svulster.
PIWIL1 Hotell og
MAEL, etter men ikke
PIWIL2 Hotell og
4, etter var betydelig opp regulert i forhold til normale eggstokker. I motsetning til
PIWIL2 Hotell og
4 Hotell som kommer til uttrykk i alle normale eggstokkene vev undersøkt, uttrykk for
PIWIL1 Hotell og
MAEL
finnes bare i en delmengde av normale eggstokk-vev fra pasienter som var mindre enn 50 år gamle. I normal eggstokk, blir
PIWIL1 Hotell og
MAEL
uttrykt i cumulus celler av voksende follikler i menneskelig [11]. Den normale eggstokkreft vev testet er fra personer i alderen 44-76 år, og halvparten av disse prøvene ble hentet fra personer under 50 år. Dermed variabelen uttrykk for
PIWIL1 Hotell og
MAEL
i normal eggstokkene kan forklares med forskjellen i overflod av voksende follikler, som uttrykker Pirna pathway gener på tvers av prøvene.
MAEL
er kjent som en kreft /testikkel genet som det er uttrykt i testikkel og en rekke kreftcellelinjer [36]. Her identifiserte vi for første gang økt uttrykk av
MAEL
i ondartet EOC og godartede ovarietumorer. I likhet med Piwi, er MAEL avgjørende for å sikre riktig kimcellelinje stamcelle differensiering i
Drosophila Hotell og andre virveldyr [37]. Overekspresjon av Pirna pathway gener i EOC kan tyde på at noen stamcelleegenskaper er til stede i tumorceller eller at Pirna veien har blitt aktivert for eksempel ved aktivitet av retrotransposons. Uttrykk av disse genene kan også være en signatur av tilstedeværelsen av eggstokkreft stamceller [38].
Uttrykket av Pirna pathway gener i normal eggstokk og visse typer EOC kan gi et nytt perspektiv på opprinnelsen til eggstokkreft. Somatiske celler av modning follikkelen kan komme i kontakt med den ovarian flate epitel under eggløsning eller kan være tilstede i inklusjons cyste som er antatt å spille en rolle i opprinnelsen av ovarialcancer [3], selv om tilstedeværelsen av inklusjons cyster virker ikke i seg selv øker risikoen for å utvikle kreft i eggstokkene [39]. Hypometylering av
L1
promoter regionen er korrelert med økt
L1
mRNA uttrykk i ondartet brystkreft vev og cellelinjer [40], [41]. Uttrykket av
PIWIL
gener og
MAEL
i både normal eggstokk og ondartet EOC korrelerer med økt uttrykk av gjentatte elementer og øker muligheten for at Pirna veien kan ha blitt utløst av TE uttrykk. Men vi la merke til at
L1
uttrykk var fraværende i tidligere stadium ondartede svulster (n = 6), men konsekvent til stede hele scenen 3c tumorprøver. Dette gir noen indisier på at aktiveringen av Pirna pathway gener kan gå forut for
L1
uttrykk under tumorprogresjon. Dette er konsistent med arbeid i andre svulster som korrelerer
L1
uttrykk med kreft progresjon [42].
Maelstrom
slå ut resulterer i redusert DNA metylering i gonadene, men ikke i somatisk vev. I gonadene dette fører til en dramatisk økning i transposable element uttrykk i kjønnsceller [43]. Vår observasjon av
MAEL
overekspresjon i fravær av påvisbare
L1
uttrykk i tidlig stadium tumorprøver øker muligheten for at ikke-fungerende
MAEL
kan spille en rolle i å redusere DNA metylering fremme påfølgende
L1
uttrykk.
Selv om
PIWIL1
karakternivået øker betydelig hos ondartet EOC forhold til godartede og normalt vev, kloning og sekvensering av disse transkripsjoner foreslo at disse transkripsjoner kan gi avvikende og ikke-fungerende PIWIL1 protein. Flere mutasjoner ble funnet i
PIWIL1
transkripsjoner inkludert unspliced introner, tap av eksoner samt enkelt basepar endringer. Enkelt basepar endringer kanskje et resultat av RNA redigering [44].
