Abstract
RBP2 har vist seg å delta aktivt i kreft progresjon. Det hemmer senescens av kreft celler, medierer cancer celleproliferasjon og kreft fremmer metastase. Det er også viktig å narkotika toleranse. Men effekten av RBP2 på epitel-mesenkymale overgang er fortsatt ukjent. I denne studien analyserte vi effektene av RBP2 på epitel-mesenchymale overgang i ikke-småcellet lungekreft. Resultatene viste at RBP2 ned-regulert ekspresjon av E-cadherin ved å hemme aktiviteten av promoteren E-cadherin og oppregulert ekspresjonen av N-cadherin og snegl via aktivering av Akt signalering, og overekspresjon av RBP2 indusert epithelial- mesenchymale overgang i ikke-småcellet lungekreft celler. Vår studie videre indikert thatRBP2 kan være et potensielt mål for kreftbehandling anti-lunge
Citation. Wang S, Wang Y, Wu H, Hu L (2013) RBP2 Induserer Epitelial-Mesenchymale Overgang i ikke-småcellet Lungekreft. PLoS ONE 8 (12): e84735. doi: 10,1371 /journal.pone.0084735
Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children Hospital Medical Center, USA
mottatt: 18. august 2013, Godkjent: 19 november 2013; Publisert: 20.12.2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Science Foundation Natural i Shandong-provinsen [Z2005C02]. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den vanligste årsaken til kreftdødelighet, og dens sykelighet øker på verdensbasis [1]. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for 85% av all lungekreft. Dessverre er mange NSCLC utvikle fjernmetastaser i løpet av den tidlige fasen av sykdommen. Videre dødelighet blant NSCLC pasienter blir oftere forårsaket av metastaser i stedet for deres primære svulster. Derfor er tidlig oppdagelse og forebygging av metastasering er et viktig skritt i å stoppe utviklingen av NSCLC [2].
Retinoblastoma bindingsprotein-2 (RBP2) ble opprinnelig identifisert som en kritisk retinoblastom protein (pRB) -binding protein [3]. I 2007 ble RBP2 først funnet å være en histon demetylase for tri- og dimethylated lysin 4 på histon H3 (H3-K4me2 og H3K4me3) [4,5]. Det er allment akseptert at histone metylering er svært viktig for uttrykket av ulike gener, og spiller viktige roller i kreft progresjon [6-8]. Avvikende metylering bidrar til overdreven spredning av celler og tumorigenesis, og H3K4me0 staten er sterkt korrelert med dårlig prognose hos brystkreftpasienter [9]. Som en histone demetylase, RBP2 tar aktivt del i kreft progresjon. Imidlertid, i motsetning til andre histon-modifiserende enzymer, RBP2 kan direkte binde mål-DNA. Den har en AT-rik interaksjon domene (tørre) som spesifikt gjenkjenner DNA-sekvensen CCGCCC [10]. Denne spesielle DNA-sekvens som er anriket på promotorområdene for de RBP2 målgener. I magekreft, RBP2 binder seg til promoter-regioner av p16
ink4a, p21
CIP1 og p27
kip1 gener for å hemme deres uttrykk og redusere den begynnende alderdom av kreftceller [11]. I lungekreft, RBP2 binder seg til promotor-regionen av p27, cyklin D1 og integrin-ß1 til å mediere kreftcellevekst og metastase [12]. I denne studien analyserte vi effektene av RBP2 på epitel-mesenchymale overgang (EMT) i NSCLC.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Pasientinformasjon og prøver ble innhentet med skriftlig informert samtykke. Hver pasient i denne studien ga skriftlig informert samtykke til å publisere disse tilfelle detaljer. Forskningen ble godkjent av etisk komité av Qilu Hospital.
Pasienter
lungekreft prøver (n = 61) og fjerne normale lungevev (n = 47, 5 cm fra grensen til lungekreft) ble samlet fra pasienter med NSCLC i Qilu Hospital fra 2007 til 2008. De vev ble lagret ved -80 ° C inntil bruk. Alle prøver var fra pasienter som ikke hadde gjennomgått preoperativ radioterapi eller kjemoterapi. Den patologisk iscenesettelse av de 61 pasientene ble utført i henhold til svulsten-node-metastaser (TNM) staging system [13].
Immunohistochemistry
De vevsprøver ble dyppet i parafin. Seksjonene ble deparaffinized i xylen og rehydrert i en etanol gradient. Etter at antigener ble hentet frem, ble delene behandlet med 3% H
2o
2 i 10 minutter, fulgt av 5% bovint serumalbumin (BSA) i 30 min. Deretter ble seksjonene inkubert med primære antistoffer mot RBP2 (1: 250 fortynning), E-cadherin (1: 200 fortynning), N-cadherin (1: 200 fortynning) eller snegle (1: 200 fortynning) over natten ved 4 ° C og sekundære antistoffer konjugert til HRP (Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, CA, USA) ble tilsatt i 1 time ved 37 ° C. Visualisering av antistoff-binding ble utført ved hjelp av DAB-farging. Kjernene ble farget med hematoksylin. De farging resultater ble uavhengig vurdert av to patologer. Prosentandelen av de positive cancerceller ble beregnet i henhold til følgende kriterier: 0 = ingen positiv kreftceller, 1 = 10% positive cancerceller, 2 = 10% -35% positive cancerceller, 3 = 35% -75% positive cancerceller og 4 = 75% positive kreftceller. Den fargeintensitet ble beregnet i henhold til følgende kriterier: 1 = ingen flekker 2 = lett gul farging (svak farging), 3 = gul farging (intermediat farging) og 4 = brun farging (sterk farging) [14]. Sluttresultatet var lik arealet score og dundret intensitet [15]. En endelig farging score ≥ 4 ble definert som overekspresjon, og en avsluttende flekker poengsum 4 ble definert som nonoverexpression [15].
Cell Culture, RNA interferens og Gene Overuttrykte
Den menneskelige lungekreft cellelinjer A549 og SK-MES-en og den menneskelige bronkial epiteliale cellelinje Beas2B ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Beas2B og A549-celler ble dyrket ved 37 ° C med 5% CO
2 i RPMI-1640 (Sigma, Santa Clara, CA, USA) medier supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibico, Carlsbad, CA, USA). SK-MES-1-celler ble dyrket i MEM (Gibico, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% FBS. Når vi analyserte virkningene av Akt signalisering på ekspresjon av N-cadherin og sneglen, ble A549-cellene som ble behandlet med 24 uM PI3K-inhibitor (LY294002) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) i 24 timer. For RNA-interferens og genet overekspresjon, cellene ble dyrket i 6-brønns plater (1,0 x 10
5-celler /brønn) over natten, etterfulgt av transfeksjon med 5 ul RBP2 siRNA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) eller 2- mikrogram av pcDNA3-HA-RBP2 plasmid (en generøs gave fra WG Kaelin) med 5 mL av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA); cellene ble deretter dyrket i 48 timer. Følgende siRNA sekvenser ble brukt i denne studien: RBP2 siRNA1 5′-AAUAUCCAGGGCCUUCAUGUAGCCC-3 «; RBP2 siRNA2 5»-UUGUGUACUCGUCAAACUCUACUCC-3 «; RBP2 siRNA3 5»-UUAACAUGCCGGUUAUCCAGGCUCU-3 «; kontroll siRNA 5»-UUCUCCGAAGGUGUCACGUTT -3 «. Den RBP2 siRNA som kan mest effektivt utarme RBP2 ble brukt i de følgende eksperimenter.
RNA Utvinning og kvantitativ real-time PCR
Total RNA fra vevsprøvene og cellelinjer ble isolert ved hjelp av Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). cDNA ble syntetisert ved hjelp av First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo, San Jose, CA, USA). For real-time PCR-analyse, ble cDNA amplifisert ved SYBR Premiks Ex Taq (Takara, Otsu, Shiga, Japan), og ble oppdaget ved hjelp av et Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System. Relativ genekspresjon ble normalisert til uttrykk av β-aktin og ble beregnet ved hjelp av to
(- △△ CT) metoden [16]. De følgende primere ble anvendt i dette forsøk: β-aktin fremover 5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3 «og 5′-revers AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′; RBP2 frem 5»-GCTTGGCAATGGG AACAAAA-3 «og omvendt 5′-CCGTTGTCTCATTTGCATGTTAA-3».
Western Blot
Totalt cellulære proteiner ble hentet ved hjelp Radio Immunoprecipition Analyselyse buffer, og 50 mikrogram totale proteiner ble benyttet for western blot-analyse. De polyvinylidendifluorid-membraner ble probet med antistoffer mot β-aktin (1: 1000 fortynning), RBP2 (1: 1000 fortynning), E-cadherin (1: 1000 fortynning), N-cadherin (1: 1000 fortynning), snegl (1 : 1000 fortynning), p-Akt (1: 1000 fortynning) eller Akt (1: 1000 fortynning) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), etterfulgt av inkubasjon med et anti-kanin pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert immunoglobulin G (IgG) (1: 2000 fortynning). Blottene ble deretter utviklet ved hjelp av forbedret chemiluminescence metoden (Millipore, Billerica, MA, USA). Den β-aktin-signalet ble brukt som en kontroll.
Immunofluorescence
A549-celler ble dyrket i en 96-brønns plate og transfektert med RBP2 siRNA i 48 timer. Deretter ble cellene fiksert med 4% paraformaldehyd, permeabilisert med 0,2% Triton X-100, og inkubert med primære antistoffer mot RBP2 (1: 250 fortynning) eller E-cadherin (1: 200 fortynning) i 1 time ved 37 ° C . Cellene ble deretter inkubert med FITC-konjugerte sekundære antistoffer (Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, CA, USA) i 30 minutter ved 37 ° C. De fluoriserende bildene ble tatt med en konfokal laser scanning mikroskop
Transwell Invasion Analyser
Transwell membraner (8 mikrometer porestørrelse, 6,5 mm diameter, Corning, Tewksbury, MA, USA). Var pre- belagt med Matrigel (1 ug /ml, fortynnet med serumfritt RPMI-1640 medium). Etter at RNA-interferens eller genet overekspresjon behandling i 48 timer, 1,0 x 10
5-celler i 200 pl RPMI-1640 medium uten FBS ble sådd ut i de øvre kamrene. Deretter ble 500 ul av RPMI 1640-medium med 10% FBS tilsatt til det nedre kammer. Etter 12 timer ble cellene på den øvre overflate av transwell membranene fjernet av en bomullspinne. Cellene som invaderte gjennom membranen til den nedre overflate ble fiksert med metanol og farget med eosin. Cellene ble telt under et lysmikroskop.
sårtilheling Analyser
sårtilheling analysene ble utført som tidligere rapportert [17]. I korthet ble cellene transfektert og dyrket i 48 timer og dyrket til et sammenflytende cellemonolag. Deretter ble en lineær » viklet » trekkes i cellemonolaget med en plastpipette spiss. Cellene ble inkubert ved 37 ° C, og såret ble avbildes umiddelbart og overvåket etter 24 timer. Avstanden mellom de to kantene av «såret» ble beregnet.
luciferase Analyser
A549 celler ble transfektert med RBP2 siRNA på dag 1, og med E-cadherin promoter reporter plasmid (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) på dag 2. For å overvåke transfeksjon effektivitet, en Renilla luciferase reporter plasmid kontroll styrt av tymidin-kinase-promoter ble kotransfektert inn i cellene. Beas2B-celler ble transfektert med pcDNA3-HA-RBP2 plasmid, og de ovennevnte to plasmider reporter. Etter 48 timer ble en dobbel luciferase-rapportøranalysesystemet (Promega, Madison, WI, USA) ble anvendt for å bestemme luciferase-aktivitet. E-cadherin reporter plasmid hadde samme promotersekvensen (-799 til -579) som tidligere ble beskrevet [18].
Statistiske analyser
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS17.0 programvare. Den χ
2 test ble benyttet for å analysere forholdet mellom clinicopathological funksjoner og RBP2 uttrykk. Bivariate sammenhenger mellom RBP2, E-cadherin, N-cadherin og sneglen ble også analysert av χ
2 test. Andre statistiske analysene ble utført ved hjelp av en Student t-test. Dataene er vist som gjennomsnitt ± SD av 3 uavhengige tester. En statistisk signifikant forskjell ble vurdert når
P
0,05.
Resultater
Relasjoner mellom RBP2 og clinicopathological funksjonene i NSCLC
For å studere rollene RBP2 i lungekreft, må vi først oppdaget uttrykk for RBP2 i NSCLC vev og deres tilsvarende normale vev ved hjelp av immunhistokjemi (figur 1A). Resultatene ble oppsummert i tabell 1. Prøver som overuttrykt RBP2 stod for 52,46% av kreftprøver, og de fleste av disse prøvene viste middels til sterk farging. Men prøver med RBP2 overekspresjon utgjorde bare 29,79% av de tilstøtende normale lunge vev, og de fleste av disse prøvene viste svak til middels flekker. Ekspresjonen av RBP2 var betydelig høyere i de NSCLC-prøvene enn i den normale lunge vev (tabell 1). Nivåene av RBP2 i 10 lungekreft vev og deres tilsvarende normalt lungevev ble ytterligere påvist ved hjelp av western blot og real-time PCR-analyser. Resultatene viste at både RBP2 protein og mRNA ble økt i de lungekreft vev (fig 1B 1C).
A. Immunohistochemistrical analyse av RBP2, E-cadherin, N-cadherin og snegl (forstørrelse × 200). RBP2, N-cadherin og sneglen var sterkt positiv i begge adenokarsinom og plateepitel karsinom prøver, mens E-cadherin var svakt farget eller unstained. B. Western blot-analyse av den RBP2 proteinet. N = normal lungevev, C = lungekreft vev. C. Real-time PCR-analyse av RBP2 mRNA. Nivået på RBP2 mRNA var høyere i lungekreft vev enn i normal lunge vev (
P
= 0,0011). *
P
0,05 og **
P
0,01.
Variabel
n
Overuttrykte * (n)
Overuttrykte rate (%)
χ
2
P
Cancer tissue613252 . .465.5810.018Adjacent tissue471429.79Table 1. uttrykk av RBP2 i NSCLC vev og deres tilstøtende normalt vev product: *: et siste farging score ≥ 4 ble definert som overekspresjon, og en avsluttende flekker poengsum 4 ble definert som nonoverexpression. CSV Last ned CSV
Deretter analyserte vi forholdet mellom RBP2 og pasientenes clinicopathological funksjoner, blant annet pasientens alder, kjønn, patologisk type differensiering og TNM klassifisering. Resultatene viste at det var ingen klar sammenheng mellom overekspresjon av RBP2 og disse funksjonene (tabell 2).
RBP2 (overekspresjon *)
Variabel
No. av pasientene
ingen
ja
P
Age0.099≤50 years321220 50 years291712Gender0.167Male331320Female281612Pathological type0.757Squamous371720Adeno241212Differentiation0.532Well1064Moderate261313Poor251015T classification0.415T1-2411823T3-420119N classification0.533N0291514N1321418Table 2 .. Korrelasjon av clinicopathological variabler med RBP2 protein hos NSCLC vev product: *: et siste farging score ≥ 4 ble definert som overekspresjon, og en avsluttende flekker poengsum 4 ble definert som nonoverexpression. CSV Last ned CSV
Effekter av RBP2 på NSCLC cellemigrasjon
For å undersøke hvilken rolle RBP2 i lungekreft metastaser, undersøkte vi om RBP2 regulerer cellemigrasjon. Først må vi oppdaget at inhiberingen av RBP2 av de tre RBP2 sirnas i A549-celler for å velge den mest effektive siRNA. Western blot analyse viste at nivået av RBP2 protein var høy i kontroll A549-celler og redusert etter RNA-interferens av RBP2. Viktigere, den RBP2 siRNA2 gruppen viste den laveste uttrykk for RBP2 protein (figur 2A). Videre ble det uttrykk for RBP2 i RBP2 siRNA2 gruppen oppdaget av immunfluorescens analyse. Resultatene viste at RBP2 var negativ i RBP2 siRNA2 gruppen, men positiv i kontrollgruppen (figur 2B). Således, valgte vi RBP2 siRNA2 for uttømming av RBP2 i de følgende forsøk. Deretter ble de cellulære trekkende atferd av A549 celler og Beas2B celler undersøkt ved hjelp av transwell invasjon assay og sårheling assay. Sammenlignet med kontrollgruppen, færre A549 cellene passerte gjennom matrigel etter deleption av RBP2 mens mer Beas2b celler passerte da RBP2 var oppregulert (figur 3A sample- og 3B). Konsekvent var det færre A549 celler som migrerte fra «såret» kant til midten plass når RBP2 ble nedregulert, men antallet migrerte Beas2b-celler ble signifikant økt etter overekspresjon av RBP2 (fig 3C 0,05, **
P
0,01 og ***
P
0,001. C. Antallet migrerte celler. Antallet migrerte Beas2B celler økte betydelig når transfektert med pcDNA3-HA-RBP2 plasimid (
P
= 0,0010), mens færre A549 celler migrert inn i sentrum plass når transfektert med RBP2 siRNA2 (
P
= 0,0014). *
P
0,05, **
P
0,01 og ***
P
0,001. D. sårheling analyser (forstørrelse x 100).
Bivariate korrelasjoner av RBP2 med E-cadherin, N
–
cadherin eller snegl i NSCLC vev
For å undersøke rollene RBP2 i kreft metastase, vi studert effekten av RBP2 på EMT, som EMT er nært korrelert med kreft metastase [19]. Først ble E-cadherin, N-cadherin og sneglen oppdaget i lungekreft vev og deres tilsvarende normal lunge vev ved hjelp av immunhistokjemi (figur 1A). Frekvensen av prøvene som overexpressed E-cadherin redusert i kreftvevet i forhold til sine nærliggende normalt vev (normal vs kreft, 80,85% vs 40,98%,
P
0,01), men frekvensen av prøvene at uttrykt N-cadherin eller sneglen økt i kreftvevet (normal vs kreft, N-cadherin, 12,77% vs 72,13%,
P
0,01; normal vs kreft, snegl, 17,02% vs 68,85%,
P
0,01). Deretter ble bivariate korrelasjoner av RBP2 med hver av disse tre proteinene analysert ved den χ
2-test. Resultatene viste at ekspresjon av RBP2 var signifikant omvendt korrelert med ekspresjonen av E-cadherin (tabell 3), men det var ingen signifikant sammenheng mellom RBP2 og N-cadherin eller snegl (tabell 3).
RBP2 (overekspresjon *)
Variabel
No. av patients
no
yes
P
E-cadherin0.032overexpression*25169nonoverexpression*361323N-cadherin0.095overexpression*441826nonoverexpression*17116Snail0.276overexpression*421824nonoverexpression*19118Table . 3. Korrelasjoner mellom RBP2 og E-cadherin, N-cadherin og snegl i NSCLC vev product: *: Et siste flekker score ≥ 4 ble definert som overekspresjon, og en avsluttende flekker poengsum 4 ble definert som nonoverexpression. CSV Last ned CSV
Effekter av RBP2 på EMT i NSCLC cellelinjer
For ytterligere å bekrefte effekten av RBP2 på EMT, vi har oppdaget uttrykk for RBP2, E-cadherin, N-cadherin og sneglen i Beas2B celler, A549 celler og SK-MES-1 celler ved hjelp av western blot og real-time PCR-analyser. Western blot analyse viste at ekspresjon av RBP2, N-cadherin og snegl økt, mens ekspresjon av E-cadherin redusert i Beas2B celler transfektert med pcDNA3-HA-RBP2 plasmid (figur 4A). I mellomtiden, både A549 og SK-MES-1 celler oppviste lavere nivåer av RBP2, N-cadherin og snegle-proteiner og høyere nivå av E-cadherin protein når transfektert med RBP2 siRNA2 (figur 4A). Tilsvarende real-time PCR-analyse viste videre at RBP2, N-cadherin og snegle mRNA øket og nivået av E-cadherin mRNA ble redusert i Beas2B celler behandlet med pcDNA3-HA-RBP2 plasmid (figur 4B). I tillegg ble det observert både i A549 og SK-MES-1-celler som ble behandlet med RBP2 siRNA2 (figur 4C) lavere nivåer av RBP2, N-cadherin og snegle mRNAer og et høyere nivå av E-cadherin mRNA.
A. Western blot analyse av RBP2, E-cadherin, N-cadherin og sneglen uttrykk i Beas2B, SK-MES-1 og A549 celler. Når Beas2B-celler ble transfektert med pcDNA3-HA-RBP2 plasmid, nivåene av RBP2, N-cadherin og snegle-proteiner øket, og nivået av E-cadherin-proteinet redusert. Når SK-MES-1, og A549-celler ble transfektert med RBP2 siRNA2, nivåene av RBP2, N-cadherin og snegle proteiner ble økt, og nivået av E-cadherin-proteinet redusert. B. Real-time analyse av innholdet av E-cadherin, N-cadherin og sneglen mRNA i Beas2B cellene. Nivået av E-cadherin mRNA var høyere i de Beas2B celler behandlet med pcDNA3-HA-RBP2 plasmid enn i kontrollcellene (Beas2B
P
= 0,0005), men nivåene av N-cadherin og snegle mRNA var lavere (N-cadherin,
P
= 0,0063; sneglen,
P
= 0,0101). *
P
0,05, **
P
0,01 og ***
P
0,001. C. Real-time analyse av innholdet av E-cadherin, N-cadherin og sneglen mRNA i A549 celler. Nivået av E-cadherin mRNA var lavere i A549 celler behandlet med RBP2 siRNA2 enn i kontroll A549 celler (
P
= 0,0007), men nivåene av N-cadherin og sneglen mRNA var høyere (N- cadherin,
P
= 0,0037; sneglen,
P
= 0,0014). *
P
0,05, **
P
0,01 og ***
P
0,001.
Effekter av RBP2 på E-cadherin promoter
Fordi Huang et al. bekreftet at RBP2 kan direkte binde seg til promotor-regionen (-799 til -579) av E-cadherin [18] ved anvendelse av en CHIP assay, undersøkte vi aktiviteten av den samme E-cadherin promoter region ved hjelp av et luciferase-analyse i A549 og Beas2B celler. Når A549-celler ble transfektert med RBP2 siRNA2, E-cadherin promoter-aktivitet betydelig høyere (figur 5A), mens E-cadherin promoteraktivitet dramatisk redusert etter RBP2 overekspresjon i Beas2B celler (Figur 5B).
A. Eelevated E-cadherin promoter aktivitet i A549 celler transfektert med RBP2 siRNA2 (
P
= 0,0098). *
P
0,05, **
P
0,01. B. Hemming av promotoren aktivitet i Beas2B celler transfektert med pcDNA3-HA-RBP2 plasmid (
P
= 0,0075). *
P
0,05, **
P
0,01. C. Ekspresjon av p-Akt og Akt-proteiner i A549-celler behandlet med RBP2 siRNA2. D. Nivåene av p-Akt, N-cadherin og sneglen proteiner i A549 celler. Når A549 celler ble behandlet med LY294002, ble uttrykket av disse tre proteinene redusert
Effekter av RBP2 på N
-.
Cadherin og sneglen
Begge N- cadherin og snegl har vist seg å være nedstrøms for PI3K /Akt sti [20,21]. Derfor hypotese vi at RBP2 regulert N-cadherin og sneglen gjennom aktivering av Akt signalering, og vi undersøkte nivåene av p-Akt og Akt i A549 celler ved hjelp av western blot analyse. Resultatene viste at p-Akt protein var høy i A549-celler og nedsatt etter uttømming av RBP2 (figur 5C). Ekspresjonen av p-Akt positivt korrelert med ekspresjonen av RBP2. Deretter for å bekrefte effekten av Akt signalering på ekspresjon av N-cadherin og snegl, behandlet vi A549-celler med et PI3K-inhibitor (LY294002) i 24 timer og undersøkt på nivåer av N-cadherin og snegle-proteiner. LY294002 er blitt vist å blokkere PI3K-avhengig fosforylering og Akt-kinase-aktivitet. Interessant, nivåene av både N-cadherin og sneglen falt (figur 5D). Derfor uttrykk for N-cadherin og snegl var positivt forbundet med uttrykket av p-Akt.
Diskusjoner
RBP2, en nylig identifisert histone demetylase, tilhører den Jarid familie og besitter en arid (A /T rik interaksjon domene). Det opptar ofte og regulerer arrangører av flere gener som inneholder H3K4me3 [5,22]. Enda viktigere er RBP2 antas å delta i mange celle biologiske funksjoner, særlig i tumorbiologi. Vår studie avslører en ny innsikt i patofysiologien av EMT, og vi gir bevis for at RBP2 induserer EMT i NSCLC.
RBP2 spiller en viktig rolle i menneskelig kreft. For eksempel er overekspresjon av RBP2 hemmer senescens av magekreftceller [11]. Uttømming av RBP2 svekker spredning, men fremmer alderdom og differensiering i mus som mangler menn1 og Rb1 [23]. Drug toleranse av lungekreftceller krever RBP2 [24]. Knockdown av RBP2 ført til økte nivåer av H3K4me3 på arrangører av DAF og HMOX1 gener i Beas2B celler [25]. RBP2 opp-regulerer ekspresjonen av cyclin D1, E1 og cyclin grin ß1 å forbedre celle proliferasjon, migrering og invasjon [12]. I denne artikkelen har vi også oppdaget uttrykk for RBP2 hos NSCLC vev og analysert forholdet mellom RBP2 og hver av de clinicopathological funksjonene i NSCLC. Resultatene viste at RBP2 ble overuttrykt i human NSCLC, men det var ingen signifikant sammenheng mellom overekspresjon av RBP2 og hver clinicopathological funksjon. I tillegg ble effekten av RBP2 på migrering av lungekreftceller undersøkt, og vi har funnet at RBP2 kunne forbedre NSCLC cellulær migrasjon. Alle disse data tyder på at RBP2 er et onkogen og gi veiledning for kreftbehandling.
EMT er en sentral skritt i kreft metastasering. I løpet av denne prosess, har kreftceller avledet fra epitelceller miste deres epitelceller egenskaper, for eksempel cellulær adhesjon, men erverve mesenchymale egenskaper, for eksempel celle motilitet, for å unnslippe fra den primære vev og invadere omgivende stroma [26-30]. Epitelial cadherin (E-cadherin), en celle adhesjonsmolekyl, er en nøkkel molekyl av EMT. Det spiller en viktig rolle i å opprettholde epithelial fenotype. Fraværet av E-cadherin fører til et tap av epitelial morfologi [31]. Interessant er den reduserte ekspresjon av E-cadherin ofte ledsaget av øket ekspresjon av neural cadherin (N-cadherin) [32]. N-cadherin har vist seg å svekke celleadhesjon og markedsbrystkreftcelle invasivitet [32,33]. Sneglen er en annen viktig molekyl EMT. Det har blitt bekreftet at sneglen overekspresjon forbedrer kreft invasjon ved å fremme cellemotilitet [34]. I dette eksperimentet, ble RBP2 vist til oppregulerer ekspresjonen av E-cadherin og nedregulerer ekspresjonen av N-cadherin og snegle. Disse resultatene indikerer at RBP2 er i stand til å indusere EMT. Nylig, Teng et al. bekreftet at RBP2 fremmet kreft metastase ved å aktivere integrin β1 [12]. Her presenterer vi en ny mekanisme som RBP2 kan spille en rolle i kreft metastase ved å fremkalle EMT.
E-cadherin er vel vist seg å være en viktig formidler av EMT, og forstyrrelse av E-cadherin er bevist å være en årsak til EMT. For eksempel, Cheng et al. og Masszi et al. funnet at TGF-β1 var ute av stand til å indusere EMT i nærvær av celle-celle-kontakt [35,36]. Masszi et al. konkluderte med at fraværet av E-cadherin-mediert celle-celle-kontakt ble ettergivende for induksjon av EMT. I samsvar med Masszi et al., Zheng et al. rapportert at TGF-β1 ikke kan indusere EMT i konfluent rørformet epitelceller, men at overekspresjon av E-cadherin i fibroblaster indusert mesenchymale-epitelial overgang og hemmet EMT i tubulære epitelceller [37]. Flere transkripsjonsfaktorer er blitt vist å kontrollere EMT ved å undertrykke E-cadherin promoteraktivitet og undertrykke E-cadherin uttrykk [38,39]. I denne artikkelen, undersøkte vi om RBP2 indusert EMT ved å undertrykke E-cadherin promoter aktivitet og hemme E-cadherin uttrykk. Fordi Huang et al. bekreftet at RBP2 direkte bundet til E-cadherin promoter region (-799 til -579) [18], undersøkte vi aktiviteten av den samme E-cadherin promoter-regionen og funnet at RBP2 faktisk svekket E-cadherin promoter-aktivitet. Disse resultatene indikerer at RBP2 nedregulerer ekspresjon av E-cadherin ved å hemme aktiviteten av promoteren E-cadherin.
mekanismen som regulerer RBP2 N-cadherin og snegl ble også undersøkt i dette papiret. Mye bevis peker på en kritisk rolle Akt signalering på EMT. For eksempel, aktivering av Akt signale fremmer TGFβ- og EGF-avhengige EMT [40,41]. Akt kan også phosphorylate IKKα å øke snegle uttrykk [20]. Biflorin blokkert invasivitet av cellene ved å nedregulere N-cadherin, mest sannsynlig via Akt signalering [21]. Her er våre observasjoner viste at RBP2 oppregulert uttrykk for N-cadherin og sneglen via aktivering av Akt signalering, og Akt inhibitor kan blokkere effekten av RBP2 på uttrykk for N-cadherin og snegle.
Nylig Teng et al. gjorde cDNA microarray analyse hos NSCLC celler [12]. Og de fant at 10 gener som deltar i metastase ble vesentlig endret etter uttømming av RBP2, inkludert Dihydropyrimidinase lignende 3, inte β1, oppløst stoff carrier familie 7 11, oppløst stoff carrier familie syv medlem 5, desmoglein 2, sfingosin-1-fosfat lyase 1 , kollagen type 1 α1, tropomyosin 1α, celledeling syklus 42 og protocadherin β10. Men denne studien ikke analysere virkningene av RBP2 på E-cadherin, N-cadherin og snegl som er viktige molekyler involvert i kreft metastasering. Vår forskning beriker mekanismene for RBP2 formidlet cancer metastase.
Dessuten emt har vist seg å resultere i ervervet resistens mot gefitinib i NSCLC-celler [42]. Samtidig er RBP2 viktig å gefitinib motstand hos NSCLC celler [24]. Ifølge våre resultater, antyde vi at RBP2-mediert gefitinib motstand hos NSCLC celler kan være nært knyttet til effekten av RBP2 på EMT.
Medikamentell behandling er en viktig behandling for lungekreft. Tatt i betraktning dagens fattige overlevelse, er nye terapeutiske mål presserende behov. Det har blitt demonstrert at RBP2 er overuttrykt i lungekreft, og dets ekspresjon er sterkt assosiert med cancer celleproliferasjon, invasjon, migrering og medikamenttoleranse. Våre eksperimenter viste at RBP2 kan indusere EMT i NSCLC. Alle disse studiene viser at RBP2 er et potensielt mål for kreftbehandling anti-lunge.
Takk
Vi vil gjerne takke William G. Kaelin, Jr. (Howard Hughes Medical Institute, Dana -Farber Cancer Institute og Brigham and Women Hospital, Harvard Medical School, USA) for plasmidene.
