Abstract
Innledning
Vi beskriver en roman 3D co-kulturen modellere ved hjelp av ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinjer i kombinasjon med lunge fibroblaster. Denne modellen gjør at etterforskningen av tumor-stroma interaksjoner og adresserer betydningen av å ha en mer in vivo som cellekultur modell.
Metoder
Automation-kompatible multi vel hengende slipp mikrotiterplater ble brukt for produksjon av 3D-mono- og ko-kulturer. I disse hengende faller to NSCLC cellelinjer A549 og Colo699 ble dyrket enten alene eller co-kultivert med lunge fibroblaster. Levedyktigheten av tumor kuler ble bekreftet etter fem og ti dager ved hjelp Annexin V /propidiumjodidfarging for flow-cytometri. Tumor fibroblast sfæroid dannelse ble karakterisert ved scanning-elektronmikroskop (SEM), semi-tynne snitt, fluorescens mikroskop og immunhistokjemi (IHC). I tillegg til vanlig histologi, protein uttrykk for E-cadherin, vimentin, Ki67, fibronektin, cytokeratin 7 og α-glatt muskel aktin (α-SMA) ble undersøkt ved IHC.
Resultater
lavere levedyktighet ble observert i A549 monokulturer i forhold til co-kulturer, mens Colo699 monokulturer viste bedre levedyktighet i forhold til co-kulturer. Ki67 ekspresjon variert betydelig mellom mono- og co-kulturer i begge tumorcellelinjer. En økning av vimentin og redusert E-cadherin ekspresjon kan påvises i løpet av dyrking foreslå en overgang til en mer mesenchymale fenotype. Videre viste det fibroblastcellelinje et uttrykk for α-SMA kun i ko-kultur med kreftcellelinje A549, for derved å indikere en mesenchymale til mesenchymale skifte til en enda mer myofibroblast fenotype.
Konklusjon
Vi viser at vår fremgangsmåte er et lovende verktøy for generering av tumor sfæroide ko-kulturer. Videre har disse sfæroider tillate undersøkelse av tumor-stroma interaksjoner og en bedre refleksjon av in vivo-betingelser for kreftceller i deres mikromiljø. Vår metode har potensial til å bidra til utvikling av kreftlegemidler og støtte jakten på biomarkører
Citation. Amann A, Zwierzina M, Gamerith G, Bitsche M, Huber JM, Vogel GF, et al. (2014) Utvikling av et nyskapende 3D Cell Culture system for å studere Tumor – Stroma Interaksjoner i ikke-småcellet lungekreft celler. PLoS ONE 9 (3): e92511. doi: 10,1371 /journal.pone.0092511
Redaktør: Donald Gullberg, Universitetet i Bergen, Norge
mottatt: 03.06.2013; Godkjent: 24 februar 2014; Publisert: 24 mars 2014
Copyright: © 2014 Amann et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert ved hjelp av en Ph.D tilskudd av den østerrikske Society of hematologi og onkologi (OeGHO) og ytterligere finansielt støttet av Verein für Tumorfoschung. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Angå Insphero (J. Kelm) og affilation til forfatternes arbeid: Dette forfatteren har bidratt med sin lange erfaring i 3D cellekultur til denne artikkelen. Videre ble forfatterne støttet av selskapet i form av 3D-cellekulturplater for sine eksperimenter. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
På grunn av den økende forståelse av mekanismene som er relevante for dannelsen av kreft, er vi opplever en overgang fra sykdom til målrettet terapi. Som en konsekvens, fremtiden for molekyl målrettet terapi av kreft ligger i å identifisere undergrupper av pasienter som har nytte av spesielle terapier som treffer spesifikke strukturer som uttrykkes av den maligne cellen. Ett stort hinder for utvikling av disse individuelle terapeutiske regimer, er imidlertid den begrensede tilgjengeligheten av prediktive in vitro-modeller. Den kritiske utfordringen er å utvikle cellekultur modeller bedre reflekterer in vivo forhold og dermed støtte etterforskningen av prediktive biomarkører som har potensial til å øke verdien av kreftmedisin og redusere størrelse, kostnader og feilrater av kliniske studier.
ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er en av de viktigste årsakene til kreft dødsfall i mannlige og kvinnelige pasienter over hele verden.
Bare 15% -20% av dem er diagnostisert på et tidlig stadium [1] . Prognosen er fortsatt dårlig med en 5-års overlevelse varierer fra ca 60% for stadium I til mindre enn 5% for stadium IV svulster [2].
Pasienter diagnostisert med lokalavansert sykdom krever multimodalitet behandling for å oppnå lang -term ettergivelse eller kurere mens pasienter med metastatisk sykdom får platina-basert kjemoterapi, enten alene eller i kombinasjon med EGFR eller ALK-hemmere [3] -. [5]
Mange andre molekylære målrettede midler har blitt testet i kliniske forsøk, men klarte ikke å vise en fordel for pasienter vedrørende progresjonsfri overlevelse og total overlevelse [6]. Flere av disse studiene som mål å definere biomarkører i en prospektiv eller retrospektiv måte, men kun et svært begrenset antall har blitt identifisert [7], [8].
Så langt cellebaserte analyser for å utforske cellebiologi og legemidlets effekt sikte på voksende celler på to-dimensjonale plastoverflater eller i enkeltcellesuspensjon [4]. Biologien til cellene, men blir sterkt påvirket av deres mikromiljø krever cellebaserte analyser som gjenspeiler effekten av faktorer som for eksempel den ekstracellulære matriks (ECM), celle-celle-kontakter, celle-matriks interaksjoner, celle polaritet og oksygenprofiler [ ,,,0],5] -. [8]
Konvensjonell todimensjonale (2D) cellekultursystemer dyrket på kunstig plastflater har store begrensninger. For eksempel krever de store ikke-fysiologiske føtalt kalveserum (FCS) konsentrasjoner og næringstilførsel ved å endre medium hver 2-3 dager. I motsetning til det, 3D-teknikker unngå plastoverflater slik at cellene til å danne sin ECM og krever betydelig redusert FCS konsentrasjoner. Ikke bare cellemorfologi men også medikamentsensitivitet av kreftceller i 2D-systemer er forskjellige i forhold til i 3D-cellekulturer [9], [15]. Celler dyrket på plastflater vanligvis viser en økt følsomhet for cytotoksiske medikamenter, mens forbindelser målretting celle – celle adhesjon, cellemodning, epitelial-mesenchymale overgang (EMT) og stemness funksjoner viser ofte en redusert effekt i 3D cellekultur. Dermed 3D cellekultur modeller reflektere in vivo tumorvekst mer pålitelig og kan gi bedre avlesninger for narkotika testing [9], [15], [10].
De fleste 3D-systemer bruker celle sfæroide aggregater og stillaset kultur-systemer . Disse systemene støtter 3D cellevekst av kunstig produserte ekstracellulære homologer (f.eks kollagen, matrigel, stillas) tilrettelegging celle adhesjon og aggregering. Andre 3D-systemer bruker flytende overlay teknologi, fiber meshwork laget av biokompatible polymerer, faste eller porøse perler eller ekstracellulære matriser og deres erstatninger og krever tillegg av kunstig produserte kosttilskudd for å oppnå 3D voksende cellekulturer [16] -. [19]
Den henger slipp er et veletablert cellekultur metode for å danne sfæriske microtissues fra udødeliggjorte og primære cellelinjer [20] – [22]. I motsetning til de fleste flytende overlegg teknologi, muliggjør den hengende dråpe-metoden den nøyaktige kontroll over den initielle celleblanding i hvert microtissue [23], [24]. For å generere multicelletypen co-kultur microtissues verken tillegg eller kunstige stillaser ligne ekstracellulære matrix-komponenter (for eksempel kollagen matrigel) må fylles ut.
Basert på en automatisering og høy gjennomstrømming kompatibel hengende dråpe teknologien vi etablert en organotypiske ko-kultur-modeller som består av to forskjellige ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinjer i kombinasjon med lungefibroblaster. Denne metoden gjør det mulig ikke bare etterforskningen av tumor-stroma interaksjoner og representerer en mer in vivo som 3D cellekultur modell for å studere legemiddel svulst interaksjoner, men kan også bli implementert i fremtidige legemiddelkampanjer.
Materialer og metoder
Cell kultur
NSCLC cellelinjer A549 og Colo699 (DSMZ, ACC107, ACC196) og lunge fibroblast cellelinje SV-80 (CLS, 300 345) ble brukt for våre eksperimenter. For 2D kultur, cellelinjer ble dyrket som monolag i DMEM lav glukose (PAA, Pasching, Østerrike) supplert med 10% FCS (Sigma-Aldrich, Munchen, Tyskland, Lot 010M3396) og 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin oppløsning, 2 mM L-glutamin (PAA). Celler ble dyrket ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2-inneholdende atmosfære.
3D-cellekultur
For produksjon av 3D-mono- og ko-kulturer GravityPLUS ™ microtissue kultur system (InSphero AG, Zürich, Sveits) ble brukt. Platen består av en ramme med 8 x 12 brønners innsatser og en perifer kanal fylt med 2-3 ml sterilt vann for å tilveiebringe en fuktighetsbarriere som reduserer fordampning av medium fra dråpene. Denne rammen er plassert på en bunn-brett som er fylt med 5 ml 0,2 x fosfatbufret saltvann (PBS) (PAA) med 0,1% Triton X-100 (Sigma), igjen for å redusere fordampningen fra dråpene. Brønnen er delt i tre elementer, (i) innløps på hvilken pipettespissene er plassert direkte på overflaten av brønnen, (ii) kulturen rommet, og (iii) en microchannel som forbinder innløpet og dyrkningsrommet. Hver brønn er fjærbelastet for å kompensere for eventuelle små variasjoner i tippe høyder av 96-brønnhoder pipettes.
Etter at cellene var blitt dyrket subconfluently i cellekulturplater (Falcon) de ble sådd på den hengende dråper. Deretter ble cellene vasket en gang med PBS og spaltet med 1 x Accutase (PAA) i ti minutter ved 37 ° C. Deretter ble fordøyelse stoppet, og cellene ble vasket en gang med 20 ml cellekulturmedium. Deretter ble cellene telles og sådd i 40 mL dråper i ulike celletall (monokulturer: SV-80 og A549: 2500 celler /40 mikroliter, Colo699: 1250 celler /40 mikroliter, co-kulturer: carcinoma celle: fibroblast forholdet 01:02 /40 ul). Medium utveksling ble utført etter fire dager og kulene ble høstet etter fem og ti dager ved å laste 100 mL PBS (PAA) på de mikrokapil å skylle ut kulene. De fallende dråper som inneholder sfæroidene ble deretter oppsamlet med en 96-brønn U-bunnplate (Falcon) som er plassert under microcapillary platen.
CFSE farging av fibroblaster.
For det fluorescerende merking fibroblaster den CellTrace ™ CFSE Cell Proliferation Kit (molekylære prober, Invitrogen) ble brukt. Fibroblaster ble løst opp og justert til 1 x 106 i 1 ml PBS /0,1% bovint serumalbumin (BSA) .CFSE oppløsning ble tilsatt for å oppnå en endelig arbeidskonsentrasjon på 10 uM. Cellene ble deretter inkubert i 10 minutter ved 37 ° C. Deretter ble farging stanset med fem volumer iskald cellekulturmedium og inkubert i 5 minutter på is. Deretter ble cellene vasket tre ganger med cellekulturmedium. Merkede Fibroblaster ble nå sådd ut som ko-kulturer med karcinomceller som beskrevet i 3D-cellekultur-delen.
Flow-cytometri
Åtte microtissues, høstet i 96-brønners plater ble overført til 5 ml FACS-rør (Falcon) og vaskes en gang med 2 ml PBS. Etterpå microtissues ble oppløst til en enkelt cellesuspensjon ved tilsetning av 300 ul Accumax (Miltenyi Biotech) per microtissue å inkubere dem i 20 minutter ved 37 ° C. Etter ti minutter microtissues ble blandet og pipettert opp og ned for å oppnå en homogen løsning. Denne prosedyren ble gjentatt etter 20 minutters inkubering. Nå fordøyelsen ble stoppet med 2 ml fullstendig cellekulturmedium, og deretter ble cellene sentrifugert ved 300 g i ti minutter, og vasket to ganger med 0,5% BSA /PBS. Etterpå ble cellene farget med 4 mL propidium jodid (PI) fargeløsning og 4 ul av Annexin V APC. Farging ble utført i 100 ul bindingsbuffer Annexin tatt fra Annexin V Apoptose Detection Kit I (Becton Dickinson) i 15 minutter. Til slutt ble cellene analysert på en FACS BD Calibur umiddelbart. Hver data måling ble gjort opp fra åtte sammenslåtte microtissues, gjenta hele prosedyren uavhengig tre ganger.
Volum beregning av microtissues
Seks microtissues av mono- og co-kulturer ble evaluert av en omvendt lys mikroskop (Motic AE31) fra dag én til ti. Etter fem, syv og ti dager, ble to diametre (d) i hver microtissue målt, og volumet ble beregnet ved hjelp av formelen V = av 4/3 * Π * r
3, hvor r = ½ * √ d1 * d2 [ ,,,0],25]. Volum Målingen ble gjentatt tre ganger. Deretter gjennomsnitt og standardavvik ble beregnet og statistisk signifikans testet med t-test i Microsoft Excel.
Immunhistokjemisk analyserer
Prøvepreparering.
Microtissues ble skylt i PBS og deretter umiddelbart fiksert ved nedsenking i kaldt 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS i fire timer ved romtemperatur. Microtissues ble deretter skylt i PBS og igjen innleiret i 2% agarose (Invitrogen). Overflødig agarose ble fjernet med en skalpell, og agarose blokkene inneholder microtissues var dehydrert i graderte alkoholer og innebygd i parafinvoks (Paraplast vanlig, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) En MICROM ERGO stjerne rotasjonsmikrotom (MICROM, Walldorf, Tyskland) ble brukt til å ta seriesnitt av 4 um tykkelse. En tre til fire serier av paraffinized Seksjonene ble så montert i en buktende mønster på Superfrost Plus-objektglass (Menzel-Glaser, Braunschweig, Tyskland) og tørket over natten, og deretter brent ved 60 ° C i en time for å overholde delene fast til skinnene. For CYTO arkitektonisk orientering, hver tiende lysbildet var hematoxylin /eosin farget (HE) med en Shandon Varistain 24-4 Slide Stainer (Histocom Wien, Østerrike).
sera.
verter, fortynninger , inkubasjonstider og kilder til primære antistoffer samt varme-indusert epitop gjenfinning (HIER) er gitt i tabell 1.
Immunocytochemistry
Immunocytochemistry ble gjennomført på 4 mikrometer deler av parafininnstøpte microtissues i en Ventana Roche Discovery Immunostainer (Mannheim, Tyskland) i henhold til DAB-MAP funn forskning standard prosedyre. Om nødvendig, ble antigen gjenfinning initiert av varme-indusert avsløring av epitoper mens lysbildene ble nedsenket i samsvar med produsentens instruksjoner (kort eller standard for forskjellige inkubasjonstider) i EDTA buffer (Cell Conditioning Solution CC1, Ventana). Etter inkubering av seksjoner med de primære antistoffer (som er oppført i tabell 1.) ved 37 ° C, et biotinylert immunoglobulin blanding av geit-anti-mus IgG, geit anti-mus IgM, geite-anti-kanin-IgG og protein blokken (Discovery Universal Antistoff , Ventana) ble påført i 30 minutter ved romtemperatur. Påvisningen ble oppnådd ved bruk av DAB-MAP Detection Kit (Ventana) i henhold til diaminobenzidin (DAB) utviklingsmetode. Seksjonene ble endelig kontra med hematoksylin (Ventana) i fire minutter. Deretter deler var manuelt dehydrert i nedgradert alkohol serien, ryddet i xylen og deksel gled permanent med Entellan (Merck, Darmstadt, Tyskland).
Digitale bilder av he- og immunostained lysbilder ble kjøpt i AxioVision mikroskop programvare knyttet til en AxioCam HRc fargekamera og en Axioplan 2-mikroskop (Zeiss, Jena, Tyskland).
Ki67 positivitet ble bestemt ved telling Ki67 positive og negative cellekjerner i tre forskjellige sfæroider av A540 og Colo699 i mono- og co- kulturer representativt. Deretter ble den prosentandelen av positive cellekjerner til helcelle tall beregnet. Gjennomsnitt og standardavvik og statistisk signifikans ble beregnet som beskrevet før.
Fluorescensmikroskop
Microtissues i mono- og co-kulturer ble høstet som beskrevet ovenfor og vasket en gang med PBS. Etterpå ble tumor microtissues fiksert med 4% PFA i to timer ved 4 ° C og vasket tre ganger med PBS. Nå ble de blokkert ved inkubering med PBS inneholdende 2% BSA (Sigma) /0,3% Triton X-100 (Roche) i en time ved romtemperatur. Microtissues ble deretter inkubert i 40 minutter med 50 ug /ml phalloidin Atto 633 (Sigma) ved romtemperatur i mørket. Deretter ble de igjen vasket fem ganger med PBS og ble deretter inkubert i fem minutter med 1,5 ug /ml DAPI (Invitrogen) ved værelsestemperatur i mørket. Etter vask en gang med PBS microtissues ble brakt inn på et objekt lysbilde med fluorescerende montering medium (Dako Glostrup, Danmark) og ble analysert på en LSM 510 Meta konfokalmikroskop (Zeiss).
Scanning elektronmikroskopi (SEM)
Tumor microtissues ble fiksert med 2,5% glutaraldehyd (BioChemika Fluka) i 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,4). Etter en kort vask i PBS, etterfulgt av post-fiksering i en time med 1% vandig osmium-tetroksyd (ReagentPlus; Sigma-Aldrich), prøvene ble gradvis dehydratisert med etanol. Etter tørking (CPD 030, Bal-Tec), ble microtissues montert på aluminiumsstubber med dobbeltsidig teip, frese-belagt med 10 nm-gull /palladium (Au /Pd) (Bal-Tec) og undersøkt med et felt utslipp scanning elektronmikroskop (Gemini 982, Zeiss, Göttingen, Tyskland).
Semi-tynne snitt
Tumor microtissues ble behandlet i henhold til standard teknikk for transmisjonselektronmikroskopi. Microtissues ble fiksert i Karnovsky sin fikseringsmiddel (2,5% glutaraldehyd og 2% paraformaldehyd i 0,1 M kakodylatbuffer) over natten og deretter vasket tre ganger (10 minutter hver) i 0,1 M kakodylatbuffer, fulgt av fiksering med 1% osmiumtetraoksid i 0,05 M kakodylatbuffer ved 4 ° C i 1 time. Overdreven osmiumtetraoksid ble fjernet ved å skylle microtissues tre ganger (10 minutter hver) i 0,1 M kakodylatbuffer. Microtissues ble deretter dehydratisert med etanol (2 x 70% etanol hver 30 minutter, 2 x 96% etanol hver 30 minutt i 2 x 100% etanol hver 30 minutter) og aceton (2 x hver 30 minutter) før inkubasjon i en fortynning av flytende epoksyharpiks (Epon medium blanding: 20 ml embed-812, 16 ml DDSA, 8 ml NMA og 1,2 ml BDMA, elektronmikroskopi Sciences, München, Tyskland) og aceton i et forhold på 30% til 70% i tre timer. De microtissues ble infiltrert med en blanding av Epon og aceton i like store deler ved 4 ° C over natten i lukkede beholdere. Den neste dag, væsken ble erstattet med en blanding av 70% epoxyharpiks og 30% aceton i tre timer. Deretter microtissues ble inkubert to ganger i 100% Epon (3 timer og ved 4 ° C over natten). Deretter ble ren epoksyharpiks endret, og de microtissues var infiltrert med Epon i et vakuumkammer i 2 timer. Microtissues ble deretter overført til en innebygging mugg, merket og plassert i et vakuumkammer i ytterligere 1 time. Microtissues ble overført til en inkubasjon kammer ved 60 ° C i 48 timer for å øke polymerisering av epoksyharpiksen. En mikrometer seksjoner ble kuttet på en Leica ULTRACUT mikrotom, farget med toluidinblått ved 60 ° C, og deretter undersøkt ved hjelp av et lysmikroskop.
Resultater
Tumor microtissue formasjon
først undersøkte vi arrangementet av tumorceller og fibroblaster inn i kulene i løpet av dyrkningsperioden. For dette formål SEM bilder (figur 1) av A549 og Colo699 mono- og ko-kulturer ble tatt etter ti dagers dyrking. I tillegg ble det A549 /Colo699 mono- og co-kulturer forberedt for semi-tynne snitt og farget med toluidin blå (figur 2)
SEM bildene ble tatt etter ti dager. Monokulturer av A549 og SV80 ble sådd i et forhold på 2500 celler /40 ul, mens Colo699 monokulturer ble dyrket i form av 1250 celler /40 ul. Alle co-kulturer ble sådd i en carcinoma celle: fibroblast forhold på 01:02 /40 mikroliter (A549 co-kulturer: 2500 kreftceller +5000 fibroblaster /Colo699 co-kulturer: 1250 kreftceller +2500 fibroblaster). (A /B) A549 monokulturer, (C /D) A549-ko-kulturer; (E /F) Colo699 monokulturer, (G /H) Colo699 co-kulturer; (I /J) SV80 monokulturer. Alle co-kulturer vises en mer homogen og rundere microtissue overflate i forhold til monokulturer.
Semi-tynne seksjoner (1 mikrometer skiver) av A549 /Colo699 mono- og co-kulturer etter ti dager med dyrking farget med toluidin. Bar i alle bilder: 20 mikrometer. A549 cellene danner robuste kuler som likner et mer flerlags vev og viser en ru overflate. Colo699 monokulturer avsløre kule struktur med et løst underlag. Når fibroblaster legges begge cellelinjene bygge en mer kompakt microtissue med en vanlig underlag.
Som vist i SEM bilder og semithin seksjoner, A549 cellene danner robuste kuler som likner et mer flerlags vev og viser en ru overflate. Etter fem dager microtissues ikke hadde fullt dannet og fikk lett forstyrret under høsting prosedyren. I motsetning til dette, når de anvendes i ko-kultur i disse cellene danner tette kuler med glatte overflater. I semithin seksjoner fibroblaster kan oppfattes som at celler som har en flat morfologi hovedsakelig arrangert nær overflaten av microtissues.
I løpet av dyrkings Colo699 monokulturer avsløre kule struktur med et løst underlag. Når fibroblaster tilsettes disse kuler bygge en mer kompakt sfæroide med en fast overflate. Da alle cellene hadde den samme morfologi, imidlertid, tumorceller og fibroblaster kunne ikke bli diskriminert i semithin seksjoner.
I motsetning til de kreftcellelinjer, SV80 fibroblaster danne små kuler tett ser med en glatt overflate når dyrket alene .
Som alle co-kulturer viste en mer homogen overflate med en stram arkitektur, bestemte vi oss for å undersøke om dette avhenger av ECM produksjon av cellene. I figur 3 viser vi at SV80 cellene er betydelig produksjon fibronektin når dyrket på egen hånd, mens både tumorcellemonokulturer var helt negativ for fibronektin. I Colo699 co-kulturer ECM ble jevnt fordelt gjennom hele microtissue. Men i A549 ko-kulturer fibronektin var hovedsakelig utskilt av celler som er bygget opp av ringlignende konstruksjon rundt den indre kjernen av microtissue.
Fibronectin ble vist i microtissues etter ti dager. (Bar i A549 /SV80 monokulturer: 50 pm, bar i alle andre microtissues: 100 mikrometer); Utskillelse av fibronektin kunne observeres i microtissues inneholder fibroblaster, mens alle tumorcellemonokulturer ingen fibronektin sekresjon kunne påvises.
Vekstkurve og stabilitet av tumor microtissues
Tre microtissues av mono . – og co-kulturer ble evaluert ved lysmikroskop og etter fem, syv og ti dager microtissue volumer ble beregnet (figur 4A)
A: Microtissue volumene ble beregnet ved hjelp av formelen V = 4/3 * * Π r3, hvor r = ½ * √ d1 * d2. Midlere volum er vist i μm3 med de tilsvarende standardavvik. B: Midlere og standard avvik av Ki67 positivitet ble beregnet ved å telle Ki67 positive og negative cellekjerner på stykker av tre forskjellige kuler representativt. Deretter ble den prosentandelen av positive cellekjerner til helcelle cumber beregnet. Ko-dyrking av begge cellelinjer med en fibroblastcellelinje førte til en betydelig oppregulering (p 0,05). Av Ki67-ekspresjon i alle microtissues
Det var ikke mulig å beregne sfæroide mengder A549 microtissues fordi i monokulturer disse cellene ikke danner runde eller ellipsoide formet kuler. Det samme problemet utviklet seg med A549 co-kulturer som bare begynte å danne runde målbare kuler etter fem dager. Derfor er den første beregnings A549 ko-kulturen volum ble gjort på dag syv, hvor et volum på 63 um
3 ble målt. I løpet av tre dager volumet av denne co-kulturen økt til 81 mikrometer
3.
Colo699 monokulturer vist en kontinuerlig økning i volum fra 43 mikrometer
3 til f 83 mikrometer
3. I motsetning til dette, Colo699 ko-kulturer viste et volum på 74 um
3 etter fem dager med en reduksjon i volum til 39 um
3.
i SV80 monokulturer en jevn volum på 33 um
3 etter fem dager til 27 mikrometer
3 etter ti dager kunne observeres.
til slutt microtissue volumene ble sammenlignet med hverandre med t-test. Etter ti dager en betydelig økning av volumet kan måles i A549 co-kulturer og Colo699 monokulturer i forhold til enten SV80 monokulturer eller Colo699 co-kulturer. På den annen side, etter fem dager volumet av Colo699 co-kulturer hadde vært betydelig høyere sammenlignet med Colo699 og SV80 monokulturer (figur 4A).
For å undersøke celle levedyktighet, en Annexin V APC og propidium jodid (PI ) FACS-analysen ble etablert. SV80-celler ble inkubert med CFSE før såing, således levedyktighet av kreftceller og fibroblaster kunne måles uavhengig ved diskriminering i FACS-analyser. Microtissues ble høstet, spaltet med Accumax og inkubert med PI og Annexin V APC. Analyser ble utført på en FACS BD Calibur system. Hver søyle representerer den gjennomsnittlige cellelevedyktigheten til 24 ulike microtissues målt i tre uavhengige går. For statistisk evaluering t-test ble benyttet (figur 5).
Fibroblaster ble inkubert med CFSE før opprinnelig seeding dem sammen med tumorceller i hengende dråper. Apoptose ble målt enten etter fem eller ti dager. Hver søyle representerer den gjennomsnittlige cellelevedyktigheten til 24 kuler og deres tilsvarende standardavvik som ble målt i to forskjellige løyper (Vesentlige forskjeller er merket med *, p 0,05). Dot blot representerer FACS analyser av ett løp med A549 celler i co-kultur med SV80 fibroblaster etter ti dager med dyrking. A: Spesifikk levedyktighet av kreftceller i mono-og co-kulturer vises. B: levedyktighet ensomme fibroblaster i mono-og co-kulturer vises. C: Fordelingen mellom fibroblaster og kreftceller etter fem og ti dager vises. D: Hele microtissue levedyktighet vises etter fem og ti dager
A549 monokulturer viste 77% av levedyktige celler etter fem dager med en minimal økning i levedyktigheten etter ti dager til 79%.. Ko-kulturer med fibroblaster viste en signifikant økning i levedyktighet fra 60% etter fem dager til 79% etter ti dager. Colo699-celler viste 93% av levedyktige celler etter fem dager uten reduksjon i levedyktigheten til 92% etter ti dager. I co-kulturer vedvart 82% av levedyktige celler etter fem dager og 76% etter ti dager. Når levedyktigheten til SV80 celler ble analysert, ble en svak økning fra 65% etter fem dager til 67% etter ti dager vist. Imidlertid kan en betydelig reduksjon i levedyktighet fra Colo699 monokulturer til Colo699 ko-kulturer bli observert (figur 5D).
Som et neste trinn, levedyktigheten av de to forskjellige fraksjonene, tumorceller og fibroblaster ble analysert ved å skille dem ved strømningscytometri. A549 kreftceller i ko-kulturene forble levedyktige i løpet av inkubasjon med en levedyktighet på 74% etter fem dager, og 71% etter ti dager. I Colo699 co-kulturer økt levedyktighet kunne observeres fra 78% etter fem til 89% etter ti dager, viser en betydelig bedre levedyktighet i forhold til A549 co-dyrkede kreftceller etter ti dager (figur 5A).
En lignende observasjon ble gjort om levedyktigheten av fibroblaster i microtissues. Når co-dyrket sammen med A549 kreftceller, SV80 celler viste en signifikant oppregulering i levedyktighet fra 46% etter fem dager til 71% etter ti dager. I Colo699 ko-kulturer også økt levedyktighet, men ikke i betydelig grad varierer mellom 70% etter fem til 83% etter ti dager. Samtidig kan en betydelig bedre levedyktighet for fibroblaster ved samtidig dyrket sammen med Colo699 celler etter fem dager vises i forhold til A540 co-kulturer (figur 5B).
Videre forholdet mellom fibroblaster og kreftceller i ko-kulturer ble analysert etter fem og ti dager. Når ko-kulturer ble dyrket i hengende dråpe, ble kreftceller og fibroblaster alltid sådd i et forhold på 1:2 (2500 kreftceller /5000 fibroblaster). Etter fem dager i begge ko-kulturene en nesten jevn fordeling mellom fibroblaster og kreftceller kunne observeres, varierende fra 43% fibroblaster til 57% tumorceller i A549-ko-kulturer og 49% til 51% i Colo699 ko-kulturer. Imidlertid kan etter ti dager signifikant flere tumorceller enn fibroblaster i begge ko-kulturene bli vist. I A549 co-kulturer, 19% og i Colo699 co-kulturer 14% av alle celler ble identifisert som fibroblaster (figur 5C).
Cell organisasjon og protein uttrykk mønster
Etter inkubasjon A549 og Colo699-celler alene eller i ko-kultur med fibroblaster i fem og ti dager, ble immunhistokjemiske analyser utført (figur 5-7 /tabell 2). Vimentin ble valgt som et protein som angir et skifte til en mesenchymal fenotype i epitelceller. α-SMA-ekspresjon tyder på en enda mer mesenchymale fenotype av fibroblaster og reflekterer en mesenchymale til mesenchymale overgang. E-cadherin, en epitelcelle-bindingsproteinet, ble valgt som en markør for adherente celler og Ki67 som en celle-proliferasjon og aktivering markør. Tre forskjellige kuler ble analysert for hvert protein flekker og påfølgende skiver av en celleklump vises representativt her (figur 7-9)
(A) Colo699 monokulturer etter ti dager.; (B) Colo699 co-kulturer etter ti dager; DAPI (blå) ble anvendt for farging av cellekjerner, Phalloidin Atto 633 (rød) for visning av F-aktin og CFSE (grønn) som en cytoplasmatisk flekk for fibroblaster (Bar i A /B: 50 um). Fibroblaster kan fortsatt påvises i microtissues etter fem dager med co-dyrking med Colo699
IHC skiver av A549 i mono- og co-kulturer etter fem og ti dager (Bar i AD. 100 mikrometer, bar i Insert: 25 mikrometer); en økning i vimentin og en samtidig reduksjon i E-cadherin vises i co-kulturer. Også en oppregulering av Ki67 ekspresjon i co-kulturer ble oppdaget
IHC skiver Colo699 i mono- og co-kulturer etter fem og ti dager (Bar i A /C:. 50 mikrometer, bar i B /D: 100 mikrometer, bar i Insert: 25 mikrometer); Sammenlignet med monokulturer Colo699 co-kulturer dannet mye mindre kuler. Imidlertid positive fargereaksjoner for E-cadherin og vimentin er sammenlignbare med monokulturer i en periode på ti dager. etter ti dager fordi det ble oppdaget noen forskjell i fargemønsteret mellom fem og ti dager. Microtissues var helt positive for vimentin og Ki67, mens ingen E-cadherin og α-SMA uttrykk ble observert
IHC skiver av SV80 i monokulturer etter ti dager (Bar i A: 100 mikrometer).;
