Abstract
Latent transformerende vekstfaktor β-bindende protein 4 (LTBP4) er en ekstracellulær matriks molekyl som er et medlem av viktige bindevev nettverk og er nødvendig for riktig folding og sekresjon av TGF-β1 . LTBP4 er nedregulert i karsinom i ulike vev. Her viser vi at LTBP4 er også nedregulert i adenokarsinomer og plateepitelkarsinom i spiserøret
in vitro Hotell og
in vivo
. Re-uttrykk for LTBP4 i esophageal kreft cellelinjer reduserte celle migrasjon evne, mens celle levedyktighet og celleproliferasjon forble uendret. Hypermethylation av promotorområdene for de to hoved menneskelig LTBP4 transkripsjons former, LTBP4L og LTBP4S, ble funnet å være involvert i LTBP4 lyddemping. Detaljerte undersøkelser av metylering mønstre av promotorområdene av LTBP4L og LTBP4S identifisert GATA1, SP1, E2F4 og SMAD3 som potensielle transkripsjonsfaktorer som er involvert i LTBP4 uttrykk. I
in vitro
transkripsjonsfaktor aktivitetsstudier oppdaget vi E2F4 som roman kraftig regulator for LTBP4S uttrykk
Citation. Bultmann jeg, Conradi A, Kretschmer C, Sterner-Kock A (2013) Latent Trans vekstfaktor β-Binding Protein 4 Er nedregulert i Esophageal Cancer via Arrangøren Metylering. PLoS ONE 8 (5): e65614. doi: 10,1371 /journal.pone.0065614
Redaktør: Klaus Roemer, Universitetet i Saarland Medical School, Tyskland
mottatt: 19 februar 2013; Godkjent: 26 april 2013; Publisert: 31. mai 2013
Copyright: © 2013 Bultmann et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Maria Pesch-Foundation (National Science Funding Organisation). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i 2008 kreftfaren var med anslagsvis 482,000 nye tilfeller den åttende vanligste kreftformen i verden, og med 407000 dødsfall den sjette vanligste dødsårsaken [1]. I USA median alder av diagnostisering av spiserørskreft er 68 år og ca 80% av alle nye tilfeller diagnostisert hos menn. Den 5-års overlevelse satsen økt fra 5% i 1975 til 19% i 2001 [2]. I Europa gjennomsnittsalderen for diagnose er 70 år og 67% av nydiagnostiserte tilfeller er menn. Den 5-års overlevelse rate er 9,8% mye lavere enn i USA [3].
De to dominerende histologiske typer esophageal kreft er adenokarsinomer (EAC) og plateepitelkarsinom (ESCC) . Begge tilsynelatende varierer i sine mønstre av forekomst og har en egen distinkte etiologi [4]. I Europa er 1-års relativ overlevelse av pasienter med ESCC er 33,9% og 37,9% av EAC-pasienter, men er 5-års relativ overlevelse med 10,1% og 10,6%, henholdsvis nesten identisk [3]. En etablert risikofaktor for EAC og ESSC er sigarettrøyking, mens alkoholforbruk antas som risikofaktor bare for ESCC [4]. Mens, fedme, gastroøsofageal reflukssykdom og Barretts øsofagus er bare risikofaktorer for EAC [4]. Det daglige inntaket av frisk frukt og grønnsaker er forbundet med redusert risiko for både histologiske typer spiserørskreft [4].
Endringer i den ekstracellulære matrise spiller en viktig rolle i kreftutvikling av spiserørskreft. Degradering og redusert ekspresjon av ekstracellulære matriksproteiner er relatert til tumorprogresjon, inkludert invasjon og vandrende potensial, så vel som metastasering, celleproliferasjon og angiogenese [5].
Det ekstracellulære matriks-protein latent transformerende vekstfaktor β bindende protein 4 (LTBP4) er en av fire isoformer av LTBPs (LTBP1-4) og tilhører fibrillin /LTBP familie av glykoproteiner. LTBP1, LTBP3 og LTBP4 bindes kovalent til transformerende vekstfaktor-Ss (TGF-B) og er nødvendig for riktig folding og sekresjon av TGF-B [6], [7]. LTBP4 binder bare TGF-β1, mens LTBP1 og tre bind alle tre TGF-beta isoformer [7].
TGF-β1 er en pluripotent og allestedsnærværende cytokin som tilhører en super av strukturelt relaterte vekstfaktorer med godt dokumenterte roller i cellulær proliferasjon, differensiering, apoptose, adhesjon, og ekstracellulær matriks avsetning [8], [9].
i tillegg til å være avgjørende for chaperoning og transport av TGF-β utenfor cellen, LTBPs har vist seg å være assosierte medlemmer av bindevev nettverk slik som microfibril /elastisk fibernett og fibronektinet nettverk [10]. Innlemmelsen av LTBPs inn i ECM er avgjørende for regulering av latent TGF-β lagring og aktivisering [11]
Ulike transkripsjonsformer LTBP4 finnes hos mennesker og de viktigste formene er lang. (LTBP4L; NM_001042544) og en kort (LTBP4S; NM_001042545) form. Ved hjelp av to uavhengige promo begge transkripsjonelle former er uttrykt i forskjellige uttrykk mønstre i en vev-spesifikk måte [12].
Det har vist seg at feilregulert ekspresjon av LTBP isoformer er relatert til starten av epitel-neoplasmer [13] , [14], [15], [16], [17], [18]. LTBP1 er nedregulert i en rekke humane epitel-neoplasmer i leveren, eggstokkene og nevroendokrine tumorer i fordøyelsessystemet [14], [16], [18]. LTBP2 er nedregulert i ESCC og nasofaryngeale karsinom [13], [15]. LTBP4 er nedregulert i menneskelige og murine ductal carcinoma
in situ Hotell og adenokarsinomer [17].
Mekanismene som fører til nedregulering av LTBPs i ulike epiteliale svulster er i stor grad ukjent. Men for LTBP2 det er kjent at hypermethylation av promoteren er ansvarlig for nedregulering i ESCC og nasofaryngeale karsinomer [13], [15].
Den foreliggende studien undersøker protein ekspresjon av det ekstracellulære matriksprotein LTBP4 i forskjellige stadier av spiserørskreft progresjon, så vel som i forskjellige adenokarsinomer i mage-tarmkanalen. Videre undersøkte vi potensialet reguleringsmekanisme ansvarlig for LTBP4 inaktivering i spiserørskreft.
Resultater
LTBP4 er nedregulert i ulike stadier av esophageal kreft progresjon
I denne studien vi undersøkte protein ekspresjon av LTBP4 i gastrointestinale karcinomer og spesielt i neoplasier og preneoplasias i spiserøret. Derfor vi først vurderes ekspresjonen av LTBP4 nivåer i forskjellige kreftmicroarray ved immunhistokjemisk farging.
Analyse av pasientens vev av forskjellige adenokarsinomer i mage-tarmkanalen avslørte betydelig nedregulering av LTBP4 i forhold til normalt vev i samme organ . I detalj, adenokarsinomer i spiserør viste 37%, av magen 17% av bukspyttkjertelen 9%, av tynntarm 4% og for tykktarms 22% LTBP4 uttrykk (figur 1A).
A) LTBP4 protein uttrykk nivåer var bedømt ved immunhistokjemi i microarray for pasient adenokarsinomer (AC) i spiserør, mage, bukspyttkjertel, tynntarm og tykktarm sammenlignet med normalt vev fra det samme organet. B) LTBP4 protein uttrykk nivåer ble vurdert ved immunhistokjemi i pasient vev av spiserørskreft progresjon i forhold til normal esophageal vev i microarray. C) Immunhistokjemisk evaluering av LTBP4 uttrykk i normal spiserøret, esophageal adenokarsinom (EAC) stadium II, EAC stadium III og i en fjern lymfeknutemetastase. Svarte piler indikerer LTBP4-positiv farging. Data er presentert ± standard avvik og * p 0,05, ** p 0,01 versus normalt vev. Søylediagrammer: 50 pm
Videre har vi fokusert mer presist på LTBP4 uttrykk i neoplasier og preneoplasias i spiserøret (figur 1B).. vises Cancer tilstøtende normalt vev 43%, hyperplasi 22%, carcinoma
in situ
8%, EAC 37%, småcellet udifferensiert karsinom 3%, ESCC 4% og fjernmetastaser 4% LTBP4 uttrykk i forhold til normal esophageal vev. Sammenlignet med normal esophageal vev LTBP4 ekspresjon ble også signifikant nedregulert i pasientens vev av refluksøsofagitt (38%) og kronisk inflammasjon (39%), begge risikofaktorer for EAC (figur 1B).
Normal esophageal vev tydelig demonstrert LTBP4 uttrykk i esophageal epitelceller og mindre fremtredende i bosatt lymfocytter i lamina propria (figur 1C og saksdokumenter S1). LTBP4 ble ikke uttrykt i stadium II og stadium III EACs (figur 1C). I fjernt lymfeknutemetastase, kreftceller også viste ingen LTBP4 uttrykk, mens det omkringliggende mesenchymale vev tydelig viste LTBP4 uttrykk (figur 1C). Det ble imidlertid ikke sammenheng mellom LTBP4 uttrykk nivåer og kliniske parametre som patologisk stadium eller metastatisk status funnet (data ikke vist).
Re-uttrykk for LTBP4 i esophageal carcinoma cellelinjer reduserer cellemigrasjon evne
LTBP4 uttrykk var signifikant nedregulert i EAC og ESCC. For å undersøke hvilken rolle LTBP4 i spiserørskreft mer detaljert, OE33, en cellelinje avledet fra EAC, og KYSE180, en cellelinje avledet fra ESCC, ble analysert.
Begge cellelinjer viste lignende LTBP4 uttrykk ved transkripsjonen og proteinnivå (Hjelpemiddel Informasjon S1). Forbigående re-uttrykk for LTBP4 (transfeksjon effektivitet på 40-50%) i OE33 og KYSE180 celler resulterte i en fire og ni ganger oppregulering av LTBP4 henholdsvis (Hjelpemiddel Informasjon S1). De mindre båndene etter transient re-ekspresjon av LTBP4 kan reflektere som mangler posttranslasjonelle modifikasjoner, en virkning som tidligere beskrevet [19]. Partiell proteolyse kan bli utelatt, da LTBP4 og c-myc kunne detekteres som et fusjonsprotein. Den forbigående re-uttrykk for LTBP4 modifisert evne OE33 og KYSE180 celler til å migrere. Etter 24 timer migreringen avstand på OE33 celler ble redusert med 5% (p = N.S.) og av KYSE180 celler med 30% (p 0,05) sammenlignet med kontrollvektor transfekterte celler (figur 2A). Immunfluorescens farging viste at LTBP4 og c-myc positive celler definert grensene til cellen gratis gap. Kun ikke-transfekterte celler migrert inn i det cellefrie spalten (figur 2B). Celleviabilitet og celleproliferasjon endret seg ikke etter re-ekspresjon av LTBP4 i OE33 og KYSE180 celler (data ikke vist).
A) Migrering avstand på OE33 og i KYSE180 celler etter transient transfeksjon med enten pcDNA6 som en kontroll eller pcDNA6-LTBP4 innen 24 timer. Forsøkene ble gjentatt minst 3 ganger. Symbolene representerer resultatene fra hver enkelt eksperiment og grafene dokumentere de respektive gjennomsnittsverdier. Betydninger er gitt:
#p = N.S. og * p 0,05. B) Representant immunfluorescens farging av migrasjon analysen utført med KYSE180 celler re-uttrykke LTBP4. LTBP4 (grønn) og c-myc (rød) positive celler (gul) definerte grenser i cellen gratis gap. Kun ikke-transfekterte celler migrert inn i det cellefrie gap. Kjerner ble kontra med DAPI (blå). Pilen indikerer migrering retning. Søylediagram. 50 mikrometer
Demetyler behandling med 5-aza-2′-deoxycytidine induserer LTBP4 uttrykk, mens TGF-β1 uttrykk ikke endres
epigenetiske modifikasjoner, for eksempel metylering av cytosinrestene i CpG-sekvenser, såkalte CpG øyer, er kjent for å regulere inaktivering av tumorsuppressorgener i kreftceller [20]. Etter demetylering behandling med 5-aza-2′-deoksycytidin LTBP4 ekspresjon ble indusert i OE33 og KYSE180 celler ved mer enn 150% og 60%, respektivt (figur 3A), mens demetylering behandling med 5-aza-2′-deoksycytidin ikke gjorde signifikant endring TGF-β1 ekspresjon i begge spiserørskreft cellelinjer (figur 3B).
A) qPCR-analyse viste induksjon av LTBP4 ekspresjon i OE33 og KYSE180 celler etter demetylering behandling med 5-aza-2′-deoksycytidin. B) qPCR analyse viste ingen signifikante endringer i TGF-β1 uttrykk i OE33 og KYSE180 celler etter demetylering behandling med 5-aza-2′-deoxycytidine. Ubehandlede celler tjente som kontroll. Forsøkene ble gjentatt minst 3 ganger og den midlere verdi ble beregnet. Data er presentert ± standardavvik og * p. 0,05 versus kontroll
LTBP4 promoter regioner hypermethylated i spiserørskreft cellelinjer
Vi har analysert de antatt uavhengige promoter regioner i LTBP4L og LTBP4S i det N-terminale område av det genomiske
LTBP4
DNA-sekvens [12]. I denne regionen åtte CpG-øyer (I-VIII) er blitt funnet, inkludert to CpG øyene (I og II) innenfor den forutsagte LTBP4L promoteren og tre CpG-øyer (IV-VI) befinner seg innenfor den forutsagte LTBP4S promoteren. CpG øyer III, VII og VIII ligge innenfor umiddelbar nærhet av promotorstrukturene (figur 4).
Metyleringen status i de antatte LTBP4 promotorområdene ble analysert ved klonal bisulfitt sekvensering i OE33 og KYSE180 celler. Åtte CpG-øyer ble identifisert og minst ti kloner ble sekvensert for hver cellelinje. Prosentandelen av metylering i hvert CpG island er visualisert som sektordiagram. Eksoner er illustrert av svarte bokser og LTBP4 arrangører av røde linjer. Oversettelsen start setene er angitt (ATG). De stiplede linjer representerer alternativ spleising av LTBP4.
Detaljert analyse av metylering status av CPG øyene i OE33 og KYSE180 avslørte at de CpG øyene (III, VII, VIII) fjernt til promotorområdene metylering var sjelden ( 3%) funnet (figur 4)
CPG øyer som ligger innenfor LTBP4L promoter ble hypermethylated (figur 4).. I OE33 og KYSE180 celler CpG island jeg viste en gjennomsnittlig metylering av ca 50% og 80% og CpG island II 45% og 60%, henholdsvis (figur 4).
CPG øyer som ligger innenfor LTBP4S arrangøren vises ulike metylering mønstre. CpG øy V og VI viste mindre enn 2% metylering, mens CpG øy IV viste i OE33 og KYSE180 cellene en gjennomsnittlig metylering på 40% og 30%, respektivt (figur 4).
Identifisering av potensielle transkripsjonsfaktorer for LTBP4L og LTBP4S
Videre
i silico
analyse av nettbaserte søkeverktøy MatInspector [21], TFSEARCH [22] og arrangøren 2.0 [23] ble utført for å undersøke om genomisk sekvens av CpG øyer I, II og IV i LTBP4L og LTBP4S promoter regioner inneholde regulatoriske elementer. Ingen av de vanlige promotorelementer, så som TATA- eller CCAAT-bokser ble funnet, noe som er i overensstemmelse med tidligere funn [12]. Det ble vist at promotorområdene av LTBP4L og LTBP4S inneholde flere XCPE nettsteder samt bindingssteder for ulike transkripsjonsfaktorer [12]. CpG øyer I, II og IV inneholdt ikke XCPE områder, men mulige bindingsseter for transkripsjonsfaktorer GATA1, SMAD3, E2F4, SP1, og MZF-en ble funnet (Hjelpemiddel Informasjon S1).
Detaljert undersøkelse av metylering mønstre av CpG island jeg avdekket to svært denaturert CpG dinukleotider i begge cellelinjene som en del av en antatt GATA1 bindingsstedet (figur 5).
i silico
analyse av LTBP4 promoter nettsteder identifisert et høyt metylert bindingssete for GATA1 i LTBP4L formidler av OE33 og KYSE180 celler. Meget metylert bindingsseter for SP1 og E2F4 er funnet i LTBP4S formidler av både cellelinjer. En bindingssetet for SMAD3 ble identifisert i nærheten. Metyleringen statusen ble analysert ved klonal bisulfitt sekvensering og minst ti kloner ble sekvensert for hver cellelinje. Prosentandelen av metylering er visualisert som sektordiagram. Eksoner er illustrert av svarte bokser og LTBP4S og LTBP4L arrangører av røde linjer. Oversettelsen start setene er angitt (ATG). De stiplede linjene representerer alternativ spleising av LTBP4.
I CpG island IV to svært denaturert CpG dinukleotider ble funnet i begge cellelinjer (figur 5). Disse CpG-dinukleotider har blitt identifisert som en del av det antatte bindingssetet av enten transkripsjonsfaktor SP1 eller E2F4. I tillegg ble 13 nukleotider oppstrøms for høyt metylert CpG dinukleotider et bindingssete for SMAD3 identifisert (figur 5).
Vi brukte
in vitro
transkripsjonsfaktor aktivitet studier for å vurdere om transkripsjonsfaktorer Gata1 , SP1, SMAD3 og E2F4, identifisert som mulige regulatoriske elementer i CpG øyer i og IV, var i stand til å endre aktiviteten til LTBP4L eller LTBP4S arrangører. Uttrykket av transkripsjonsfaktorer ble verifisert ved SDS-PAGE og immunoblotting (Hjelpemiddel Informasjon S1).
Som vist i figur 6, observerte vi at Gata1 noe økt LTBP4L promoter aktivitet, men endret ikke LTBP4S promoter aktivitet ( Figur 6A).
HEK293 celler ble transient transfektert med pGL4.10-LTBP4L eller pGL4.10-LTBP4S og en
Renilla
luciferaseekspresjon vektor for normalisering. Celler ble også ko-transfektert med forskjellige konsentrasjoner av A) en Gata1 ekspresjonsvektor, b) en SP1 ekspresjonsvektor, c) en SMAD3 ekspresjonsvektor eller D) et E2F4 ekspresjonsvektor. Etter 24 timer ble cellene lysert og luciferase aktiviteter ble bestemt. Forsøkene ble gjentatt minst 3 ganger og den midlere verdi ble beregnet. Data er presentert ± standardavvik.
Vi observerte en konsentrasjonsavhengig økning av enten LTBP4L eller LTBP4S promoter aktivitet av SP1 og SMAD3, men LTBP4S promoter aktivitetsøkning var mye mer fremtredende enn LTBP4L promoter aktivitet øke (Figur 6B og figur 6C). LTBP4L promoter aktivitet ble ikke endret ved E2F4, men E2F4 økt litt LTBP4S promoter aktivitet (figur 6D).
For å undersøke en mulig Enhancer funksjon av Gata1, SP1, SMAD3 og E2F4, vi har også bestemt aktiviteten av LTBP4L og LTBP4S arrangører knyttet til en minimal promoter.
Det var ingen åpenbare endringer med Gata1, SP1, SMAD3 (data ikke vist) eller E2F4 (figur 7) på LTBP4L promoter aktivitet og Gata1, SP1 eller SMAD3 på LTBP4S promoter aktivitet, da LTBP4 promotorer ble koblet til en minimal promoter (data ikke vist). Men E2F4 førte til en 14-dobling av LTBP4S promoter aktivitet, når koblet til en minimal promoter (figur 7).
HEK293 celler ble transient transfektert med pGL4.23-LTBP4L eller pGL4.23-LTBP4S og en
Renilla
luciferaseekspresjon vektor for normalisering. Celler ble også ko-transfektert med forskjellige konsentrasjoner av et E2F4 ekspresjonsvektor. Etter 24 timer ble cellene lysert og luciferase aktiviteter ble bestemt. Forsøkene ble gjentatt minst 3 ganger og den midlere verdi ble beregnet. Data er presentert ± standardavvik.
Diskusjoner
Den ekstracellulære matrix protein latent TGF-β bindende protein 4 (LTBP4) blir nedregulert i menneskelige og murine duktale karsinomer
in situ
, invasive brystcarcinomer [17], [24], så vel som i canine brystcarcinomer [25], noe som indikerer en mulig fylogenetisk konservert regulering av LTBP4 uttrykk. I en alder av 6-8 måneder Ltbp4S knockout mus utvikler tykktarms adenokarsinomer [26]. Disse resultater indikerer at fravær av LTBP4 kan spille en rolle i utviklingen av epiteliale neoplasmer.
Nå har vi funnet at LTBP4 er nedregulert i forskjellige humane adenokarsinomer i mage-tarmkanalen, så vel som i neoplasier og preneoplasias i spiserøret .
til dags dato er ingen molekylære biomarkører for diagnose eller for risikovurderingen og vurdering av esophageal kreft brukt i klinisk praksis [27]. Våre resultater tyder på LTBP4 som en mulig kandidat-gen for en biomarkør panel for neoplasier og særlig preneoplasias av esophageal vev.
LTBP4 er ikke den eneste LTBP som er relatert til dannelsen av forskjellige krefttyper [13], [14 ], [15], [16], [18], [28]. I svulster i leveren, er eggstokkene og nevroendokrine svulster i fordøyelsessystemet uttrykk for LTBP1 redusert [14], [16], [18]. Ltbp3 er nedregulert i tumorspesifikke aktivert mus T-celle populasjoner i forhold til naive T-celler [28]. I nasofaryngeale karsinom og ESCC LTBP2 uttrykk er redusert og re-uttrykk for LTBP2 i ESCC tumorceller undertrykker neoplastisk kapasitet
in vitro Hotell og
in vivo product: [13], [15]. Våre resultater viser en lignende effekt for LTBP4
in vitro
. Re-uttrykk for LTBP4 i EAC og ESCC cellene reduserer cellemigrasjon evne, mens celle levedyktighet og celleproliferasjon forblir uendret. Disse dataene antyder at LTBP4 spiller en spesiell rolle i å fremme EAC og ESCC cellemotilitet. Men, for å oppdage de underliggende molekylære mekanismene som fører til redusert cellemotilitet ytterligere undersøkelser er nødvendig.
Et godt studert transkripsjonsregulerende mekanisme, som ofte endres i løpet av ondartet transformasjon, er metylering av CpG øyer i arrangører [29 ]. Tidligere ble det vist at promoteren metylering er ansvarlig for redusert ekspresjon av LTBP2 i nasofaryngealt karsinom og ESCC [13], [15]. Våre resultater viser at demetylering behandling fører til oppregulering av LTBP4 i EAC og ESCC cellelinjer og høyere LTBP4 uttrykk reduserer kreftcellemigrering. Demetylering behandling gjenoppretter LTBP2 uttrykk i ESCC cellelinjer og høy LTBP2 uttrykk korrelerer med bedre overlevelse av ESCC pasienter [13]. Dermed kunne epigenetisk behandling av spiserørskreft med hypomethylating agenter være en ny terapeutisk tilnærming, siden epigenetiske behandling med azacitidin demonstrere første lovende resultater i pasienter med myelodysplastisk syndrom, bedre deres livskvalitet og overlevelse [30]. Selvfølgelig, denne romanen lovende terapeutisk tilnærming av spiserørskreft trenger nærmere undersøkelser.
LTBP4L og LTBP4S er spådd til å bli transkribert fra kontroll av to uavhengige arrangører [12]. Detaljerte analyser av metylering mønstre av både arrangører i cellelinjer avledet fra EAC og ESCC avsløre svært denaturert mulige bindingssteder for ulike transkripsjonsfaktorer, som for eksempel GATA1, SMAD3, E2F4 og SP1.
Et sterkt denaturert antatte bindingssetet for GATA1 er identifisert i LTBP4L promoter-regionen. Potensielle bindingsseter for GATA1 er også funnet i oppstrøms regionen LTBP1S [31], noe som tyder på en mulig regulering av ulike LTBP isoformer av GATA1. Men vår
in vitro
transkripsjonsfaktorer aktivitet studier viser bare en svak induserende effekt for Gata1 på LTBP4L uttrykk og ingen effekt på LTBP4S uttrykk.
LTBP4S promoter regionen inneholder svært denaturert mulige bindingsseter for den transkripsjonsfaktorer SP1 og E2F4 og i tillegg en antatt bindingssete for SMAD3 er identifisert 13 nukleotider oppstrøms for sterkt metylerte CpG-dinukleotider. SP1 transkripsjonsfaktorer er viktige regulatorer av ulike ekstracellulære matrix proteiner [32] og SMAD3 bindingssteder er nødvendig for induksjon av menneskelig LTBP3 promoter aktivitet av TGF-β1 [33]. Våre
in vitro
transkripsjonsfaktor aktivitet studier viser at SP1 og SMAD3 heller regulere LTBP4S enn LTBP4L. Videre viser E2F4 den mest fremtredende effekt på regulering av LTBP4S, men E2F4 fungerer bare som en potent regulator av LTBP4S uttrykk i kombinasjon med en TATA-boks som regulerende element. Så vidt vi vet, disse resultatene er de første til å avsløre en sammenheng mellom LTBPs og transkripsjonsfaktoren E2F4. Tidligere studier identifiserte en viktig rolle for E2F4 i regulering av differensiering og utvikling av forskjellige celler, slik som adipocytter [34], erytrocytter [35], [36] og calvarial osteoblast progenitor-celler [37]. Mangel på E2f4 i mus fører til postnatal død på grunn av en nedsatt utvikling av luftveisepitel [38]. Interessant, mennesker med mutasjoner i LTBP4 viser en lignende, litt mildere lunge fenotype, dø tidlig i livet på grunn av en svekket lungeutvikling og vise kraniofaciale avvik, inkludert microretrognathia, flat midface, avtagende panne og brede fontanelles [39]. Ltbp4S knockout mus også utvikle en lunge fenotype med nedsatt lungeutvikling, men ingen åpenbare kraniofaciale avvik [26], [40]. Disse resultatene er lovende indikatorer for en regulerende effekt av E2F4 på LTBP4S uttrykk, med hensyn til lunge utvikling. Dette interessant nytt aspekt trenger nærmere undersøkelser.
Vi viser nå at LTBP4 er nedregulert i EAC og ESCC via promoter metylering, som foreslår LTBP4 som en potensiell prognostisk biomarkør som kan berike behandlingsalternativer. I tillegg identifiserte vi transkripsjonsfaktor E2F4 som ny kraftig regulator for LTBP4S uttrykk.
Materialer og metoder
microarray, immunhistokjemisk farging og scoring
microarray (TMA) for spiserørskreft progresjon, multippel magekreft, kreft i bukspyttkjertel, tynntarm kreft og colon carcinoma hvert enkelt rom med flere vevsprøver av normal skvamøs slimhinnen og submucosa av esopagus, normal gastrisk cardia, normale bukspyttkjertel, normal tynntarm epitelceller og slimhinne og normal colon var kjøpt fra USA Biomaks (USA). Den TMA seksjonene ble farget med et primært antistoff dannet mot et N-terminalt fragment av LTBP4 (Hjelpemiddel Informasjon S1). Antigen gjenfinning ble gjort av mikrobølger i citrat-buffer (pH 6,0) i 10 minutter. Primært antistoff ble fortynnet ved 1:100 og inkubert ved romtemperatur i 1 time. Antistoffet ble påvist ved hjelp av tilsyn RED 2 AP-polymer kit i henhold til produsentens protokoll (DCS Innovative Diagnostik-Systeme, Tyskland). De TMA seksjonene ble kontra hjelp hematoxylin, dehydrert, og coverslipped. For positiv immunreaktivitet, ble gradering utført semikvantitativt på en fem-lags skala hvor 0 = mindre enn 10%, 1 = 10-25%, 2 = 25-50%, 3 = 50-75% 4 = mer enn 75% positive for LTBP4 farging. Ingen forsøk ble gjort for å gradere resultater basert på farging fargeintensitet, på grunn av den iboende subjektivitet av en slik måling, og dens følsomhet for variasjoner mellom undersøkere. Evalueringen ble utført uavhengig av to erfarne etterforskere som ikke var klar over den tilhørende klinisk informasjon og motstridende score ble løst på en diskusjon mikroskop.
Cellelinjer
OE33, en cellelinje avledet fra adenokarsinom i spiserøret, ble kjøpt fra det europeiske Innsamling av cellekulturer (ECACC, UK). KYSE180, en cellelinje avledet fra esophageal plateepitelkarsinom, ble kjøpt fra den tyske samlingen mikroorganisme og cellekulturer (DSMZ, Tyskland). Alle esophageal cellelinjer ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% føtalt kalveserum og 1% 10,0000 U /ml penicillin /10.000 mikrogram /ml streptomycin ved 37 ° C og 5% CO
2.
Transfeksjon og migrasjon analysen
Menneskelig cDNA av LTBP4L (NM_001042544) og LTBP4S (NM_001042545) ble kjøpt fra OriGene (USA) og klonet (primere i saksdokumenter S1) i en pcDNA6 /
myc-
Hans vektor (Life Technologies, Tyskland). OE33 og KYSE180 celler ble sådd på 1,5 × 10
4 /brønn og 2 × 10
4 /brønn, henholdsvis i Kultur-Innsetting for migrasjonsanalyser (ibidi, Tyskland) og ble transient transfektert med 1: en blanding av pcDNA6 /
myc
-Hans ekspresjonsvektorer for LTBP4L og LTBP4S 24 timer senere. Kultur-Setter ble fjernet 18 timer etter transfeksjon. Den migrerte avstand av cellene ble målt ved 0 timer, 3 timer, 6 timer, 12 timer og 24 timer etter fjerning av kultur-innlegg. Transfeksjonseffektiviteten ble bestemt ved immunfluorescens og protein uttrykk ved SDS-PAGE og immunoblotting.
immunfluorescens
Celler ble fiksert 24 timer etter fjerning av kultur Setter i 15 minutter i 4% paraformaldehyde og blokkert i 60 minutter i 5% bovint serumalbumin /0,3% Triton X-100 i PBS. Cellene ble inkubert med primære antistoffer (saksdokumenter S1) over natten ved 4 ° C. Sekundære antistoffer ble koblet til Alexa Fluor 488 eller Cy3 (Life Technologies, Tyskland). Kjerner ble motfarget med DAPI (Life Technologies, Tyskland).
RNA ekspresjon Analyse
Sammenflytende kulturer av esophageal celler ble anvendt for ekstraksjon av RNA med TRIzol reagens (PEQLAB Biotechnologie, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA-konsentrasjoner og renhet ble bestemt spektrofotometrisk. Revers transkripsjon ble utført med oligo dT primere og Super III revers transkriptase (Life Technologies, Tyskland) ved hjelp av en mikrogram total RNA i henhold til produsentens instruksjoner. De oppnådde cDNA-prøvene ble benyttet for kvantitativ real-time PCR (qPCR) analyse. qPCR ble gjort ved hjelp av Platinum® Kvantitativ PCR SuperMix-UDG m /ROX (Life Technologies, Tyskland). Triplikate reaksjoner ble satt opp og qPCR produkter ble bekreftet ved agarosegelelektroforese. LTBP4 og TGF-β1 kvantifisering av mRNA-nivåer ble beregnet ved bruk av standardkurven metoden. Standardkurver ble opprettet ved hjelp av ti-fold fortynninger av en ekstern kontroll. Brukte primere og prober (Eurofins MWG operon, Tyskland) er oppført i saksdokumenter S1.
SDS-PAGE og Immunoblotting
løpende kulturer av esophageal cellene ble høstet i RIPA buffer (50 mM Tris -HCI, pH 7,5; 150 mM NaCl; 1% NP-40, 0,5% Na-deoksycholat, 0,1% SDS), supplert med protease inhibitor cocktail (Roche, Sveits). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt kolorimetrisk ved Bradford-analysen ved bruk av Protein Assay Kit (Biorad, USA). 100 ug av total celle-proteiner ble separert ved SDS-PAGE (7,5% polyakrylamidgeler) og overført på nitrocellulosemembraner (Macherey-Nagel, Tyskland). Etter blokkering med 5% melkepulver eller 5% BSA i TBST, ble primære antistoffer (saksdokumenter S1) brukes for overnatting inkubasjon av nitrocellulosemembraner. Glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) tjente som lasting kontroll. Antigenene ble påvist ved anvendelse av peroksidase-konjugert anti-hare eller anti-mus-antistoff (Jackson Immunoresearch, USA). Chemiluminescence signal ble målt ved hjelp av ImageLab måling programvare (Biorad, USA).
Metylering analyse
Genomisk DNA fra esophageal kreft cellelinjer ble hentet av standard prosedyrer og modifisert ved bruk av EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll. To promoter-regioner av LTBP4 ble identifisert tidligere [12]. Bruke UCSC Genome Browser [41] åtte CpG øyer (CG innhold 50%) ble identifisert innen promotorområdene. Metylering spesifikke primere ble utformet med MethPrimer [42]. Brukte primere er oppført i saksdokumenter S1. De amplifiserte bisulfitt-behandlede CpG øyene ble deretter subklonet inn i den PGM-T Easy vektor (Promega, USA).
