Abstract
FBXW7
fungerer som en tumor suppressor gjennom ubiquitinering og nedbrytning av flere teinene. Tap av FBXW7 uttrykk, som kan være delvis tilskrevet av genomisk delesjon eller mutasjon av FBXW7 locus, blir ofte observert i forskjellige humane kreftformer. Men de mekanismene som regulerer FBXW7 uttrykk fortsatt dårlig forstått. Her undersøkte vi 5 «regionen
FBXW7
genet for å undersøke regulering av FBXW7 uttrykk. Vi har identifisert syv alternativ spleising (AS) 5′-UTR former FBXW7α som er sammensatt av flere nye ikke-kodende eksoner. Det ble observert en signifikant forskjell i translasjonell effektivitet blant disse 5′-UTR-varianter ved in vivo-luciferase reporter-analysen og Western blot. Videre har vi funnet at mRNA nivået av AS formen med høy virkningsgrad translasjonelle ble spesielt redusert i mer enn 80% av brystkreftcellelinjer og i mer enn 50% av humane primære kreftformer fra ulike vev. I tillegg har vi også identifisert mutasjoner av FBXW7 i prostatakreft (5,6%), nyrekreft (16,7%) og blære kreft (18,8%). Våre resultater tyder på at i tillegg til mutasjon, differensial uttrykk for FBXW7α AS skjemaer med ulike translasjonsforskning egenskaper kan tjene som en ny mekanisme for inaktivering av FBXW7 i human kreft
Citation. Liu Y, Ren S, Castellanos-Martin A, Perez-Losada J, Kwon YW, Huang Y, et al. (2012) Flere Novel alternativ spleising Former FBXW7α Ha en translasjonell modulerende funksjon og Vis spesifikke endringen i Human Cancer. PLoS ONE 7 (11): e49453. doi: 10,1371 /journal.pone.0049453
Redaktør: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, USA
mottatt: 19 august 2012; Akseptert: 9. oktober 2012; Publisert: 14.11.2012
Copyright: © 2012 Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. JPL er støttes delvis av FEDER og MICINN (PLE2009-119), FIS (PI10 /00328) «Fundación Eugenio Rodríguez Pascual», og Fundación Inbiomed (Instituto Oncológico Obra Social de la Caja Guipozcoa-San Sebastian, Kutxa). YS er støttet av National Basic Research Program of China (2012CB518300) og departementet for vitenskap Teknologi fra Shanghai (08410701500). JHM er støttet av National Institutes of Health, National Cancer Institute stipend R01 CA116481, Low Dose Scientific Focus Area, Office of Biological Environmental Research, US Department of Energy (DE-AC02-05CH11231), Laboratory Regi Research Development Program (LDRD), og NASA Specialized forskningssenter for stråling helsevirkninger (NNX09AM52G). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
FBXW7
genet er en transkripsjons mål av p53, hvis uttrykket er oppregulert i en p53-avhengig-måte etter strålebehandling [1].
FBXW7
-genet koder for en F-boks-protein, noe som er viktig for den ubiquitinering av forskjellige oncoproteiner, herunder c-Myc [2], [3], c-Jun [4], cyklin E [5] , [6], forskjellige medlemmer av familien Notch [7], [8], Aurora-A [1], [9], mTOR [10], [11], og KLF5 [12], [13]. Overekspresjon av flere av disse målene, som for eksempel cyclin E [14], c-Myc [15] og Aurora-A [16] har blitt implisert å indusere genomiske ustabilitet. Disse observasjonene viste at
FBXW7
er et menneske tumor suppressor gen, en konklusjon som også støttes av oppdagelsen av
FBXW7
genmutasjoner i kreftformer fra et bredt spekter av menneskelig vev, for eksempel galle duct, blod, bein, hjerne, bryst, tykktarm, endometrium, mage, lunge, eggstokk, bukspyttkjertel og prostata, med samlet 6% punktmutasjon frekvens [17].
Sletting av
Fbxw7
-genet i mus fører til embryonisk dødelighet, men heterozygote mus utvikler seg normalt [18], [19]. Selv om de ikke utvikler spontane tumorer, gir stråling opphav til forskjellige typer av tumorer, omfattende en rekke epiteliale cancere [1]. Mus som bærer inaktiv alleler av både
Fbxw7 Hotell og
p53
viser akselerasjon av tumorutvikling. Haploinsufficient tap av
Fbxw7
er observert i de fleste lymfomer i denne musen modellen, selv de som oppstår fra
Fbxw7 /p53
doble heterozygote mus, dvs. tap av bare én kopi av genet kan generere en betydelig biologisk effekt [1]. Lignende observasjoner av heterozygote mutasjoner ble senere funnet i humane svulster [20]. Det er derfor sannsynlig at den totale virkningen av denne tumor suppressor genet i human cancer er større enn 6% punktmutasjonen frekvens som er nevnt ovenfor, fordi tap av bare ett gen kopi kan ha en betydelig effekt på tumorutvikling. Sletting av kromosom 4q31, der
FBXW7
ligger, er vanlig i mange typer kreft hos mennesker [21] – [25], noe som tyder på at avbrudd av denne veien kan være en viktig funksjon i mange, eller til og med en flertall, av humane kreftformer.
5 «utranslatert region (5′-UTR) spiller en viktig rolle i kontrollen av eukaryot genekspresjon [26]. Nyere studier på pattedyr transkriptomet tyder på at mesteparten av genene uttrykker multippel alternativ spleising (AS) 5′-UTR, og UTR heterogenitet for et bestemt gen sannsynlig har en differensial virkning på protein uttrykk [27], [28]. Spesielt mange onkogener og svulster suppressor gener er også tilbøyelig til å uttrykke seg unormalt komplekse 5′-UTR [29], [30]. I tillegg er det blitt klart at upassende ekspresjon av 5»-UTR AS har vist seg å bidra til utvikling av kreft [31], [32].
I den foreliggende studien undersøkte vi 5 «region av
FBXW7
å forstå dens reguleringsmekanismer, og identifisert flere nye ikke-koding eksoner i FBXW7α isoform, som produserte flere 5′-UTR AS former. Den funksjonelle virkningen av disse 5′-UTR på effektiviteten av translasjon ble vist til senere å regulere FBXW7α uttrykk. FBXW7α 5′-UTR er uttrykt forskjellig mellom ulike normale og tumor vev, som sannsynligvis fører til endring i nivåene av FBXW7α uttrykk under kreftutvikling. Våre funn i denne studien tyder på at differensial uttrykk for FBXW7α AS former serverer en ny mekanisme inaktivere
FBXW7
i menneskelig kreft.
Resultater
Flere nye alternative spleiseformer identifisert i
FBXW7
genet
Tre FBXW7 isoformer (α, beta- og gamma) er rapportert så langt. De skiller seg i første ekson og dele følgende 2-11 eksoner. For å undersøke reguleringen av
FBXW7
uttrykk, karakterisert vi 5′-regionen av FBXW7α, β og γ isoform ved hjelp av 5′-RACE-teknikken med cDNA fra human bryst epitelcelle (HMEC) 184A1. Sekvense analyse av 115 RACE kloner avdekket fem nye ikke-kodende eksoner innenfor
FBXW7α
5′-UTR når linje med humant genomisk sekvens, mens ingen ekstra eksoner ble oppdaget fra
FBXW7β Hotell og
FBXW7γ
ved sekvense 27 og 31 RACE kloner henholdsvis (figur 1).
FBXW7α
5′-UTR gjennomgår alternativ spleising (AS) til å produsere syv mRNA transkripter med samme primær oversettelse initiering området (Figur 1, Tabell S2). Disse resultatene ble ytterligere bekreftet ved sprengning sekvensene mot databasen for Uttrykt Sequence Tags (dbEST). Sekvensene av sju alternative spleiseformer ble avsatt i Genebank med tilgangsnummer HQ873864-HQ873870.
Structural illustrasjon av flere skjøteformer FBXW7α. Syv ulike spleise former for FBXW7α ble identifisert ved 5′-RACE bruker genet spesifikk primer (GSP) og hekker primer (rs1). Antallet kolonier for hver skjøting skjema funnet under screening ble vist. Den N-terminale sekvens av isoform β og γ ble også undersøkt ved hjelp av 5′-RACE ved å bruke de tilsvarende primere GSPβ, GSPγ, Nestβ og Nestγ. Pilene representerer primere brukt i denne studien og deres posisjon i tilsvarende sekvens.
Blant disse eksoner, 1αa og 1αc vises i de fleste av AS former, mens 1αd er bare i ett av sju spleising former (figur 1). Interessant, 1αb og 1αd synes i motsetning til å eksistere i samme AS form. For å bekrefte dette, har vi utviklet spesifikke PCR-primere som tilsvarer de sekvenser i 1αb og 1αd, henholdsvis (fig S1), og var ikke i stand til å detektere en hvilken som helst band fra vev mRNA brukt i denne studien ved RT-PCR (data ikke vist). I tillegg er det ingen nye ORF funnet i alt syv AS former FBXW7α, noe som indikerer at disse nye eksoner bare danne forskjellige 5′-UTR regioner av forskjellig AS former.
Forskjeller i oversettelsen effektiviteten av forskjellig
FBXW7α
AS former
for å undersøke den funksjonelle effekten av disse 5′-UTR på translasjonell effektiviteten av påfølgende FBXW7α ORF, vi først brukte en luciferase reporter analyse for å sammenligne syv 5′-UTR sekvenser. For å oppnå dette, klonet vi hver 5′-UTR oppstrøms for ildflue luciferase (LUC) -genet i den pGL3-promoter reporter-vektor (Promega), og transfektert inn i HeLa-celler dem. Tomme pGL3-promoter ble anvendt som en kontroll (LUC-ctrl). Renilla-luciferase normalisert aktivitet for hver konstruksjon ble sammenlignet med LUC-ctrl. Resultatene av disse analyser viste gjennomgående de betydelige forskjellene i LUC aktiviteter blant disse syv 5′-UTR-varianter (figur 2A). Spli2-UTR utstilt alltid den høyeste LUC aktivitet mens nivået LUC aktivitet i Spli1-UTR, Spli4-UTR, og Spli5-UTR var middels, men betydelig høyere enn LUC-ctrl; den LUC aktiviteten Spli3-UTR, Spli6-UTR, og Spli7-UTR var ikke statistisk signifikant sammenlignet med LUC-ctrl (figur 2A). For å bekrefte at disse forskjellene i LUC aktivitet var ikke på grunn av variasjoner i LUC transkripsjon, utførte vi kvantitativ real time RT-PCR (QRT-PCR). Som vist i figur 2B, var det ingen signifikante forskjeller i nivåene av LUC transkripsjon blant annet 5′-UTR varianter i forhold til LUC-ctrl. Dette resultatet indikerer tydelig at de 5′-UTR av FBXW7α regulerer translasjonsforskning effektiviteten av nedstrøms ORF.
(A) Effekt av
FBXW7α
5′-UTR varianter på HiL aktivitet. LUC reporter konstruksjoner, som inneholdt hver
FBXW7α
5′-UTR oppstrøms av LUC reporter genet i pGL3 vektor, ble transfektert inn Hela celler. Den LUC aktivitet ble målt som Firefly /Renilla forholdet. Resultatene representerer data fra tre uavhengige forsøk. Hvert forsøk ble utført in triplo. Midlere data og standardavvik er vist. * P 0,05 i forhold til Luc-ctr. (B) LUC transkripsjonsnivåer ble undersøkt ved QRT-PCR. De LUC mRNA-innholdet ble normalisert til de Renilla mRNA-innhold for alle prøver, og den relative LUC mRNA for pGL3p (tom vektor, Promega) ble vilkårlig vurdert å være 1 (kontroll). (C) Virkning av 5′-UTR på FBXW7α proteinnivåer. Immunoblot ble utviklet med anti-HA antistoff fra ekstrakter med angitt konstruere. Intensiteten av pcDNA3.1 (+) inneholdende FBXW7α genet (kontroll) ble betraktet som 1. GFP-konstruksjonen ble anvendt som transfeksjonseffektivitet kontroll, og β-aktin som lasting kontroll. Alle transfections ble utført i tre eksemplarer, og viser linjene standardavvik. * P 0,05 i forhold til kontroll. (D) cDNA frangments for FBXW7 (øvre panel), GFP (i midten panel) og GAPDH (nedre panel) var spesielt forsterket ved RT-PCR fra Hela celler transfektert med angitte konstruksjoner.
For ytterligere å verifisere virkningen av 5′-UTR på regulering av translasjon, vi klonet syv 5′-UTR inn oppstrøms for FBXW7α ORF i pcDNA3.1 merket med HA-epitop og deretter transfektert inn i HeLa-celler dem. Western blot-analyse viste ekspresjonsnivået fra Spli2 konstruksjonen var konsekvent høyere enn det som ble observert med de andre UTR og kontroll konstruksjoner når normalisert til nivået av transfeksjonseffektiviteten kontroll GFP-protein (figur 2C), som er i overensstemmelse med resultatene fra den luciferase reporter analysen . Vi har bekreftet at uttrykket forskjellen er ikke på grunn av transkripsjonelle virkninger fordi mRNA-nivåer er ikke signifikant forskjellige (figur 2D). Til sammen har vi konkludert med at de 5′-UTR varianter av FBXW7α har translasjonsforskning modulerende funksjon.
Expression profiler av
FBXW7α
AS former i humane normale vev
Gitt at 5 «-UTR kan regulere oversettelse av nedstrøms ORF, ved siden søkte vi å undersøke uttrykk mønster av
FBXW7α
AS former i menneskelig vev. For dette formål ble semi-mengde RT-PCR utført på 21 humane normale vev med ulike sett av primere som tilsvarer nylig identifiserte eksoner (figur 1, tabell S1). RT-PCR ble opprinnelig utført med et par av primere (F2 /rs1) som kan oppdage alle AS former. Som forventet, multippel AS skjemaene ble uttrykt i alle menneskelige vev (figur 3A, øvre panel). De som form Spli5, Spli4 og Spli2, tilsvarende bandet størrelser 386 bp, 435 bp, henholdsvis 478 bp, viste høyt nivå av mRNA uttrykk (figur 3A, øvre panel), i samsvar med våre funn i 5 «RACE studier, der antallet av kloner som tilsvarer disse AS skjemaene ble funnet mye høyere frekvens (figur 1). Expression nivå av forskjellig FBXW7α AS former varierte mellom vev. For eksempel, er det Spli4 den dominerende form i testiklene (kolonne 12 i figur 3A, øvre panel), mens Spli2 er den mest uttrykt man i andre vev (figur 3A, øvre panel), noe som antyder et vev-tilknyttet fordelingsmønster.
(A)
FBXW7α
AS danner uttrykk nivåer ble oppdaget av semi-kvantitativ RT-PCR ved hjelp av ulike par av primere. (B) Nivåene av Spli1 og 2, og Spli3-5 ekspresjon ble kvantifisert fra eksperimentet vist i (A) nedre panel. Normale vev inkluderer: 1-spiserør, 2-adipose, 3-hjerte, 4-blære, 5-nyre, 6-hjerne, 7-lever, lunge-8, 9-cervix, 10-colon, 11-milt, 12- testikler, thymus-13, 14-thyraoid, 15-trachea, 16-tynntarm, 17-skjelettmuskel, 18-prostata, 19-placenta, 20-eggstokk, 21-bryst. «M» representerer DNA ladder Marker.
Som de syv AS skjemaer inneholder crossover av flere eksoner i 5′-UTR, er det vanskelig å skille disse variantene. Dermed har vi designet prim F2 /R2 ligger i ekson 1αa og 1αc å sammenligne uttrykket nivået av Spli1 2 (en sum av Spli1 og Spli2 uttrykk) med skjemaene Spli3-5 (en sum av Spli3, Spli4 og Spli5 uttrykk) . Vi fant at Spli1 og 2, hovedsakelig uttrykkes i de fleste vev (figur 3A, nedre panel, og figur 3B). Men noen vev, slik som milt, thymus og tynntarm oppviste likeverdige ekspresjonsnivåer av Spli1 og 2, og Spli3-5 (kolonnene 11, 13 og 16 i figur 3A, nedre panel, og figur 3B), mens Spli3-5 er høy uttrykt i testiklene (kolonne 12 i figur 3A, lavere panel, og figur 3B).
Varierende uttrykk for
FBXW7α
spesifikk AS former i kreft hos mennesker
Siden dette uttrykket av 5′-UTR AS former har vært knyttet til tumorprogresjon, vi undersøkt ekspresjonsprofilen av de identifiserte FBXW7α AS former i human kreft ved semi-kvantitativ RT-PCR ved å bruke samme sett av primere som er beskrevet ovenfor. Resultatet i et panel på 20 brystkreftcellelinjer viste at de fleste brystkreftcellelinjer har redusert uttrykk nivåer av FBXW7α spesifikk AS former sammenlignet med normale menneskelige mammary epitelceller (HMEC) (184A1 og 184B5) (Figur 4A). Nesten alle brystkreftcellelinjer viste bemerkelsesverdig reduksjon i uttrykket av Spli1 2, mens det ikke er noen endringer i uttrykket av Spli3-5 sammenlignet med nivåene i HMECs (figur 4A, nedre panel, 4B). Disse observasjonene ble ytterligere bekreftet i et sett av 92 humane primær brystkreft. I forhold til de samlede normale brystvev, Spli1 og 2, ekspresjonsnivåer viste en signifikant reduksjon på mer enn 50% av tumorer. Overraskende, fant vi at Spli3-5 uttrykk nivåer viste signifikant økning i mer enn 30% av tumorer (figur 4C og D).
(A) mRNA uttrykk profil FBXW7α AS former i menneskelig brystkreft og HMEC cellelinjer ble bestemt ved semi-kvantitativ RT-PCR ved anvendelse av forskjellige sett av primere. «B1 til B20» representerer 20 forskjellige brystkreft cellelinjer, «A1» står for 184A1, «B5» for 184B5. (B) Nivåene av Spli1 og 2, og Spli3-5 ekspresjon ble kvantifisert fra eksperimentet vist i (A) nedre panel. (C) Den representative mRNA-ekspresjon profilen til FBXW7α AS former fra 92 humane primær brystkreft hos semi-kvantitativ RT-PCR ved å bruke forskjellige sett av primere. (D) Kvantifisering av Spli1 2 og Spli3-5 uttrykk nivåer i 92 humane primære brystkreft. (E) mRNA-ekspresjon profil FBXW7α AS former i 24 humane primære nyrekreft hos semi-kvantitativ RT-PCR ved å bruke forskjellige sett av primere. (F) Kvantifisering av Spli1 2 og Spli3-5 uttrykk nivåer i 24 humane primære nyrekreft. «N» for sammenslåtte RNA fra normalt vev, «M» for DNA ladder Marker.
Neste vi avgjort om differensial uttrykk for
FBXW7α
spesifikk AS skjedde også i andre typer menneskelig kreft. Faktisk er
FBXW7α
uttrykk byttet fra Spli1 2 til Spli3-5 i menneskelig nyre, prostata og blære kreft (Figur 4E og F, figur S2A og S2B). Denne differensial uttrykk mønster av FBXW7α AS former i ulike kreft hos mennesker støtter vesentlig vår hypotese om at FBXW7α AS former involvere i reguleringen av FBXW7α under tumorigenesis. Sammen våre resultater tyder på at total FBXW7 protein nivåer kan bli redusert i tumorceller gjennom differensial uttrykk for FBXW7α AS former, og nedgangen i FBXW7 overflod vesentlig påvirker dens funksjon på ubiquitinering og nedbrytning av sine mål (teinene), blir derfor for tumorutvikling og progresjon.
mutasjonsanalyse av
FBXW7
i humane urologiske kreft
Selv om mutasjoner er sjelden påvises i bryst kreft, genetiske endringer er fortsatt funnet i prostatakreft [35], og det er ingen rapport om genetiske endringer i blære og nyre svulster. I tillegg har kreft forskjeller ble funnet mellom ulike etniske grupper. Det er heller ingen rapport om
FBXW7
mutasjon spektrum i kreft blant kinesiske pasienter. Dette intrigues oss for å undersøke hvorvidt det er mutasjoner, og det som er frekvensen av mutasjonene i kinesiske kreftpasienter. Derfor vi utførte mutasjon analyse av
FBXW7
genet i 18 prostata, 24 nyre, og 16 blære tumorvev fra kinesiske pasienter. Både mutasjoner og delesjoner ble funnet i disse tumorene som er vist enten ved gelelektroforese eller sekvensering kartet i figur 5. Sekvensering av kortere RT-PCR-fragmentene bekreftet to blæreprøver og en nyre prøven har delesjoner. Av de blæretumorstrykninger, har en tumor en delesjon av en del av ekson 8 pluss hele exon 9, mens i den annen blære tumor hele ekson 2 og 3 sekvenser mangler. Den nyrekreft har en delesjon av en del av eksonene 8 og 10 sammen med hele ekson 9 (figur 5B-D, tabell 1). Den samlede mutasjonshastighet på FBXW7 i prostata cancer er 5,6%, 16,7% i nyrekreft, og 18,8% i blærekreft fra kinesiske pasienter som oppsummert i tabell 1.
(A) RT-PCR-analyse av
FBXW7
, RT-PCR-produkter som inneholder delesjoner er angitt med asterisk. (B-D) sekvensering bekreftet at slettingen i to blærekreft (B og C), og et nyrekreft (D). (E) Representant sekvens spor som viser mutasjoner av
FBXW7
.
Diskusjoner
Denne studien gir ny innsikt i mekanismene som regulerer FBXW7α uttrykk gjennom en roman spleising mønster. Vi har identifisert syv roman AS former for
FBXW7α
av 5 «RACE teknikk. Selv om de produserer i det vesentlige det samme protein,
FBXW7α
AS former synes å styre proteinekspresjon til ved reguleringen av translasjonell effektivitet av disse AS former, siden vi har demonstrert at FBXW7α 5′-UTR variantene har en translatorisk modulerende funksjon. Multiple AS skjemaer ble bare funnet i
FBXW7α
, ikke i
FBXW7β
eller
FBXW7γ
. Likevel fant vi at
FBXW7
α dominant uttrykt i nesten alle av menneskelig vev undersøkte mens
FBXW7
β mRNA er beriket i hjernen og thymus og er fraværende eller i spormengder i andre vev, og
FBXW7
γ mRNA er funnet å være begrenset i hjerte- og skjelettmuskel (figur S3), som fremhever hvor viktig
FBXW7
α til funksjonen av FBXW7. Således kan multiple AS former presentert i FBXW7α kan muliggjøre nøyaktig regulering av dets ekspresjon i løpet av biologiske prosesser.
vi for første gang oppdaget at proteinnivåer FBXW7α reguleres gjennom translasjonskontroll ved å demonstrere den differensielle translasjonelle effektiviteten ulike FBXW7α AS former.
in vivo
eksperimenter med Luc reporter analyser viste konsekvent at Spli2 form har den høyeste translasjonsforskning effektivitet i forhold til andre. Flere faktorer er kjent for å bestemme effektiviteten translasjonell [33]. Forskjellene i translatorisk effektivitet blant FBXW7α 5′-UTR-varianter er usannsynlig på grunn av sin lengde, sekvensen rundt oversettelsesstartsetet, og igangsettings kodoner innenfor dem som det samme antall startkodonene og den samme sekvens rundt translasjonsstartsetet ble funnet i alle FBXW7α 5′-UTR varianter. Lengden av Spli2-UTR er klart lengre enn den Spli6-UTR og Spli7-UTR, kortere enn Spli3-UTR, men Spli2 viste høyere oversettelse effektivitet. I tillegg undersøkte vi forskjeller i sekundære strukturer og fri energi for hver
FBXW7α
5′-UTR varianter bruk den elektroniske RNA-folding programvare (https://rna.tbi.univie.ac.at/cgi- bin /RNAfold.cgi.). Det er ingen signifikante forskjeller i den frie energiverdi etter normalisering til lengden blant disse 5′-UTR (data ikke vist). Fremtidige studier vil bli gitt for å undersøke mulige mekanismer som 5′-UTR regulerer translasjonell effektivitet.
FBXW7
har dukket opp som et stort menneske tumor suppressor genet. Flere mekanismer har blitt rapportert for inaktivering av FBXW7 i human kreft inkludert mutasjon, sletting og hypermethylation [17], [21] – [25], [34]. Mange forsøk har fokusert på det funn av FBXW7 mutasjon i ulike typer av kreft hos mennesker og har vist at det totale punktmutasjon frekvens er bare 6% i humane cancere [17], men det var betydelig variasjon på tvers av tumortyper. Omtrent 30% mutasjonsfrekvens ble funnet i kolangiokarsinom og T-celle akutt lymfoblastisk leukamias mens mutasjon frekvenser i prostata, livmorkreft, så vel som gastrointestinal kreft ordne fra 4% til 15% [35]. Består med disse funnene, vi rapporterte her for første gang på hvilke mutasjoner FBXW7 oppdaget i menneskelige nyre og blære svulster med frekvensen 16,7% (4/24) og 18,8% (3/16) (tabell 1), henholdsvis. Frekvensen i prostata svulst fra kinesiske befolkningen er 5,6%, tilsvarende en tidligere studie utført i kaukasiere [36].
De fleste viktig funn i denne studien er at
FBXW7
genet er deregulert gjennom differensial uttrykk for AS former i kreft hos mennesker. Forbindelsen mellom tumorutvikling og deregulering av AS har blitt en ny og viktig del av kreft biologi. Våre resultater viser at transkripsjonen mønster av
FBXW7
AS former i kreft hos mennesker er forskjellig fra normalt vev rommet. Som vist i figur 4,
FBXW7α
uttrykk mønstre i de fleste av kreft hos mennesker er byttet fra Spli1 2 til Spli3-5 i forhold til sin normale vev. Konsekvensen av denne bryter bevirker reduksjon av
FBXW7
proteinnivå, og i sin tur fører til delvis tap av dens funksjon. Dette resultatet tyder på at deregulert AS av
FBXW7α
genet kan være en ekstra mekanisme for å inaktivere
FBXW7
i kreft hos mennesker. Siden differensial uttrykk for
FBXW7α
AS former har blitt funnet i mer enn 50% av kreft, foreslo vi at denne nye mekanismen spiller en stor rolle i menneskelig utvikling kreft.
I konklusjonen, ved å analysere
FBXW7
5 «ende regionen, vi identifisert romanen
FBXW7α
5′-UTR varianter som regulerer
FBXW7α
genuttrykk gjennom mekanismen involverer translasjonell effektivitet. Disse AS former er uttrykt i en vev-assosiert måte med varierte nivåer mellom ulike vev. Vår studie gir en ny innsikt i endring av
FBXW7α
uttrykk under menneskelig utvikling kreft.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Den menneskelige primære bryst svulster ble samlet ved kirurgisk reseksjon ved Hospital Universitario av Salamanca, Salamanca, Spania. Innsamling og bruk av pasientprøver ble godkjent av institusjonelle etikk gjennomgang styret i Sykehus Universitario av Salamanca. De humane primære prostata, blære og nyre tumorer ble oppsamlet på tidspunktet for kirurgisk reseksjon ved Changhai Hospital, Kina. Samlingen og bruk av pasientprøver ble godkjent i henhold til institusjonelle etikk Review Board of Changhai Hospital, Second Military Medical University. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter for forskning ved hjelp av disse tumorprøver.
Pasientprøver
I begge sykehusene, ble de friske svulst vevsprøver oppnås ved kirurgisk fjerning av pasient svulster. Prøvene ble umiddelbart hurtigfrosset ned i flytende nitrogen og deretter lagring ved -80 ° C fryser før bruk. H E (hematoxylin og eosin farget) lysbilder av frosne humane tumor vev ble undersøkt av patologene i denne studien for å sikre at svulstvevet utvalgte hadde kreft foci med høy tetthet. ( 80%)
Cell linjer
brystcancercellelinjer ble dyrket i DMEM eller i RMPI1640 supplert med 10% bovint fosterserum og 100 mM streptomycin og penicillin; detaljer ble beskrevet i vår tidligere studie [37]. Hela-celler ble dyrket i MEM med 10% bovint fosterserum og 100 mM streptomycin og penicillin. Celler ble inkubert ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO
2.
Total RNA ekstraksjon fra celler og vev
Total RNA ble fremstilt fra 80% konfluent kultur av bryst kreftcellelinjer, HeLa-celler 36 timer etter transfeksjon og frosset menneskelige brystkreft, nyre, prostata og blære tumor vev ved hjelp Trizol (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Ekstrahert RNA prøver ble behandlet med DNA-settet (Ambion) før ytterligere analyse, for å fjerne eventuelle gjenværende mengde av genomisk DNA. RNA konsentrasjon og kvalitet ble bestemt med en Nanovue spektrofotometer (GE Healthcare). Menneskelig total RNA fra forskjellige normale vev ble kjøpt fra Ambion.
5 «rask forsterkning av cDNA ender (RACE)
karakterisering av
FBXW7
genet N endestasjonen ble utført ved anvendelse av 5 «RACE sett (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner. I korthet, ble totalt RNA isolert fra human bryst epitelcelle (HMEC) 184A1 celler med Trizol (Invitrogen), og cDNA ble dannet ved anvendelse av spesifikk primer (GSP) angitt i tabell S1. CDNA ble tailed med dCTP ved bruk av terminal deoksy-transferase, og et poly-G-primer (Invitrogen) ble kombinert med hverandre
FBXW7
cDNA for PCR. En andre PCR ble utført med en utvanning av den første PCR, ved hjelp av hvert reir primer Nestα (rs1), Nestβ eller Nestγ (tabell S1), og en adaptamer primer levert av Invitrogen. PCR-produktene ble analysert ved gel-elektroforese og ble klonet inn i vektoren pCR4. Hvert klone ble sekvensert.
revers transkripsjon og PCR amplifikasjon av cDNA
Først tråd cDNA ble syntetisert ved hjelp av Super III cDNA syntese sett (Invitrogen). 1 pg RNA ble underkastet revers transkripsjon følge de reaksjonsbetingelser som er angitt av produsenten. Reaksjonene ble primet med 50 ng av tilfeldige heksamerer. CDNA fra brystkreft cellelinjer, menneskelig normalt vev panel, og primær bryst, nyre, prostata og blære svulster ble analysert for AS transkripsjoner av
FBXW7
α ved hjelp av PCR med primerpar F2 /RS1, F2 /R2 og F1 /rs1 (tabell S1). Husholdersken genet GAPDH ble forsterket som kontroll av primerpar GapF /GapR (tabell S1). Protokollen for PCR-reaksjonen var 26-35 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 30 sekunder, annealing ved 56 ° C i 30 s, og forlengelse ved 72 ° C i 30 sek.
å detektere mutasjoner FBXW7 i primær prostata, blære, nyre og tumor, ble den kodende sekvensen til
FBXW7
amplifisert ved RT-PCR ved anvendelse av tre primerpar P1F /R, P2F /R og P3F /R (tabell S1), og den forsterkede produkter ble sekvensert og sammenlignet i Genebank database. For forskjellige størrelser PCR-produkter, band ble gel skåret ut og renset, og deretter bekreftet ved DNA-sekvensering.
Plasmid konstruerer
Seven annerledes FBXW7α 5′-UTR (Spli1 til 7) ble forsterket fra de positiv pCR4 kloner i RACE med følgende primerpar GL3F /GL3R (tabell S1). PCR-produktene ble gelrenset, spaltet og deretter ligert inn i pGL3-promoter vektor (Promega) via Hindlll /Ncol-restriksjonsseter i umiddelbar nærhet av den nedstrøms luciferasegenet. De genererte konstruksjonene ble utpekt som Spli1-UTR, Spli2-UTR, Spli3-UTR, Spli4-UTR, Spli5-UTR, Spli6-UTR, og Spli7-UTR. Tilsvarende ble sju 5′-UTR forsterket av primerpar GL3F /GL3R2 introdusert i oppstrøms FBXW7α genet smeltet sammen med HA epitop i pcDNA3.1 (+) vektor (lagret i dette laboratoriet) via HindIII /EcoRI. Alle konstruksjonene ble verifisert ved DNA-sekvensering.
Transient transfeksjon
Forbigående transfections ble utført på ca 70% sammenflytende HeLa-celler ved hjelp av Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen). Tjuefire timer før transfeksjon ble cellene trypsinert og overført til enten 96-brønners plater (for luciferase-assay) eller 60 mm skåler (for RNA isolering). Transfeksjon ble utført med reagensen følgende fremstilling protokoll. I korthet ble 0,2 pg av DNA fra eksperimentell store plasmid preparater ble levert til hver brønn i 96-brønners plater i nærvær av phRL-TK
Renilla
luciferase kontroll plasmid (Promega, 0,01 ug) eller fire ug av eksperimentelle DNA og 0,2 pg av
Renilla
luciferase kontroll-plasmid til cellene utsådd i 60 mm skål, og cellene ble inkubert ved 37 ° C.
