Abstract
RhoE, et nytt medlem av Rho protein familien, er en viktig regulator av cytoskjelettet og cellemigrasjon. Vår gruppe har tidligere vist at RhoE som et direkte mål for HIF-1α og formidler hypoksi-indusert epitelial til mesenchymale overgang i magekreftceller. Derfor antok vi at RhoE kan spille en viktig rolle i magekreft metastaser. I denne studien har vi undersøkt hvilken rolle RhoE uttrykk i magekreft, celle invasjon og metastasering, og påvirkning av RhoE på å regulere den potensielle uttrykk for nedstrømsgener. RhoE ekspresjon ble forhøyet i magekreft vev sammenlignet med normal gastrisk vev. Vi har også funnet en nær korrelasjon mellom histologisk karakter og diagnosen av pasienten. Oppregulering av RhoE betydelig forbedret trekk og invasive evner av magekreftceller både
in vitro Hotell og
in vivo
. Videre nedregulering av RhoE redusert metastatisk potensial av kreftceller. PCR matrise og påfølgende transwell-analysen viste at reguleringen av magekreft metastase av RhoE ble delvis mediert av CXCR4. Denne observasjonen foreslo at CXCR4 kan være en nedstrøms effektor for RhoE. Oppsummert vår studie identifisert RhoE som en roman prognostisk biomarkør og metastatisk fremmende genet av magekreft
Citation. Feng B, Li K, Zhong H, Ren G, Wang H, Shang Y, et al. (2013) RhoE Fremmer Metastase i magekreft gjennom en mekanisme Avhengig Enhanced Expression of CXCR4. PLoS ONE 8 (11): e81709. doi: 10,1371 /journal.pone.0081709
Redaktør: Sharmila Shankar, University of Kansas Medical Center, USA
mottatt: 11 januar 2013; Godkjent: 24 oktober 2013; Publisert: 29.11.2013
Copyright: © 2013 Feng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Basic Research Program of China (No: 2009CB521700), National High Technology Research and Development Program of China (No: 2006AA02A253) og National Science and Technology støtte Program under Eleventh Five-Year Plan Periode (No: 2006BAI02A14). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den nest største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i verden og metastase er den største hindring for vellykket behandling og den viktigste årsaken til pasientens dødelighet [1,2]. I flere tiår har en rekke studier forsøkt å forstå de prosesser og mekanismer for metastasering i magekreft. I de senere årene har det blitt funnet at epitel mesenchymale overgang (EMT) er av avgjørende betydning i denne prosessen, og i stor grad bidrar til kreftcelle invasjon og metastasering. En mulig årsak er at under EMT er cytoskjelettet fundamentalt modulert, som fører til spredning av tumorceller [3].
RhoE tilhører en undergruppe av de Rho proteiner, som spiller nøkkelroller i cytoskjelettet formasjon , celle motilitet, cellesyklus og apoptose [4,5]. I motsetning til de typiske Rho proteiner, som sykle mellom en aktiv GTP-bundet tilstand og en hvile GDP-bundet tilstand, mangler RhoE indre GTPase aktivitet og alltid presenterer som aktiv GTP-bundet form [6]. Denne unike egenskap indikerer at funksjonen av RhoE er i hovedsak regulert gjennom sitt uttrykk i stedet for ved dens aktivitet.
Nylig har flere studier funnet at unormal ekspresjon av RhoE var assosiert med kreftutvikling og som RhoE kan fungere enten som et svulsthemmer-gen eller et onkogen, avhengig av opprinnelsen av kreft [7-9]. På samme måte har RhoE varierende påvirkninger på metastaser på forskjellige kreftformer. I melanom, støtter RhoE migrering og invasivitet av tumorceller ved å regulere aktin cytoskjelettet [10]. Men i leverkreft, representerer RhoE seg som en suppressor protein av metastase [11,12].
Tidligere vår gruppe har funnet ut at RhoE ble forsterket i mage kreftceller ved induksjon av HIF-1α til uttrykk under hypoksiske forhold og fremmet EMT av magekreftceller [13]. Dermed hypotese vi at RhoE kan ha et positivt bidrag i metastasering av magekreft. I denne studien undersøkte vi påvirke av RhoE på metastasering av mage kreftceller og de underliggende mekanismene.
Materialer og metoder
Cell Culture
Den menneskelige adenokarsinom i ventrikkel cellelinjer SGC7901, MKN-45, MKN-28, KATO-III og de vanlige mageslimhinne celle linjer GES ble bevart i vårt institutt [14-16]. I tillegg, magekreft celle- linje SGC7901-M, som har et høyt metastatisk potensiale, og SGC7901-NM, som har en dårlig evne til metastatisk, ble etablert og opprettholdt i vårt institutt [17]. Alle celler ble holdt i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (GIBCO, Carlsbad, CA, USA) og dyrket ved 37 ° C i en fullstendig fuktet atmosfære av 5% CO2.
Tissue Array
For farging programmer, to vev matriser av human magekreft ble kommersielt kjøpt fra overgå Biotech Co Ltd (Shanghai, Kina). En vev rekke inneholdt 90 tumorvev flekker og matchet tilstøtende ikke-svulstvev flekker som ble hentet fra 90 pasienter (med 5.3-6.1 års oppfølging). Produsenten gitt kjønn, alder, og clinicopathological parametere av pasientene. Den andre rekke inneholdt 120 plassene med 40 primære tumor vev flekker, 40 matcher tilstøtende vev flekker ikke-tumor, og 40 matchet lymfeknutemetastaser flekker.
Immunohistochemistry
Immunohistochemistry ble utført ved hjelp Histostain ™ Plus kits (Zhongshan Goldenbridge Biotech, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. Til mus anti-RhoE antistoff (fortynnet 1: 100; Upstate, MA, USA) eller anti-CXCR4 antistoff (fortynnet 1: 200; Sigma-Aldrich, MO, USA) ble anvendt i IHC-assay som første antistoff. Mus IgG ble anvendt i stedet for det første antistoff som negativ kontroll i disse studiene. Det oppnådde resultat ble semikvantitativt bedømt ved å tildele score for intensiteten av immunreaktivitet og for den andel av celler som positivt farget som beskrevet av andre. Intensiteten av immunoreaktivitets ble delt inn i fire kategorier, og scoret som fraværende (-; score: 0), svak (+; score: 1), moderat (++; poengsum: 2), eller sterk (+++; poengsum: 3 ) i henhold til den fargeintensitet som ble observert i de fleste av gastrisk epitelceller. Andelen av positive celler ble klassifiseres i fire grupper: (1), 0-25% av tumorceller som oppviser immunreaktivitet; (2), 25-50% av cellene; (3), 50-75 prosentpoeng av celler; og (4), 75-100% av cellene. Den samlede poengsum var et produkt av de to [18].
Western Blot analyse
Proteinprøver ble ekstrahert fra celler eller vev ved sonikering i en lyseringsbuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris HCI (pH8.8), 0,1% SDS, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% NP40, 5 ug /ml aprotinin, 1 pg /ml leupeptin) på is, og deretter sentrifugert ved 12000 rpm i 10 min. Proteiner ble oppløst ved SDS-PAGE og elektrooverført til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad, CA, USA). Ikke-spesifikk binding ble blokkert med 5% fettfri melk i 1 time ved romtemperatur. Membranen ble deretter separat inkubert med anti-RhoE antistoff (fortynnet 1: 400; Upstate, MA, USA), anti-CXCR4 antistoff (fortynnet 1: 1000; Sigma-Aldrich, MO, USA), anti-VEGFA antistoff (fortynnet 1 : 500; Abcam, MA, USA), anti-CD82-antistoff (fortynnet 1: 1000; Abcam, MA, USA), anti-CTSK antistoff (fortynnet 1: 1000, Santa Cruz, Texas, USA) eller β-aktin-antistoff ( fortynnet 1: 10000, Sigma-Aldrich, MO, USA) over natten ved 4 ° C. Etter fire vaskinger med TBS-T-buffer, ble membranene inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (fortynnet 1: 2000, Santa Cruz, Texas, USA) i 1 time ved romtemperatur. Etter 4 vaskinger med TBS-T-buffer, ble båndene utviklet med SuperSignal Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific, MA, USA) for å visualisere proteiner. Blottene ble deretter analysert ved Kvantum One® programvare (versjon 4.2. Bio-Rad, CA, USA) etter brukerhåndboken. Western blot for β-aktin uttrykk ble brukt som en intern kontroll.
Ektopisk Expression og siRNA-mediert lyddemping
For ektopisk uttrykk for målgener, mage kreft celler ble transduced med lentivirus vektor uttrykker RhoE eller CXCR4 (levert av GeneChem, Shanghai, Kina). I korthet ble cellene sådd ut og dyrket til 75 til 80% konfluens uten antibiotika, hvoretter lentivirale vektorer ble tilsatt til cellene i vekstmedium inneholdende polybren (2 ug /ml) ved en MOI på 50. Deretter ble cellene dyrket til en annen 72 h og infeksjonen effektiviteten~~POS=HEADCOMP ble undersøkt ved fluorescens mikroskopi og Western blot-analyse. Forstyrrelse av menneskelig RhoE eller CXCR4 uttrykk ble oppnådd ved hjelp av en RNA-interferens teknikk. siRNA tomannsboliger ble syntetisert av Takara Bioteknologi (Liaoning, Kina) og målrettede sekvenser av RhoE eller CXCR4 ble definert slik:
RhoE, 5′-GAACGUGAAAUGCAAGAUAUU-3 «;
CXCR4, 5′-UAAAAUCUUCCUGCCCACC-3 «.
Kontroll siRNA tomannsboliger ble utformet etter avhør BLAST database med uspesifikke rettet mot sekvenser. Celler ble transfektert med oligonukleotid-duplekser ved hjelp LipofectamineTM 2000 (Invitrogen, NY, USA) i henhold til produsentens instruksjoner, hvoretter de ble utsatt for ytterligere analyser 48 timer etter transfeksjon.
sårhelende analysen
For å oppdage cellemotilitet ble eksponensiell fase celler sådd ut i 6-brønners plater. Etter at cellene nådde konfluens som et monolag av celler på platen substratet, ble en plastisk pipettespissen trekkes over midten av platen for å frembringe en ren 1 mm bred sårområdet og mediet ble erstattet med friskt RPMI 1640 inneholdende 1% føtalt bovint serum . Etter 48 timer ble celle bevegelse inn i sårområdet vurdert ved hjelp av et fasekontrastmikroskop som tidligere beskrevet [19,20].
Invasion Assay
Cell invasjons analyser ble utført ved anvendelse av et transwell plate (Corning, NY, USA) belagt med Matrigel (Becton Dickinson, NJ, USA). I korthet Matrigel ble fortynnet til en konsentrasjon på 2 mg /ml, og 50 ul av denne løsning ble plassert i et polykarbonatfilter og lufttørket. Etter skylling med PBS ble filtrene plassert i brønnene og 700 ul av RPMI-1640 dyrkningsmedium supplert med 10% FBS ble tilsatt i det nedre kammeret. Celler ble resuspendert i RPMI-1640 inneholdende 1% FBS og 1 x 105 celler i 0,2 ml definerte medium ble platet inn i det øvre kammer. Celler i invasjons kamrene ble inkubert i en fuktet inkubator i 12-48 timer. Etter ytterligere inkubering ble cellene som gjennomtrengt porene i membranen og dispergert til den nedre overflate av filtrene farget med 5% krystallfiolett oppløsning for visualisering. Deretter ble invaderte celler i hver brønn tellet under et lysmikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) og kvantifisert fra visualisering fem tilfeldige feltene ved en forstørrelse på x 200 og i gjennomsnitt som beskrevet av Albini [21]. Invasjonen Analysen ble gjentatt 3 ganger. Verdien av søylediagram representerer gjennomsnittlig antall invaderte celler fra 3 separate eksperimenter.
nålevenen metastatisk analysen
halevenen metaanalysen ble bestemt som tidligere rapportert [22]. Tretti mannlige nakne mus ble håndtert ved hjelp beste human praksis og var ivaretatt i samsvar med NIH Animal Care og bruk komité retningslinjer. Cellene ble høstet ved bruk av trypsin og vasket tre ganger med PBS. Musene ble deretter injisert med 1 x 106 celler i 0,1 ml PBS via haleveneinjeksjon. Musene ble deretter overvåket i generell helse og total kroppsvekt. På den 28. dagen etter injeksjonen, ble musene avlivet. Lunge og levervev ble observert ved blotte øye og antall synlige svulster på overflaten lunge og lever ble kvantifisert. Lunge og levervev ble skåret i seriesnitt, farget med hematoksylin og eosin, så observert under et lysmikroskop. Eksperimentelle og kontrollgrupper hver inneholdt 6 mus. Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Experimental Animal Welfare og etikkomiteen, den fjerde Military Medical University den. Dyreforsøk ble utført med godkjenning av Institutional komité for Forsøksdyrutvalget, i samsvar med nasjonale retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr.
metastase PCR Array
uttrykk for metastasis- assosierte gener ble bestemt ved den menneskelige tumormetastase PCR Array (PAH-028A; SuperArray Biosciences, Maryland, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Først, ble total RNA ekstrahert fra RhoE-lentviral infiserte SGC7901 celler og kontrollceller ved å bruke standardprotokoller, som deretter ble omdannet til første-tråd cDNA. CDNA-templat ble kombinert med en 2 x SuperArray PCR masterblanding, tilsatt til brønnene i en PCR-Array plate (384-brønn) inneholdende de genspesifikke primer sett, og utsatt for real-time PCR. PCR-sykling Betingelsene var som følger: 40 sykluser ved 95 ° C i 15 s, 60 ° C i 1 min, og 72 ° C i 30 sek. Fem housekeeping gener ble brukt som intern kontroll. Fold-endring i uttrykket av metastaserelaterte gener ble bestemt av ΔΔCt metoden.
Statistical Analysis
Dataanalyse ble utført ved hjelp av SPSS 17.0 statistisk analyse programvare (Chicago, IL, USA). Mann-Whitney U-test ble benyttet for å vurdere betydningen av forskjeller i hyppigheten av uttrykk for RhoE mellom magekreft vev og lymfeknutemetastaser. Den Kruskal-Wallis H test for multi-grupper, og Mann-Whitney U test for to gruppesammenligninger var ansatt for å analysere forholdet mellom begge RhoE uttrykk nivåer og ulike klinisk-patologisk forhold av magekreft prøver. Akkumulert overlevelse ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier overlevelsesmetode og analysert av log-rank test. Univariate og multivariate analysene var basert på Cox regresjonsmodell. Sammenligninger av kvantitative data ble analysert ved Student T-test mellom to grupper. Korrelasjonsanalyse mellom uttrykket av RhoE og CXCR4 ble estimert ved Spearman rang korrelasjon metode. Forskjeller ble vurdert som statistisk signifikant når P 0,05.
Resultater
Over-uttrykk for RhoE er korrelert med differensiering klasse og svulst staging i mage kreft vev og indikerer en dårlig prognose for pasienter
uttrykk for RhoE i mage cancervev tilstøtende ikke-tumorvev og beslektede metastatisk lymfeknute vev ble undersøkt ved hjelp av immunhistokjemi (figur 1A). RhoE ekspresjon ble funnet svakt uttrykt eller fraværende i tilgrensende ikke-tumorvev (a), mens dets ekspresjon var signifikant høyere i magekreft vev og lymfeknutemetastaser (b-e). Deretter analyserte vi forholdet mellom RhoE farging og clinicopathological parametrene av mage kreft (Tabell 1). Resultatene viste at hverken kjønn eller alder var korrelert med ekspresjonen av RhoE. Imidlertid økte RhoE ekspresjon ble statistisk korrelert med graden av differensiering (P = 0,005) og tumor staging, som besto av tumorstørrelsen (T, P 0,001), lymfeknute invasjon (N, P = 0,001), og fjern metastase (M, P = 0,003). Videre Kaplan-Meier overlevelsesanalyse viste at pasienter med høye uttrykk nivåer av RhoE, presentert med en kortere total overlevelse sammenlignet pasienter med negative uttrykk for RhoE (figur 1B). Multivariat Cox modell vurderinger indikert at nivåene av RhoE uttrykk var en selvstendig og vesentlig faktor for å overleve i mage kreftpasienter (tabell S1).
(A), Immunhistokjemisk analyse av RhoE i vev; (A), normal gastrisk epitel; og (b) godt differensiert, (c) moderat differensiert eller (d) dårlig differensiert magekreft vev; (E) metastatisk området i lymfeknute. Brun farge representerer positive RhoE farging. (B), Kaplan- Meier postoperativ overlevelseskurve som en funksjon av RhoE uttrykk. (C), Western blot-analyse av RhoE ekspresjon i forskjellige gastriske cellelinjer. β-aktin ble benyttet som intern kontroll. De relative uttrykk nivåer av RhoE i magekreft cellelinjer ble presentert som søylediagrammer. * P. 0,05
Expression nivå RhoE
Kategori
n –
+
++
+ ++
P value
Total9014283216Age0.421≤6041610187 6049818149Gender0.742Male679232213Female2355103Differentiation0.005
aWell52120Moderately471215146Poorly380121610TNM stageT 0.001
aT194320T2175840T347414209T4171367N0.001
bN031111073N1-N3593182513M0.003
bM08014272811M1100145Table 1. Statistisk analyse av Immunhistokjemisk analyse
a, Kruskal-Wallis H Test.;
b, Mann-Whitney U Test CSV ned CSV
Deretter studerte vi uttrykket nivåer av RhoE i primær mage kreft vev og deres matchet metastatisk lymfeknute vev. Uttrykket nivåer av RhoE var fraværende i 7 magekreft vev, svakt uttrykt i 16 magekreftpasienter, moderat uttrykt i 11, og sterkt uttrykt i 6 kreftvev, respektivt. I motsetning i lymfeknutemetastaser det tilsvarende nummer var 3, 12, 14 og 11. I tillegg, ekspresjon av RhoE var signifikant høyere hos pasienter med metastatisk lymfeknute vev enn det man finner i primær cancervev. Disse observasjonene indikerer at RhoE uttrykk ble korrelert med metastaser i magekreft (tabell 2, P 0,05).
Expression nivå RhoE
Histologisk typen
n
–
+
++
+++
P Verdi
Primær kreft tissues407161160.048
* lymfeknute metastases403121411Table 2. Expression of RhoE i Primær kreftvev og matches lymfeknutemetastaser .
* Mann-Whitney U Test CSV ned CSV
uttrykk av RhoE i cellelinjer ble analysert ved Western blot (figur 1C). Vi har funnet at sammenlignet med den i den GES cellelinje, ekspresjonen av RhoE var signifikant høyere i forskjellige mage cancer-cellelinjer. Videre er nivået av RhoE protein ekspresjon var signifikant høyere i meget inngripende SGC7901-M celleunderlinje enn på den mindre invasiv celle sub-linje SGC7901-NM. Derfor videre studier av metastase ble ferdig basert på mobilnettet modellering med SGC7901-M og SGC7901-NM cellelinjer.
RhoE fremmer trekkende og invasive evner av mage kreftceller in vitro og in vivo
for å undersøke hvilken rolle RhoE i magekreft metastaser, vi oppregulert sin protein uttrykk i SGC7901-NM celler etter transduksjon med RhoE lentivirus vektor eller kontroll vektor (oppkalt SGC7901-NM-RhoE eller SGC7901-NM-kontroll ). I motsetning til dette, fukte av RhoE ekspresjon i SGC7901-M-celler ble oppnådd etter transfeksjon med siRNA rettet mot RhoE mRNA eller med kontroll siRNA (kalt SGC7901-M-siRhoE eller SGC7901-M-kontroll henholdsvis). Protein ekspresjonsnivåer ble bekreftet ved Western blot-analyse etter transfeksjon (figur 2A).
(A), RhoE ble nedregulert i SGC7901-M-celler etter behandling med siRNA mens RhoE ekspresjon var oppregulert i SGC7901- NM-celler etter behandling med lentivirus. RhoE proteinnivåer ble bekreftet ved Western blot-analyse. (B), ble det vandrende evne til cellene evaluert av et sårhelende analysen. Såret bredder av hver prøve ble målt ved forskjellige tidspunkter ved fasekontrastmikroskopi (Olympus, Tokyo, Japan), og lukke forholdet ble beregnet i samsvar med følgende formel: lukking av sår (%) = (bredde 0 h) – bredde 24 h) /bredde 0 t. * P 0,05. Disse resultatene ble så sammenlignet med de fra kontrollcellene. (C), ble tumorcelle-invasjon aktivitetene målt ved hjelp av transwell-analyse. Representative bildefelt som invasive celler på membranen er vist. Data er representert som normalisert cellular invasjon (invasjon indeks) i forhold til kontrollceller. * P 0,05. Bildene som vises er representative for tre forsøk.
Neste
in vitro
migrasjon og invasjon analysen ble utført (figur 2B og 2C). Vi fant forbedret uttrykk for RhoE kunne gi en betydelig up-regulere trekkende og invasive evner av magekreft cellelinje SGC7901-NM, i sårheling og Transwell invasjons analyser. I motsetning SGC7901-M-celler, stiller dempet uttrykk for RhoE viste en bemerkelsesverdig hemming av trekkende og invasive evner sammenlignet med kontrollceller. For å forstå om funksjonene til RhoE var vanlige hendelser i ulike magekreftceller eller SGC7091 spesifikke hendelser, ble magekreftcellelinjer MKN45 og MKN28 brukes til å fullføre de samme eksperimentene. Resultatene av både sårhelende og Transwell invasjons analyser viste at RhoE fremmet trekk og invasive evnene til både MKN45 og MKN28 celler (figur S1), som foreslo at funksjonene RhoE som ble oppdaget
in vitro
var fullstendig for all magecancercellelinjer. I mellomtiden, også utførte vi MTT analyse for å teste været endring av RhoE uttrykk kan påvirke cellevekst av magekreft i vår studie. Som fig S3A vist, kunne hverken opp- regulering av RhoE i SGC7901-NM-celler eller nedregulering av RhoE i SGC7901-M-celler forårsaker markert endring av celleproliferasjon (p 0,05), utelukkes således virkningen av RhoE på celleproliferasjon som ville bringe forvirring for våre resultater og videre bekreftet at RhoE kan fremme cellemotilitet av mage kreftceller.
for ytterligere å undersøke om økt RhoE kunne endre
in vivo
metastatisk evne av magekreftceller vi utførte
in vivo
hale vene metastatiske analyser i nakne mus ved bruk SGC7901-NM-RhoE og SGC7901-NM-kontroll cellelinjene. I mus ofret, ble det funnet at celler som viser et høyere nivå av ekspresjon RhoE førte til betydelig mer synlige lever- og lunge-overflate tumorer sammenlignet med kontrollceller (P 0,05, figur 3). H og E farging viste at SGC7901-NM-RhoE celler tilsynelatende produsert metastaser i både lever og lunger, mens kontrollcellene vises bare delvise metastaser. Samlet utgjør disse resultatene at det RhoE spilt en viktig rolle i å fremme metastaser av magekreftceller både
in vitro Hotell og
in vivo
.
H og E farging av både lungene og leveren ble vurdert fra mus som hadde fått intravenøs hale injeksjoner av SGC7901-NM-RhoE og kontrollceller hhv. Metastatisk loci ble identifisert og merket med piler. Antallet metastatisk loci i leveren og lungen ble også tellet (i midten). * P. 0,05
CXCR4 kan være en ned-stream genet av RhoE i magekreft
For å bestemme de mulige ned-stream gener gjennom hvilke RhoE kan megle sin funksjon i metastasen av mage kreft celler, utførte vi PCR Array å utforske forskjellig uttrykk for metastaserelaterte gener som deles mellom SGC7901-NM-RhoE og SGC7901-NM-kontroll cellelinjene. Gener som økes eller reduseres ≥ 2 ganger ble ansett som potensielle RhoE avhengige nedstrøms gener. I sum, vi har oppdaget 84 gener og til slutt fant 6, som var markert forandret etter ekspresjon av RhoE ble forbedret (tabell 3). Blant de 6 gener, 3 (CXCR4, VEGFA, CTSK) var oppregulert, og tre andre (MMP7, CD82, CTSL1) ble nedregulert i SGC7901-NM-RhoE celler.
Expression nivået av mRNA
Gene navn
Beskrivelse
SGC7901-NM-kontroll
SGC7901-NM-RhoE
CXCR4Chemokine (CXC motiv) reseptor 41.003.30VEGFAVascular endotelial vekstfaktor A1.002.78CTSKCathepsin K1.002.68CTSL1Cathepsin L11.00-2.12CD82CD82 molecule1.00-2.29MMP7Matrix metallopeptidase 71.00-2.47Table 3. forskjellig uttrykt metastaserelaterte gener etter Augmented RhoE Expression.
CSV ned CSV
i denne studien ble det uttrykk for CXCR4, VEGFA, CTSK og CD82 verifisert av Western blot analyse og interessant, vi fant ut at bare CXCR4 uttrykk var konsistent med resultatene oppnådd ved PCR rekke analyse. Proteininnholdet av CXCR4 ble undertrykt av innblanding av RhoE og derimot, ble økt da RhoE ble ectopically uttrykt (Figur 4A). Således ble korrelasjonen mellom RhoE og CXCR4 ekspresjon analysert ved hjelp av immunhistokjemi i 60 magekreft vev Resultatene viste at CXCR4 ble sterkt uttrykt i vev hvor RhoE ble positivt farget, mens det var dårlig uttrykt i disse vevene hvor RhoE ble uttrykt ved et lavt nivå (Figur 4B). I tillegg er både RhoE og CXCR4 uttrykk var konkordant i 83,3% (50/60) av mage karsinomer eksemplarer, den Spearman R korrelasjonskoeffisient var 0,80 (P 0,001) og indikerte en nær sammenheng mellom både RhoE og CXCR4 uttrykk i mage kreft (tabell 4). Som rapportert, over-uttrykte CXCR4 spiller også en viktig rolle i cancermetastase og er involvert i EMT prosessen, noe som antydet at CXCR4 kan være en nedstrøms gen av RhoE med viktighet i den metastasering av magekreftceller [23].
(A) RhoE, CXCR4, VEGFA, CD82 og CTSK uttrykk for SGC7901-M-kontroll, SGC7901-M- siRhoE, SGC7901-NM-kontroll, og SGC7901-NM-RhoE cellelinjer. Ekspresjonen av β-aktin ble benyttet som intern kontroll. De relative uttrykk nivåer av CXCR4 ble vist som søylediagrammer. * P 0,05. Verdiene representerer den aritmetiske middelverdi og standardavvik av gjennomsnittet (SEM) som bestemt fra minst tre forsøk. (B) Immunhistokjemisk farging av RhoE og CXCR4 i 60 par av magekreft vev. Tre representative tilfeller viste at CXCR4 uttrykket var godt korrelert med at av RhoE.
CXCR4
Spearmans correlation
RhoE
+
++
+++
Negative
n
p
p
R
+1820060 0.001 0.0010.80++11730+++0270Negative2008Table 4. Sammenheng mellom Expression of RhoE og CXCR4 i 60 par med Gastric Cancer vev.
CSV ned CSV
CXCR4 er viktig i å indusere invasjon av RhoE i magekreftceller
For å undersøke effekten av CXCR4 på evnen til RhoE til å fungere i den metastasering av magekreft, forsterket vi ekspresjonen av CRCR4 i SGC7901-M-siRhoE celler ved lentiviral tranduction og nedregulert dets ekspresjon i SGC7901-NM-RhoE celler ved siRNA forstyrrelser. Proteininnholdet ble bestemt ved Western blot-analyse (figur S2). I det følgende transwell analysen, fant vi at økt uttrykk for CXCR4 kunne gjenopprette invasiv evne SGC7901-M-siRhoE celler, mens derimot stanse endogen CXCR4 trykt invasjonen av SGC7901-NM-RhoE celler (figur 5). Disse observasjonene indikerer at RhoE gastrisk kreft celle invasjon, som ble delvis mediert av CXCR4. Disse observasjonene også videre vist at CXCR4 var en ned-stream målet for RhoE.
Påvirkningen av CXCR4 på RhoE indusert metastase ble målt med en transwell analysen. I SGC7901-M-siRhoE celler, ble CXCR4 forbedret følgende lentivirus infeksjon. I SGC7901-NM-RhoE celler, ble CXCR4 slått ut av behandling med siRNA forstyrrelser. Antallet invaderende celler ble bestemt og presentert som søylediagrammer. * P 0,05, i sammenligninger mellom de cellelinjer som oppviser forskjellige nivåer av ekspresjon av RhoE. ** P. 0,05, i sammenligninger mellom cellelinjene viser differensial nivåer av uttrykk for CXCR4
Diskusjoner
abnormt-uttrykt RhoE er ofte assosiert med tumorprogresjon. Imidlertid kan den rollen o RhoE skifte mellom tumor suppressor og onkogen avhengig av opprinnelsen av svulsten [7-9]. Som rapportert, forblir magekreft en av de vanligste kreftformene over hele verden, spesielt i Øst-Asia. Tidligere har det vist seg at unormal RhoE uttrykk er godt korrelert med utviklingen av magekreft. Som Zhou og Li som er beskrevet, er ekspresjonen av RhoE øket i mage kreft ved induksjon av HIF-1α, og hvis ekspresjon kan gå øket enda mer når kreftceller genererer resistens mot anti-tumor medikamenter. I tillegg fremmer økt uttrykk av RhoE legemiddelresistens ved å undertrykke Bax uttrykk [13,24].
I denne studien fant vi at RhoE uttrykket ble forhøyet i mage kreft vev mens det var fraværende eller svakt uttrykt i tilstøtende ikke-tumorvevet. I tillegg har kliniske bevis viste at RhoE over-ekspresjon ble signifikant korrelert med graden av kreftcelledifferensiering og TNM staging, som består av tumorstørrelsen (T), lymfeknute invasjon (N) og metastase (M). Enda viktigere, RhoE uttrykk nivåer var en selvstendig og betydelig risikofaktor for å overleve i magekreft. Videre kan oppregulert uttrykk for RhoE forutsi et dårlig resultat i mage kreftpasienter. Til sammen våre data sterkt antydet at RhoE kan ha fungert som et onkogen i magekreft og spilte en positiv rolle i magekreft progresjon, spesielt i kreft metastasering. Det er formelt mulig at RhoE kan være en roman prognostisk faktor hos pasienter med magekreft. Således, tatt i betraktning at metastase er en av de viktigste grunnene for magekreft dødelighet, kan våre funn tilveiebringe en ny ledetråd eller nye målet for å hemme tumormetastase i magekreft og kan til slutt bidra til utvikling av terapeutiske strategier for å forlenge overlevelse av pasienter.
Likevel rolle RhoE i kreft metastase forblir delvis ubestemt. I leverkreft og mesenchymale kreftceller, økt RhoE uttrykk korrelerer med redusert metastatisk evne, mens i melanomceller, fremmer RhoE celle migrasjon og invasjon [10,12,25]. For å undersøke hvilken rolle RhoE i metastasering av magekreft, vi slås ned RhoE i SGC7901-M cellelinje, som har et høyt metastatisk potensiale, og vi indusert dets ekspresjon i den SGC7901-NM cellelinje, som er fattig på metastase . Deretter
in vitro
analyser viste at økt RhoE fremmet cellulær motilitet og invasivitet, mens redusert RhoE førte til en ikke-invasiv karakter av magekreftceller. Disse resultatene ble ytterligere bekreftet av
in vivo
analysen. Det er velkjent at forbedret kreftcellemigrering og invasjon er nødvendige skritt for slutt dannelsen av metastaser. Derfor, i magekreftceller, kan RhoE være en funksjonell metastase-fremmende genet. Likevel, vi også lagt merke til at cellen morfologi endret seg mye etter endring av RhoE uttrykk. Ytterligere undersøkelser funnet at dette morfologiske forandringen kan være forårsaket av bortfall av spenning fiber (figur S3b), snarere enn endring av celle proliferasjon.
Som rapportert, regulerer RhoE kreft metastasering, og gjør det meste ved å hemme ROCK /MYPT vei [26]. Denne delen ble undersøkt i en annen forskningsstudie av vår gruppe (data ikke vist).
