Abstract
ovarialcancer er en svært heterogen sykdom og er fortsatt den mest dødelige gynekologisk kreftform i den vestlige verden. Terapeutiske tilnærminger må ta høyde for inter-pasient og intra-svulst heterogenitet og detaljert karakterisering av
in vitro
modeller som representerer de ulike histologiske og molekylær ovarian kreft subtyper er avgjørende for å muliggjøre pålitelig preklinisk testing. Det er ca 100 offentlig tilgjengelige eggstokkreft cellelinjer, men deres cellulære og molekylære egenskaper er i stor grad ubeskrevet. Vi har preget 39 eggstokkreft celle linjer under ensartede vilkår for vekstegenskaper, mRNA /mikroRNA uttrykk, exon sekvensering, narkotika respons for klinisk relevante legemiddelselskap og samlet all tilgjengelig informasjon om den opprinnelige kliniske funksjoner og stedet opprinnelse. Vi testet for statistiske sammenhenger mellom de cellulære og molekylære funksjoner av linjer og kliniske egenskaper. Av de 39 eggstokkreft cellelinjer, 14 ble tildelt som høyverdig serøs, fire serøs-type, en lavgradig serøs og 20 ikke-serøs type. Tre morfologiske undertyper: Epithelial (n = 21), Round (n = 7) og spindelen (n = 12) ble identifisert som viste distinkte biologiske og molekylære karakteristika, inkludert overekspresjon av celle bevegelse og migrasjons-assosierte gener i Spindle subtype. Sammenligning med de opprinnelige kliniske data viste sammenslutning av spindel-lignende svulster med metastaser, avansert stadium, suboptimal debulking og dårlig prognose. I tillegg er uttrykket profiler av Spindel, Round og Epithelial morfologi gruppert sammen med den tidligere beskrevne henholdsvis C1-stromal, C5-mesenchymale og C4-ovarie subtype ekspresjonsprofiler. Omfattende profilering av 39 eggstokkreft cellelinjer under kontrollerte, ensartede vilkår demonstrerer klinisk relevante cellulære og genomiske egenskaper. Denne informasjonen gir et rasjonelt grunnlag for valg av modeller for å utvikle spesifikke behandlingsmetoder for histologiske og molekylær subtyper av eggstokkreft
Citation. Beaufort CM, Helmijr JCA, Piskorz AM, Hoogstraat M, Ruigrok-Ritstier K, Besselink N , et al. (2014) Ovarian Cancer Cell linje Panel (OCCP): Klinisk Viktigheten av
In Vitro
Morfologiske Subtyper. PLoS ONE ni (9): e103988. doi: 10,1371 /journal.pone.0103988
Redaktør: Richard Pearson, Peter MacCallum Cancer Centre, Australia
mottatt: 15 november 2013; Godkjent: 05.07.2014; Publisert: 17.09.2014
Copyright: © 2014 Beaufort et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet delvis av Senter for personlig Cancer Treatment (et samarbeid mellom UMC Utrecht, Erasmus MC Rotterdam og Nederland Cancer Institute Amsterdam), den KWF-Alpe (UU 2011-4977) og den europeiske organisasjonen for forskning og behandling av kreft (tilskudd nr. EORTC STrF 2008-03, JH). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ovarialcancer er den mest dødelige gynekologisk kreftform i den vestlige verden og avansert sykdom er fortsatt uhelbredelig for de fleste pasienter. Til tross for testing av ulike behandlingsstrategier og nye cytostatika, optimal primærbehandling og overlevelse har ikke vesentlig endret siden innføringen av platina og taxan behandling [1] – [3].
Nye innsikter har indikert at eggstokkreft er en samlebetegnelse for invasive bekken kreft som er utledet fra ulike vev med forskjellige histologiske og epidemiologiske funksjoner. De fem store histiotypes har vist seg å ha spesifikke genetiske profiler og bør behandles som forskjellige sykdommer. Høy grad av serøs (HGS) carcinoma representerer 80% av eggstokkreft og er definert av
TP53
mutasjon (96%), homolog rekombinasjon DNA-reparasjon defekter (-50%),
CCNE1
forsterkning og genomisk instabilitet [4] – [6]. I motsetning lavgradig serøs karsinom er
TP53
hvete og viser ofte aktivering RAS pathway mutasjoner [7], [8]. De resterende histiotypes er mucinous, endometrioid og klarcellet [3]. Aktivering RAS pathway mutasjoner er funnet i ~40% av mucinkjertler svulster mens endometrioid og klar celle svulster har
PIK3CA plakater (PI3Kinase komponent, 12%, 31% henholdsvis), og
ARID1A
mutasjoner ( 30%, 46%, respektivt) [4], [5], [9], [10].
videre er det store studier identifisert flere molekylære subtyper av HGS basert på gene og mikroRNA uttrykk [4] , [11]. Disse undergrupper foreslår forbindelser med spesifikke biologiske prosesser (for eksempel reaktive stroma, mesenchymale, immunoreaktive og proliferasjon) og dårlig prognose, for eksempel i C1 stromal-undertypen identifisert av Tothill et al. [4], [11]. Videre utforsker de kliniske kjennetegn ved disse biologiske forskjellige undergrupper og identifisere en optimal behandling kan identifisere nye terapeutiske strategier.
Det er viktig at eksperimentelt medgjørlig in vitro modeller, for eksempel cellelinjer, nøyaktig representere de ulike histologiske og molekylære undergrupper for å teste ny subtype spesifikke behandlingsstrategier. På verdensbasis er det rundt 100 eggstokkreft cellelinjer generert som beskrevet i litteraturen [12] – [17] og ca 70 av disse er tilgjengelige på ATCC, ECACC, Riken, DSMZ, JCRB eller Cancer Research Technology. Siden 1990 er i gjennomsnitt ca 100 papers /år publisert som er avhengig av eggstokkreft cellelinjer som modell. En viktig begrensning for disse studiene er det faktum at for de fleste av ovarie cellelinjer deres opprinnelse er dårlig definert, og på grunn av mangelfull karakterisering er det ikke kjent hvilke distinkte histologisk eller molekyl subtype er representert.
Vi her beskriver en omfattende og uniform karakterisering av en samling av 39 eggstokkreft cellelinjer som vanligvis brukes for
in vitro
studier. Vi identifiserte histologisk samt morfologiske undergrupper som forbinder med kliniske patologiske kjennetegn på eggstokkene karsinomer samt prognose. Videre er de morfologiske subtyper knyttes til de molekylære subtypene identifisert ved Tothill et al. [11]. Oppsummert kan disse resultatene fungere som en guide for å velge hensiktsmessige cellelinjer som representerer ulike histologiske og molekylær subtype av eggstokkreft for
in vitro
terapeutiske studier.
Materialer og metoder
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og dyrking
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP studert ble CAOV3, CAOV4, ES-2, OV-90, OVCAR3, TOV-112d, TOV-21G, UWB1.289, UWB1.289 + BRCA1 (kjøpt fra ATCC ), 59M, A2780, A2780CIS, A2780ADR, «COLO720E», COV318, COV362, COV362.4, COV413A, COV413B, COV504, COV644, OAW28, OAW42, OV56, OV7, OV17R, PEA1, PEA2, PEO1, PEO4, PEO14, PEO16, PEO23, SKOV3 (kjøpt fra den europeiske samling av cellekulturer, ECACC via Sigma), 2774, A2780, HOC7, SKOV3, SKOV6 (courtesy of Gunter Daxenbichler, Institutt for obstetrikk og gynekologi ved Universitetet i Innsbruck, Østerrike), IGROV1 (courtesy of Dr. Irene Hamelers, Institute of biomembraner, Utrecht University, Nederland). Tabell S1 oppsummerer den opprinnelige kilden for cellelinjene. Cellelinjene A2780 og SKOV3 ble begge oppnådd fra en akademisk laboratorium og også kjøpt fra ECACC, og beskrives her som «A2780 ECACC «og» SKOV3 ECACC «. Trettini av de 40 cellelinjer ble dyrket som monolag, med unntak av den semi-adherente cellelinje «COLO720E» hvor flytende og festede celler ble passert. Vedlagte celler ble fullt inndelt ved trypsinering mellom passasjer. Cellelinjene ble opprettholdt ved 37 ° C i en inkubator med fuktig luft med 5% CO2.
Alle cellelinjer var innledningsvis dyrket ved hjelp av mediet og kosttilskudd som anbefalt av leverandørene. I motsetning til andre studier, dyrket vi alle cellelinjer under de samme dyrkningsbetingelser for å unngå skjevheter på grunn av varierende konsentrasjoner av bilag i ulike medier (for eksempel vekstfaktorer) eller forskjellige prosenter av serum. Alle cellelinjene ble dyrket i RPMI-1640 Glutamax, Gibco /Invitrogen supplert med 10% FCS (Lonza, kilde: Brasiliansk, Lot nr 1SB002), 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 50 ug /ml gentamycin. Alle eksperimenter og nukleinsyre-isolasjoner ble utført etter dyrking av cellelinjene i minst én måned ved hjelp av disse standardbetingelser.
UWB1.289 er en BRCA1-null-cellelinje fra kvinne med en germline
BRCA1
2594delC mutasjon. UWB1.289 + BRCA1 er stabilt transfektert med en pcDNA3 plasmid som inneholder en
BRCA1
sette inn og ble opprettholdt med 200 mikrogram /ml Geneticin (G418) for å opprettholde valget for transfekterte celler. A2780ADR og A2780CIS ble utfordret gang i måneden med 100 nM Doxorubicin og 1fiM Cisplatin hhv.
Short tandem repeat analyse
PowerPlex 16 System (Promega) ble brukt i henhold til produsentens protokollen ved hjelp av en ABI PRISM 3100 for å generere en STR (Short tandem repeat) fingeravtrykk av hver cellelinjen for å fastslå identitet og /eller mangel på co-kultur forurensning. I tillegg ble STR profilen kontrollert før og i løpet av dyrking av cellene for å sikre at kryssforurensning eller feilaktige substitusjon ikke forekomme.
Vekstkurver og medikamentsensitivitetsanalysen
MTT kolorimetrisk analyse , som måler metabolsk aktivitet av levedyktige celler, ble anvendt for å danne vekstkurver og bestemme kjemosensitivitet av cellelinjene.
Først ble vekstkurver generert in duplo for å bestemme det optimale antall celler som skal brukes for narkotika følsomhet analysen. Dette ble gjort for å unngå veksthemming etter såing ikke nok celler eller uttømming av mediet etter utsåing for mange celler. Det høyeste antall celler som viser fortsatt eksponensiell vekst etter fem dager ble valgt for legemiddelrespons MTT-analyser (Tabell S1, File S1).
responskurver ble generert for karboplatin, cisplatin, oksaliplatin, doxorubicin og 5-Fluorouracil (intravenøse løsninger, Pharmachemie, Nederland), Paclitaxel (intravenøs løsning, Ebewe Pharma, Østerrike), Docetaxel (oppløst i DMSO, Sigma), og Gemcitabin (for intravenøs bruk, oppløst i PBS, Sun Pharmaceutical Industries Europe BV, Nederland) . Cellelevedyktigheten ble evaluert i fire eksemplarer ved anvendelse av MTT-analysen etter en fem dagers eksponering for 18 konsentrasjoner av forbindelsen. Phoenix WinNonlin 1.1 programvare (Pharsight) ble brukt til å passe en doseresponskurve og å beregne 50% veksthemming verdier (GI50) med feil og 95% konfidensintervall (se også Fil S1).
DNA og total RNA isolering
NucleoSpin kit (Machery-Nagel) ble anvendt i henhold til produsentens protokoll for å isolere DNA fra celler høstet med trypsin og vasket med PBS.
for isoleringen av total RNA (inkludert microRNAs), ble eksponentielt voksende celler direkte lysert i kulturflasker med RNA-Bee å unngå endringer i uttrykk som følge av høsting eller vask. Total RNA ble isolert fra lysater som tidligere beskrevet [18]. Tre uavhengige isolater av RNA fra hver linje ble slått sammen for mRNA og mikroRNA uttrykk analyse for å redusere mulig skjevhet fra uteligger verdier.
mikroRNA og analyse av genuttrykk
For mikroRNA uttrykk analyse, TaqMan Array Menneskelig mikroRNA En fluidic kort v2.0 (Applied Biosystems) inneholder QRT-PCR-analyser for å kvantifisere 381 unike microRNAs ble brukt i henhold til produsentens protokoll. Uttrykket data ble normalisert ved hjelp av median Ct av alle målte microRNAs som beskrevet av Vandesompele et al. [19] (se også Fil S1). De normaliserte uttrykk data for alle 384 microRNAs er gitt i tabell S2.
Gene uttrykket ble målt ved hjelp av Genechip Menneskelig Exon 1,0 ST Array (Affymetrix) i henhold til produsentens protokoll (se også Fil S1). Den kjøpte uttrykk data var pre-prosessert ved hjelp av Robust multichip Analysis (RMA) algoritme i Affymetrix Expression Console-programvaren som utfører bakgrunnskorreksjon, normalisering og probe sett samandrag per transkripsjon resulterer i ett uttrykk verdi per genet. Den genuttrykk data har blitt deponert i Gene Expression Omnibus (GSE53418)
Snapshot mutasjonsanalyse
Snapshot analyse ble utført som beskrevet tidligere [20] -. [22] med en Applied Biosystems øyeblikksbilde multiplex Kit. De nukleotid og tilsvarende aminosyre forandringer evaluert var for PIK3CA, BRAF, HRAS, NRAS og KRAS er oppført i supplement metoder (
Fil S1
).
Mutasjon og forsterkning analyser med solide ekson sekvense
Behandling av prøver for sekvensering på SOLiD5500 sekvense plattformen (Life Technologies) ble utført på en Sciclone NGS væske håndtering robot (Perkin Elmer), basert på protokollen for manuell bibliotek forberedelse [23]. Sure-Select berikelse for gener av interesse ble utført i en multiplex mote på opp til 16 prøver per reaksjon (basert på Nijman et al. [24]) ved hjelp av en spesialdesignet berikelse kit.
Data ble kartlagt til referanse genom (GRCh37 /hg19) med BWA og SNP og Indel kall ble gjort ved hjelp av en egendefinert analyse rørledning. Basert på den kosmiske database [9] og anmeldelsen av Berns et al. [5] ble 53 gener som ofte mutert eller forsterket i eggstokkreft valgt for analyser (se vedlegg metoder i File S1 for en liste med gener).
For analyse av genamplifisering, robuste Z-score ble beregnet per ekson som beskrevet av Iglewicz og Hoaglin [25]. Et gen er forsterket med en Z-score større enn 2 og høyt forsterkes hvis større enn 3.
Den faste Exon sekvensering har blitt deponert i Europa nukleotid Archive (PRJEB5114).
Mutation analyse av Merket-fragment dypt sekvensering (Tam-Seq)
de kodende sekvensene til TP53, BRCA1, BRCA2, PTEN, PIK3CA, EGFR og APC gener ble forsterket og sekvensert ved hjelp av Tam-Seq metoden og Fluidigm tilgang Array 48.48 (Fluidigm CA, USA) i henhold til produsentens protokoll som beskrevet tidligere [26]. ble utført sekvensanalyse og verifisering variant som tidligere beskrevet [26], [27]. Primersekvensene er tilgjengelig på forespørsel. Tam-Seq data har blitt deponert i Europa nukleotid Archive (PRJEB5183).
ustabilitet mikro
mikro ustabilitet ble bestemt ved hjelp av MSI analysesystem versjon 1.2 (Promega) i henhold til produsentens protokoll og som utføres rutinemessig elektroforese ved hjelp av en ABI PRISM 3100. MSI bestemmes på fem mononukleotid gjenta markører (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 og MONO-27).
FACS analyser
cellene ble høstet og farget med riktig titrert fluorokromkonjugerte konjugerte monoklonale antistoffer (som beskrevet tidligere [28]). I korte trekk ble cellene farget med antistoffer mot luminal cytokeratin tallet (CK) konjugert til PE (blanding av cytokeratin 8, 18 -clone C11- og cytokeratin 19 -clone A53-B /A2-, Veridex LCC, Raritan, NJ), CD24- FITC (klone SN3, eBiosciences, San Diego, CA), CD44-PeCy7 (klone IM7, eBiosciences) og EpCAM-FITC (klone EBA-en, BD Biosciences, San Jose). CK farging ble innledet av en fiksering og permeabilization trinn ved hjelp av FIX PERM reagenser (An Der Grub Bio Forskning GmbH, Østerrike). Proteinekspresjon ble målt på en FACSCanto strømningscytometer (BD Biosciences). Signal-til-støy-forhold (S /N) ble beregnet (dvs. geometriske middel fluorescensintensitet (MFI) av farget befolkningen dividert med MFI på de ufargede befolkning) for å korrigere for auto fluorescens.
Statistikk og visualisering
Statistiske analyser ble utført på 33 cellelinjer som ble generert fra unik eggstokkreft pasientmateriale. Duplikater (SKOV3 og A2780),
in vitro
derivater (A2780ADR, A2780CIS, COV362.4 og UWB1.289 + BRCA1) og muligens forurenset cellelinje «COLO720E» ble utelatt fra disse analysene. Statistiske analyser ble gjort ved hjelp av parametriske metoder i STATA statistikkpakke, slipper 12,0 (Stata Corp., College Station, TX). P-verdiene var tosidig og P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
BRB matriseverktøy (v4.3.1) ble anvendt for å velge gener og microRNAs differensielt uttrykte mellom de tre morfologiske subtyper.. Først microRNAs med 80% manglende verdier ble filtrert ut. Så manglende verdier som ikke ble flagget på grunn av lav kvalitet ble erstattet med minimal verdi over all microRNAs og prøver fulgt av 2log normalisering. Innen BRB, ble 50% mest variable microRNAs og mRNA valgt og klassen sammenligning algoritmen ble anvendt for å beregne den permutasjon p-verdi etter 10.000 permutasjoner. P 0,05 ble betraktet som signifikant. Hierarkisk clustering ble gjort på median sentrert mRNA og mikroRNA uttrykk data ved hjelp av Eisen Gene klynge 3.0. For de GSE9891 datasettet flere sonder per genet ble i gjennomsnitt som ligner mest på den tilnærmingen tatt av ekson arrays (dvs. sonden sett samandrag i Console-programvaren Affymetrix Expression). Deretter cellelinjen genuttrykk data og GSE9891 data (unntatt LMP prøver) var median sentrert separat for å korrigere for forskjeller mellom plattformene som brukes og deretter kombinert før hierarkisk clustering. Identifisering av biologisk funksjon av morfologi relaterte gener ble utført ved hjelp av IPA (v16542223, oppfinnsomhet Systems).
Resultater
Figur 1 gir en oppsummering av den eksperimentelle plan inkludert dyrking alle cellelinjer med samme dyrkningsforhold for å unngå skjevheter på grunn av varierende konsentrasjoner av kosttilskudd innenfor ulike medier (f.eks vekstfaktorer) eller serum.
STR kort tandem repeat, MSI mikro ustabilitet, PFS progresjonsfri overlevelse
.
Short tandem repeat (STR) analyse
Den målte antall repetisjoner for hver av de 16 STR loci samt henvisning STR profiler fra offentlige databanker og litteratur er gitt i tabell S3.
samsvar mellom toppene av referanseprofiler og profilene som genereres i denne studien var 100% for 22 cellelinjer, 90-99% for ti cellelinjer og 79-89% i fire cellelinjer. For tre cellelinjer, er det ingen referanser tilgjengelig (Tabell S3).
En cellelinje, «COLO720E», viste bare 4% samstemmighet med STR profiler publisert av Korch et al. [29]. COLO720E har blitt beskrevet til å være blandinger av de COLO684 og COLO685 cellelinjer som begge er avledet fra livmor adenokarsinom [30]. «COLO720E» hadde to TP53 mutasjoner beskrevet (c.1118del1, c.C413T), støtter muligheten for to cellepopulasjoner. Men disse to TP53 mutasjoner ble nylig rapportert av Anglesio et al. selv om deres COLO720E cellelinje tilsvarte offentlig tilgjengelig STR referanse [31]. Siden «COLO720E «har nylig blitt trukket tilbake fra ECACC cellelinje depotet, vi utelukket det fra flere data-analyser.
Origin
Den tilgjengelige litteratur informasjon om opprinnelsen til de 39 cellelinjer er oppsummert i Figur 2 (tilleggsdata i tabell S1) [32] – [53]. Tretti-tre cellelinjer ble samlet unike pasientmateriale, ikke inkludert de like kilder (SKOV3, A2780), in vitro derivater (A2780ADR, A2780CIS, COV362.4, UWB1.289 + BRCA1) og muligens forurenset cellelinje «COLO720E» . Histologi ble beskrevet for 30/33 cellelinjer og viste en tilsvarende frekvensfordeling i forhold til eggstokkene karsinomer med de fleste som serøs (21/33) (figur 2)
Morfologi
. E Epiteliale , R Round, S Spindel,
Histologi Antatte Histologi product:: S serøs, HGS høyverdig serøs, LGS lavgradig serøs, E endometrioid, C klarcellet, Mx blandet, M mucinous.
Origin
: En ascites, T svulstvev, TM vev fra metastaser, TO ovarial tumor vev, P pleuravæske.
Tid
: P primær sykdom, R residiverende sykdom, CR på klinisk resistens.
Platinum behandlet
: U ubehandlet, P platinabasert behandling, O annen kjemoterapi, R strålebehandling.
Protein markører
: rød ingen uttrykk (signal til-støy-forhold mindre enn 5), lys rød lav ekspresjon (signal til-støy-forholdet 5-20), lys grønn uttrykket (signal til-støy ratio 20-200), lys grønn høy uttrykk (signal -til-støy-forhold 200), grå ikke bestemt.
Therapy svar
: grønn til rød skala følsom for bestandig.
Dobling tid
: grønn mindre enn en dag, gule 1-2days, oransje 2 dager.
MSI
mikro ustabilitet.
Genmutasjoner
: mørkeblå identifiseres ved minst to metoder, lyseblå identifisert ved en metode, lys rød identifisert med en metode, men ikke med andre metoden.
Geneamplifikasjon
: orange forsterket (2-3x SD over medianen), rød sterkt forsterket ( 3x SD over medianen). Wnt /bCatenin sti (WNT /bCAT) og homolog rekombinasjon reparasjon (HRR) Søylene viser antall muterte gener i disse banene.
Opprinnelsen (ascites, tumor vev eller pleuravæske), tid (primær sykdom, tilbakefall, ved klinisk resistens) og om pasienten hadde fått platinumbasert kjemoterapi før kulturen ble kjent i 32, 21 og 25 cellelinjer henholdsvis. Vev-stammer cellelinjer var for det meste fra platina-naive pasienter (7/8, 88%) og primær sykdom (6/7, 86%), mens de ascites-stammer cellelinjer var oftere platina-behandlet (9/15, 60%) og kultivert etter tilbakefall eller klinisk resistens (10/12, 83%)
mikro ustabilitet
mikro ustabilitet for alle fem markører studerte ble observert for:. 2774, begge SKOV3 kilder, IGROV1, TOV21G og «COLO720E» (figur 2). A2780ADR og A2780CIS viste ustabilitet for fire av de fem markører (NR-21, BAT26, NR-24, MONO-27) og var bi-alleliske for den femte markør BAT25. I motsetning til foreldre A2780 cellelinje ECACC (også fra den europeiske cellekultur samling ECACC) viste bare mikro ustabilitet for en markør (NR-21) og var også bi-allelisk for BAT25. Den andre A2780 kilde fra en akademisk laboratorium viste ingen mikro ustabilitet (bare en liten forskyvning for NR-21), men var også bi-allel for BAT25. Dette indikerer at forskjellige kulturer av den samme cellelinje kan utvikle eller velge genetiske forskjeller som vi tidligere beskrevet for forskjellige A2780 cellelinjer [54].
Selv om tallene er meget liten, de fire MSI cellelinjene viste signifikant mindre samstemmighet av deres STR profilen til referanse STR profilen (Mann-Whitney U-test, p 0,0013) og flere mutasjoner enn de 29 ikke-MSI cellelinjer (median 13 versus to mutasjoner per cellelinje, Mann-Whitney U-test p 0,001 ).
morfologiske subtyper
Tre morfologiske fenotyper ble preget av to uavhengige observasjoner av morfologiske og vekstegenskaper under dyrking fra low-density opptil 70/80% samløpet, dvs. cellen form, celle størrelse og vekstmønster i løpet av dyrking, så vel som formeringshastigheten. Figuren viser representative S1 bilder av seks eksempler på hver av de tre undertyper morfologiske for å illustrere forskjellene i celleform, størrelse og vekstmønster mellom de morfologiske subtyper. The «Epitelial» morfologisk subtype ble preget av flate epitel-lignende celler som vokste i ark med jevne eller ujevne klynger (n = 21). I «Round» subtype (n = 7), cellestørrelsen var mindre med en rund form og høye proliferative hastighet. Cellene vokste separat eller som uregelmessige klynger, klebet løst til vevs kulturskåler og ofte vokste på toppen av hverandre. Celler med «Spindel «subtype (n = 12), ble strukket og spindel formet og vokste som separate celler eller uregelmessige klynger.
Det var en sammenheng mellom morfologi og opprinnelsen til de 33 unike cellelinjer, 74 % av Epithelial cellelinjer som stammer fra ascites (14/19), alle fire runde cellelinjer var kultur fra vevet, mens Spindel cellelinjer som stammer fra like ascites, vev eller pleural effusjon (alle 3/9, 33%) (Fishers eksakte p = 0,002). Selv om det ikke er vesentlig, Epithelial cellelinjer var oftere av serøs sted (83%) sammenlignet med rund (33%) og spindel (56%) cellelinjer (Fishers eksakte, p = 0,095).
Interessant, morfologiske subtype var signifikant assosiert med tidligere platina-basert kjemoterapi (10/14 epitelial hadde tidligere fått platinabasert behandling versus 4/4 runde og 7/7 Spindel ubehandlede linjer; Fishers eksakte test, p 0,002).
Protein markører
uttrykk for CD44, CD24, EpCAM og luminal cytokeratin-er gitt i Figur 2.
stamcelle markør CD44 ble uttrykt i 31/33 av cellelinjer og var assosiert med morfologi (Kruskal-Wallis p = 0,0037). Interessant, 6/9 Spindel cellelinjer viste høy CD44 ekspresjon i kombinasjon med fraværende CD24 ekspresjon som er blitt foreslått som en karakteristikk av stamcellepopulasjoner. I motsetning CD44
høy /CD24
-. Uttrykk ble ikke observert i de fire runde cellelinjer og i bare 6/20 epitelcelledifferensiering linjer
epiteliale markører EpCAM og luminal Cytokeratin tallet ble uttrykt i de fleste Epithelial cellelinjer (henholdsvis 19/20 og 18/20), men bare i en runde cellelinje (1/4). Alle Spindel cellelinjer viste fraværende eller svært lav uttrykk for EpCAM men 5/9 gjorde uttrykkelig luminal Cytokeratin tallet. EpCAM og luminal Cytokeratin uttrykk ble assosiert med morfologi (Kruskal-Wallis, p 0,001 og p 0,024 henholdsvis). Samt serøs versus ikke-serøs histologi (Mann-Whitney, p = 0,004 og p = 0,108 henholdsvis)
genmutasjon og forsterkning
mutasjonsstatus av 53 gener ble bestemt med tre teknikker: snapshot, solid og /eller Tam-sekv exon sekvensering. Uoverensstemmende data mellom disse tre teknikkene ble kontrollert manuelt ved hjelp av rå sekvensdata. Tabell S4 viser alle mutasjon dataene som er oppsummert i figur 2. I sum vi har oppdaget 178 mutasjoner i 45 gener i alle 39 cellelinjer. Den hyppigst muterte genet var TP53, mutert i 27/33 cellelinjer inkludert 7/8 høyverdig serøs, 9/10 serøs og uventet i 3/3 lavgradig serøs.
Vi bestemmes forsterkningen av CCNE1, MYC, TPX2 og ErbB2 ved å sammenligne sekvensering dekning for hver ekson til median total dekning [55]. Amplifikasjon ble observert for CCNE1 (n = 5), MYC (n = 3), TPX2 (n = 3) og ErbB2 (n = 2) (figur 2, Figur S2A-C). Når vi sammenlignet genom-amplifikasjon av hvert gen med mRNA-ekspresjon, ble MYC og TPX2 høyt uttrykt i de fleste av cellelinjene, inkludert linjer som viste forsterkning (data ikke vist). Cellelinjene viser
ErbB2
eller
CCNE1
forsterkning viste det høyeste uttrykk for disse genene. For
CCNE1
denne foreningen var signifikant (Mann-Whitney p 0,001, figur S2D).
Response to kjemoterapeutika
For alle rusmidler, konsentrasjonen forårsaker 50% veksthemming (GI50-verdier) viste et to-log område mellom sensitive og resistente cellelinjer (figur 3). Spesielt, median GI50 verdier (nm) viste klare forskjeller mellom legemidler med de mest separert forbindelser, Docetaxel og karboplatin, har en 10 000-fold forskjell (figur 3).
De Linjene utvides til 1,5 ganger høyden på boksen (dvs. 25
th persentil til median og median 75
th persentil) eller, hvis det ikke er noen verdi i dette området, til minimum eller maksimumsverdier
.
kimcellelinje mutasjoner i
BRCA1 Hotell og
BRCA2
har vært forbundet med svar på platina narkotika. Men det var ingen klar sammenheng mellom respons til platina og mutasjonsstatus eller uttrykk for
BRCA1 Hotell og
BRCA2
i våre eksperimenter (data ikke vist). Omtrent 50% av BRCA mutasjoner observert var ikke kjent for å være klinisk relevant (tabell S4), og derfor ikke kan påvirke BRCA funksjon. Men de to cellelinjer med kjente bakterie linjer mutasjoner i BRCA1 (UWB1.289) og BRCA2 (PEO1) var relativt følsom for Cisplatin.
Responsen for alle legemidler viste en signifikant positiv sammenheng med spredning rente av cellelinjene, dvs. dobling tid (tabell 1).
Tabell 1 viser sammenhengen mellom narkotika respons og uttrykk for proteinmarkører CD44, CD24, EpCAM og Luminal cytokeratin menn. Interessant, cellelinjer med en høy CD44 ekspresjon var mer følsomme for taxaner. I motsetning til cellelinjer som viser høy ekspresjon av luminal cytokeratin er relativt resistente mot de tre platina stoffene som ble testet, og doxorubicin. Høy uttrykk for EpCAM ble også korrelert med relativ motstand mot Cisplatin. Luminal cytokeratin og EpCAM er sterkt korrelert og fraværende uttrykk for begge merkene ble mest sett i Round cellelinjer som var generelt svært følsomme for de fleste behandlingsformer. Hvis de fire runde cellelinjer er utelukket, observerte den eneste signifikant sammenheng var mellom oksaliplatin respons og uttrykk for luminal cytokeratin-tallet, noe som indikerer at denne lille gruppen av cellelinjer er i hovedsak gir andre assosiasjoner.
neste brukt Spearman rank korrelasjon for å teste for korrelasjon mellom GI50-verdier og uttrykk for hver mRNA eller mikroRNA for å identifisere gener og microRNAs forbundet med respons på behandling. Antallet av mRNA forbundet med respons til de åtte terapeutika som ble testet varierte fra 22-310 gener (p 0,001) og 1-10 microRNAs (p 0,01). Figur 4 viser for hver mRNA og mikroRNA sammenhengen og betydningen mellom sitt uttrykk og respons på Cisplatin og paclitaxel.
X-akser Spearman korrelasjon, Y-akser -Logg av p-verdien.
antatte histologiske subtyper
Vi utpekt cellelinjer som antatt HGS eller endometrioid /klare celle cellelinjer basert på fire kriterier. Kriterier for den antatte HGS opprinnelse var: 1) HGS opprinnelse med TP53-mutasjon og ingen MSI, eller 2) serøs opprinnelse med TP53 mutasjon og forsterkning av CCNE1, MYC eller TPX2. Kriterier for antatte endometrioid /klarcellet opprinnelse var:. 1) endometrioid og /eller klarcellet opprinnelse, eller 2) ARID1A mutasjon
Ved hjelp av disse kriteriene, vi utledet den antatte histologisk subtype for de 39 cellelinjer som 20 ikke -serous (figur 2, siste kolonne gruppe 1 2). og 19 serøs cellelinjer som omfattet 14 høyverdig serøs og en lav grad av serøs linjen (figur 2, siste kolonne gruppe 3-5)
fra de ikke-serøs cellelinjer, en gruppe (se også figur 2), inneholder ti cellelinjer som ble beskrevet til å være ikke-serøs og bare i COV362 og 59 M, motsier dette en MYC forsterkning. [11]. [11].
