Abstract
Bakgrunn
Annexins er kalsium og fosfolipid bindende proteiner som danner et evolusjonært konservert multigen familien. Betydelig bevis indikerer at annexin A10 (ANXA10) er involvert i tumorprogresjon, men lite er kjent om sin rolle i menneskelig oral karsinogenese. I denne studien undersøkte vi involvering av ANXA10 i muntlig plateepitelkarsinom (OSCC).
Metodikk /hovedfunnene
ANXA10 mRNA og proteinuttrykk ble vurdert ved kvantitativ revers transkriptase polymerase chain reaction og immunoblotting, og vi gjennomførte en spredning analyse og cellesyklus analyse ANXA10 knockdown celler
in vitro
. Vi har evaluert sammenhengen mellom ANXA10 uttrykk status i 100 primær OSCCs og clinicopathological funksjoner ved immunhistokjemi. ANXA10 mRNA og protein uttrykk nivåer var oppregulert i alle mobiltelefonlinjer undersøkt (n = 7,
p
0,05). ANXA10 knockdown-celler viste at cellulær proliferering redusert ved inaktivering av ekstracellulær regulert kinase (ERK) (
p
0,05), og cellesyklus-stans i G1 fase var et resultat av oppregulering av cyklin-avhengige kinase-inhibitorer . ANXA10 protein uttrykk i primær OSCCs var også betydelig større enn i vanlige kolleger (
p
0,05)., Og høyere uttrykk ble korrelert med tumorstørrelse (
p
= 0,027)
Konklusjon /Betydning
Våre resultater er foreslått for første gang at ANXA10 er en indikator på mobilnettet spredning i OSCCs. Våre resultater antydet at ANXA10 uttrykk kan tyde cellulær proliferasjon og ANXA10 kan være en potensiell terapeutisk mål for utvikling av nye behandlingsmetoder for OSCCs
Citation. Shimizu T, Kasamatsu A, Yamamoto A, Koike K, Ishige S, Tori H, et al. (2012) Annexin A10 i Human Oral Cancer: biomarkør for tumorvekst via G1 /S Transition av Targeting MAPK signalveier. PLoS ONE 7 (9): e45510. doi: 10,1371 /journal.pone.0045510
Redaktør: Qiming Jane Wang, University of Pittsburgh School of Medicine, USA
mottatt: 23. mars 2012; Akseptert: 21. august 2012; Publisert: 17.09.2012
Copyright: © Shimizu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Annexins er kalsium og fosfolipid bindende proteiner som danner en evolusjonære konservert multigen familien. Feilregulering av Annexin familiemedlemmer har blitt rapportert i en rekke kreftformer og påvirker mønstre av cellulære atferd, for eksempel spredning, invasivitet, og kreft-relaterte signalveier, noe som tyder på at annexins kan spille en viktig rolle i tumorutvikling og progresjon [1] – [10] . Annexin A10 (ANXA10), en overuttrykt gen i den muntlige plateepitelkarsinom (OSCC) avledede cellelinjer i våre tidligere microarray data [11], har vært innblandet i cellular funksjon i endocytose og eksocytose; antikoagulerende aktivitet; interaksjon med cytoskjelettet; Differensiering; og cellulær proliferasjon [12], [13]; og relevansen for malignitet i Barretts øsofagus, magekreft, og blærekreft [14] -. [16]
Spredning av humane kreftceller er i stor grad styrt i G1 fasen av cellesyklusen. Den mitogen-aktivert protein kinase (MAPK) signalkaskader har dukket opp som viktige aktører i spredning i ulike kreftceller [17]. Tidligere studier har rapportert at flere annexins spesielt modulere ekstracellulære regulert kinase (ERK) /MAPK signalkaskade oppstrøms [18], [19]. ERK-aktivering spiller en fundamental rolle i G1 /S overgang [20], [21]. Medlemmer av cyclin
–
avhengig kinase (CDK) samspill protein /kinase hemmende protein (Cip /Kip) familie bind til cyclin-CDK-komplekser og hemme deres aktiviteter, som fører til G1 celle-syklus arrest. Cyclin D1, cyclin E, p21
Kip1, og p27
Kip1 nivåene påvirkes av flere signalveier inkludert ERK /MAPK signalveien [22] – [25]. Men de molekylære mekanismer som ANXA10 modulerer disse cellulære responser er ikke fullstendig klarlagt i OSCCs.
Vi rapporterer resultatene av en omfattende analyse av avvikende uttrykk for ANXA10 i OSCCs som er funksjonelt og klinisk knyttet til tumorprogresjon .
Resultater
Evaluering av ANXA10 mRNA og protein uttrykk i OSCC-avledet cellulære linjer
for å undersøke uttrykket status for ANXA10 identifisert som en kreft-relaterte genet ved vår forrige microarray data [11], vi utførte kvantitativ real-time revers transkripsjon-PCR (QRT-PCR) og immunoblotting analyser ved hjelp av syv OSCC-avledet cellulære linjer og humane normale orale keratinocytter (HNOKs). ANXA10 mRNA og protein uttrykk status var signifikant oppregulert i alle OSCC cellulære linjer sammenlignet med i HNOKs (Figur 1A, B; *
p
0,05). Expression analyse indikerte at både transkripsjon og oversettelse produkter av dette molekylet ble sterkt uttrykt i OSCC-avledet cellulære linjer.
(A) Kvantifisering av
ANXA10
mRNA nivåer i OSCC-avledet cellulære linjer ved QRT -PCR analyse. Betydelig oppregulering av
ANXA10
mRNA er sett i de syv OSCC-avledet cellulære linjer sammenlignet med i HNOKs. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av verdier fra tre analysene (*
p
0,05, Mann-Whitney U-test). (B) Immunoblotting analyse av ANXA10 protein i OSCC-avledede cellelinjer og HNOKs. ANXA10 protein uttrykk (molekylvekt, 37 kDa) er oppregulert i OSCC-avledet cellulære linjer sammenlignet med i HNOKs. Densitometrisk ANXA10 protein data er normalisert til a-tubulin protein nivåer. Verdiene er uttrykt som en prosentandel av HNOKs.
Etablering av ANXA10 knockdown celler
Siden ANXA10 uttrykk var oppregulert i OSCC cellulære linjer, antok vi at ANXA10 kan spille en viktig rolle i OSCCs. For å vurdere ANXA10 funksjoner
in vitro
, en shRNA Forsøket ble utført ved hjelp av SA3 og Ho-1-u-1 celler. Uttrykk for ANXA10 mRNA og protein i de shANXA10-transfekterte celler var signifikant lavere enn i de shMock-transfekterte celler (Sa3 og Ho-1-u-en-avledet transfektant-celler, figur 2A, B; *
p
. 0,05)
(A) QRT-PCR viser at ANXA10 mRNA uttrykk i shANXA10-transfekterte celler (Sa3- og Ho-1-u-1-stammer transfektanter, 2 kloner hver) er betydelig lavere enn i de shMock-transfekterte celler (*
p
0,05, Mann-Whitney U-test). (B) Immunoblotting analyse viser at ANXA10 proteinnivåer i shANXA10-transfekterte celler (Sa3- og ho-1-u-en-avledede transfektanter, 2 kloner hver) også er betydelig redusert sammenlignet med den i shMock-transfekterte celler
Funksjonelle analyser av ANXA10 knockdown celler
for å evaluere effekten av ANXA10 knockdown på cellevekst, utførte vi en celleproliferasjonstest. Transfektert med ANXA10 shRNA (shANXA10) – og styre shRNA (shMock) -transfected celler ble sådd ut i seks-brønns plater ved en tetthet på 1 x 10
4 levedyktige celler /brønn telles på 7 påfølgende dager. Det var en signifikant reduksjon i cellevekst av de shANXA10-transfekterte celler sammenliknet med de shMock-transfekterte celler (SA3 eller Ho-1-u-en-avledede transfektant-celler, figur 3; *
p
0,05 ).
for å bestemme effekten av shANXA10 på cellulær proliferasjon, blir shANXA10- og shMock-transfekterte celler sådd ut i 6-brønns plater ved en tetthet på 1 x 10
4 levedyktige celler /brønn. Begge transfektanter ble talt på 7 dager på rad. Celleveksten av shANXA10-transfekterte celler (Sa3- og ho-1-u-en-avledede transfektanter, 2 kloner hver) er signifikant hemmet sammenlignet med shMock-transfekterte celler etter 7 dager (168 timer). Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av verdier fra tre analysene. Stjernene indikerer signifikante forskjeller mellom shANXA10- og shMock-transfekterte celler (*
p
0,05, Mann-Whitney U-test).
For å undersøke en potensiell underliggende mekanisme som ville forklare redusert celleproliferasjon i shANXA10-transfekterte celler, vurdert vi ERK trasé, som ofte oppregulert i livmor og andre kreftformer [26] – [29]. Fosforylert ERK (perk) protein sunket betraktelig i shANXA10-transfekterte celler sammenlignet med shMock-transfekterte celler (figur 4). Disse resultatene antydet at ERK-signalveien er ofte svekkes i shANXA10-transfekterte celler.
ANXA10 knockdown fører til redusert nivå av fosforylert ERK (Perk) sammenlignet med de shMock-transfekterte celler (Sa3- og Ho-1-u -1-avledet transfektanter, 2 kloner hver); ERK nivået er uendret. Densitometrisk Perk /ERK protein data er normalisert til a-tubulin protein nivåer.
For å undersøke mekanismene for cellesyklusprogresjon i shANXA10-transfekterte celler, vi utførte flowcytometrisk analyse av shANXA10-transfekterte celler. Prosentandelen av G1 fase i shANXA10-transfekterte celler var signifikant (
p
0,05) høyere enn i mock-transfekterte celler (figur 5A, B). Vi vurderte også uttrykk nivået av cyclin-avhengig kinase hemmere (CDKIs: p21
Cip1 og p27
Kip1), cyclin D1, cyclin E, CDK2, CDK4 og CDK6. Som forventet, mens CDKIs var oppregulert, ble en betydelig nedregulering av cyclin D1, cyklin E, CDK2, CDK4, CDK6 og detektert i shANXA10-transfekterte celler (figur 5C). Resultatene indikerte at nedregulering av ANXA10 hemmet celleproliferasjon ved å arrestere G1 fasen.
For å undersøke cellesyklusprogresjon, vi analysert flowcytometrisk bestemmelse av DNA innhold av en FACSCalibur i G0-G1, S, og G2-M-faser. Vi har fastslått at ekspresjonsnivået av CDKIs (p21
Cip1and p27
Kip1), cyklin D1, cyklin E, CDK2, CDK4, CDK6 og for å identifisere den mekanismen som ANXA10 inhiberer celle-syklusprogresjon i G1 fase. (A) Etter synkronisering ved G0 /G1 fase med fratatt serum, ble flowcytometrisk analyse utført for å undersøke cellesyklus i shANXA10- og shMock-transfekterte celler. Andelen av G1 fase i shANXA10-transfekterte celler (Sa3- og Ho-1-u-1-stammer transfektanter, 2 kloner hver) har økt markert sammenlignet med modell transfekterte celler (
p
0,05, Mann-Whitneys
U
test). (C) Immunoblotting analyse viser oppregulering av p21
Cip1and p27
Kip1 og nedregulering av cyclin D1, cyklin E, CDK2, CDK4, CDK6 og i shANXA10-transfekterte celler (Sa3- og Ho-1 -U-1-stammer transfektanter;. 2 kloner hver) sammenlignet med de shMock-transfekterte celler
Evaluering av ANXA10 uttrykk i grunnskolen OSCCs
representant immunhistokjemi (IHC) resultater for ANXA10 -protein i normal oralt vev og primære OSCC er vist i figur 6A-D. De ANXA10 IHC score til cytoplasma av primære OSCCs var signifikant (figur 6E; *
p
0,001) høyere enn i normalt vev, der IHC score til normale orale vev og OSCCs varierte 27,5 til 132,4 (median 93,5) og 60,5 til 230,4 (median, 150,6), henholdsvis. Tabell 1 viser korrelasjoner mellom clinicopathologic kjennetegn ved pasientene med OSCC og status for ANXA10 protein uttrykk ved hjelp av IHC scoring system. Blant de kliniske klassifikasjoner, ble ANXA10-positive OSCCs korrelert med tumorstørrelse (
p
= 0,027) og TNM stadium av OSCCs (
p
= 0,041).
representant IHC resultater for ANXA10 protein i normal oral vev (A, B) og primær OSCC (C, D) (A, C) Original forstørrelse, × 100. Skala barer, 50 mikrometer. (B, D) Original forstørrelse × 400. Skala barer, 10 mikrometer). Sterk ANXA10 immunoreaktivitets er oppdaget i primær OSCCs; normale orale vev viser nesten negativ farging. (E) Delstaten ANXA10 protein uttrykk i primær OSCCs (n = 100) og de vanlige kolleger. De ANXA10 IHC score er beregnet som følger: IHC poengsum = 1 x (antall svakt fargede celler i felten) + 2 x (antall moderat fargede celler i felten) + 3 x (antall intenst fargede celler i feltet) . De ANXA10 IHC score for normale orale vev og OSCCs varierte 27,5 til 132,4 (median, 93,5) og 60,5 til 230,4 (median, 150,6), henholdsvis. ANXA10 protein uttrykk nivåer i OSCCs er signifikant (*
p
0,001, Mann-Whitneys
U
test). Høyere enn hos normale muntlige vev
diskusjon
i denne studien, ANXA10 ble ofte overuttrykt i OSCC-avledet cellulære linjer, og nedregulering førte til redusert celleproliferasjon ved inaktivering av ERK. Analysen celle-syklus viste også at G1 arrest skjedde i ANXA10 knockdown cellene gjennom redusert CDKI (p21
Cip1 og p27
Kip1) uttrykk. I tillegg ANXA10 var ofte oppregulert i grunnskolen OSCCs og høyere ANXA10 uttrykk ble assosiert med tumorstørrelse (
p
= 0,027). Disse resultatene indikerte at ANXA10 er knyttet til regulering av cellesyklusen i G1 fase og spiller en viktig rolle i tumorprogresjon i OSCCs.
Etter oral karsinogenese og andre krefttyper antas å være flertrinnsprosesser som involverer progressiv avbrudd av epitelcelleproliferasjon, mekanismer for cellulær proliferasjon i tumorceller er et viktig fagområde for tumorbehandling og molekylær kreft biologi [30], [31]. Annexins, inkludert ANXA10, har spilt viktige roller i tumor utvikling og progresjon [14] – [16], [18], [19]. Imidlertid har ingen direkte bevis vist at ANXA10 er nødvendig for cellulær proliferasjon. For å bestemme hvorvidt ANXA10 funksjon er relevant for OSCC progresjon, utførte vi funksjonelle studier ved bruk av shRNA og funnet at undertrykkelse av ANXA10 betydelig redusert cellulær proliferering som et resultat av inhibert MAPK signalveien med nedregulering av Perk. ERK /MAPK-signalveien er relatert til mange cellulære prosesser, for eksempel proliferasjon, differensiering, homeostasis, og mobilnettet overlevelse [17], [32]. Aktivering av ERK /MAPK-signalveien fremmer unormal cellevekst og tumordannelse i flere typer av tumorer. Våre funn indikerte at ANXA10 ekspresjon var relevant for fosforylering av ERK og aktivering av ERK /MAPK-signalveien. Den ERK /MAPK veien er strengt kontrollert av mekanismer ekstracellulære signaler. Dette omfatter kontroll av intracellulær Ca
2 + konsentrasjoner, for derved å muliggjøre Ca
2+ å tjene som en andre budbringer [33]. Ca
2 + -effector proteiner kan megle cellulære responser på endringer i intracellulær Ca
2 + nivåer. Annexins, en familie av slike svært konservert Ca
2 + -regulated proteiner, er preget av sin evne til å binde seg til fosfolipider i en Ca
2 + -avhengig måte og de fleste annexin funksjoner er knyttet til deres evne til å samhandle med cellemembraner i en regulert måte, [12], [13]. Basert på disse bevisene kombinert med våre resultater, foreslår vi at ANXA10 kan påvirke intracellulære Ca
2 + homeostase og direkte eller indirekte kommuniserer med aktivering av ERK /MAPK signalveier.
I tillegg til MAPK signal vei, OSCC celler med shANXA10 viste cellesyklus-stans i G1 fase med oppregulering av p21
Cip1 og p27
Kip1 og nedregulering av cyclin D1 og cyklin E. de to siste er også viktige regulatorer av G1 progresjon og G1-S overgang. Inhibering av deres ekspresjon blokker G1-S-overgang i cellesyklusen. Virksomheten til cyclin-CDK-komplekser moduleres av to typer CDKIs, Cip /Kip (p21
Cip1and p27
Kip1), som regulerer cellesyklusprogresjon. Medlemmer av Cip /Kip familie bind til cyclin-CDK komplekser og hemme deres virksomhet, noe som fører til G1 celle-syklus arrest. Cyclin D1, cyclin E, p21
Kip1, og p27
Kip1 nivåene påvirkes av flere signalveier inkludert ERK /MAPK signalveien [25], [34]. Cyclin D1 og cyclin E er ofte oppregulert i kreft hos mennesker [35], [36]. Mekanismen for aktivering av ERK i ikke-adherente fibroblaster er blitt rapportert å påvirke cyklin D1 [37]. I andre rapporter, aktivering av ERK fører til oppregulering av cyclin D1 [38]. Den CDKIs, p21
Kip1 og p27
Kip1, er ofte nedregulert i kreft hos mennesker [39], [40]. Mekanismen for ERK regulering av p21
Kip1 og p27
Kip1 fortsatt uklart. ERK kan direkte phosphorylate p21
Kip1 og p27
Kip1 [41] – [43]. Disse data antydet at ANXA10 aktiverer MAPK signalveien ved å fosforylere ERK og fremmer G1 cellesyklus ved nedregule CDKIs i OSCC progresjon.
Hittil uttrykk for ANXA10 i OSCC vev og dens korrelasjon til clinicopathological funksjoner Det er ikke klarlagt. I vår studie, selv om de positive tallene for ANXA10 i tidlig stadium svulster var betydelig lav, de positive priser i avanserte-tumorer ble betydelig økt; Dette antyder sterkt at ANXA10 kan spille en viktig rolle i progresjon av kreft. Gitt at ANXA10 overekspresjon kan forutsi malignitet, pasientutvelgelse av ANXA10 status kan gi en mer personlig tilnærming til menneskelig oral kreftbehandling.
I konklusjonen, våre resultater indikerte at ANXA10 er overuttrykt ofte i OSCCs og at dette overekspresjon kan være forbundet med tumorprogresjon ved å fremme cellesyklusprogresjon i G1 fase gjennom aktivering av ERK /MAPK-signalveien, noe som fører til redusert ekspresjon av CDKIs. Mens videre studier er nødvendig for å studere interaksjonen av ANXA10 og ERK /MAPK-signalreaksjonsveien Disse data antydet at ANXA10 spiller en viktig rolle i cellulær proliferasjon og uttrykk er sannsynlig å være en biomarkør av progresjon og et potensielt terapeutisk mål for utvikling av anticancer legemidler i primær OSCCs.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
studien protokollen ble godkjent av etisk komité Graduate School of Medicine, Chiba University (The godkjenningsnummer, 236) og ble utført i samsvar med de etiske normer nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Skriftlig informert samtykke ble mottatt fra alle pasienter.
OSCC cellulære linjer og vevsprøver
Den menneskelige OSCC cellulære linjer (HSC-2, HSC-3, HSC-4, KON, Ho-en -U-en, og Ca9-22) ble kjøpt fra human Science Research Resources Bank, Osaka, Japan. Sa3 ble vennlig levert av Dr. S. Fujita ved Wakayama Medical University, Wakayama, Japan [44]. Primære dyrkede HNOKs fungert som normale kontroller [45] – [49]. Alle celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium /F-12 HAM (Sigma, St. Louis, MO, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (Sigma) og 50 enheter /ml penicillin og streptomycin (Sigma) i en fuktet 5 % CO
2 /luft atmosfære ved 37 ° C.
Ett hundre par av primær OSCC prøver og tilsvarende normale muntlige epitelvev ble oppnådd under operasjoner ved Chiba universitetssykehus, Chiba, Japan. Alle pasienter gitt informert samtykke til bruk av protokollen, som den institusjonelle gjennomgang styret i Chiba Universitetet gjennomgått og godkjent. De resekterte Vevene ble delt i to deler; en ble frosset umiddelbart og lagret ved -80 ° C til RNA isolering, og den andre ble fiksert i 20% bufret formaldehyd-oppløsning for patologisk diagnose og IHC. Histopatologisk diagnose av hver vev ble utført i henhold til Verdens helseorganisasjon kriterier ved Avdeling for patologi, Chiba universitetssykehus. Clinicopathological iscenesettelse ble bestemt i henhold til svulsten-node-metastaser klassifisering av International Union mot kreft. Alle OSCC prøvene ble bekreftet histologisk og sjekket for å sikre tilstedeværelse av tumor i mer enn 80% av prøvene.
Kvantitativ sanntid revers transkripsjon-PCR
Total RNA ble isolert ved hjelp Trizol Reagens ( Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA ble generert fra 5 mikrogram total RNA ved hjelp av Ready-To-Go You-Prime First-Strand Perler (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) og oligo (dT) primer (Hokkaido System Science, Sapporo, Japan) i henhold til produsentens instruksjoner . QRT-PCR ble utført for å behandle uttrykket nivået av
ANXA10
mRNA i OSCC-avledet cellulære linjer og HNOKs. Uttrykket nivåer ble bestemt ved hjelp av primere og prober som ble laget ved hjelp av Universal Probe Library (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) etter produsentens anbefalinger. Primersekvensene brukes for QRT-PCR var:
ANXA10
, frem 5’GCATCCATTATGGGATTGAAA-3 «, reverse 5’CAAAATGTTTTGTGGAGACTATGTG-3», og universell probe # 24. All QRT-PCR ble utført ved hjelp av en LightCycler® 480 PCR system (Roche). Amplifikasjoner ble initiert av en 10-minutters preinkubering ved 95 ° C, etterfulgt av 45 sykluser på 10 sek ved 95 ° C i malen denaturering, 30 sekunder ved 55 ° C i primer-annealing /utvidelse og avkjøling i 30 sekunder ved 40 ° C. Utskriften beløp for
ANXA10
ble beregnet fra de respektive standardkurver og normalisert til
glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase product: (
GAPDH
) (forover 5′-CATCTCTGCCCCCTCTGCTGA -3’cell, reverse 5′-GGATGACCTTGCCCACAGCCT-3 «, og universell probe # 60) avskrift beløp fastsatt i tilsvarende prøver.
Immunoblotting analyse
cellene ble vasket to ganger med kald fosfat- bufret saltløsning (PBS) og kort sentrifugert. De cellulære Pelletene ble inkubert ved 4 ° C i 30 minutter i en lyseringsbuffer (7 M urea, 2 M tiourea, 4% vekt /volum CHAPS og 10 mM tris [pH 7,4]) med proteinase inhibitor cocktail (Roche). Proteinkonsentrasjonen ble målt med et Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Proteinekstrakter (20 pg) ble separert ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese i 4-12% gel, overført til nitrocellulosemembraner, og blokkert i en time ved romtemperatur i Blocking One (Nacalai Tesque, Tokyo, Japan). Membranene ble inkubert med kanin anti-ANXA10 polyklonale antistoff (Abnova, Taipei, Taiwan), mus anti-
α
-tubulin monoklonalt antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA. USA), mus anti-ERK 1/2 monoklonalt antistoff (R 2+, moderat; og 3+, intense. Mobiltelefonnumre og fargeintensitet ble deretter multiplisert for å produsere den ANXA10 IHC poengsum. Saker med en ANXA10 IHC poengsum overstiger 132,0 (3 standardavvik (SD) Fordeling av normalt vev) ble definert som ANXA10-positive. De ± 3 SD cutoff, som statistisk er bare 0,2% av målingen og er forventet å falle utenfor dette området, ble brukt fordi det var ikke til å bli påvirket av en tilfeldig eksperimentelle feil som produseres av prøven manipulering [56]. To uavhengige patologer, ingen av dem hadde kjennskap til pasientens kliniske status, gjort disse dommene.
Statistisk analyse
Betydningen av ANXA10 uttrykk nivåer ble evaluert med Fishers eksakte test eller Mann -Whitney U test.
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (SEM).
Takk
Vi takker Ms. Lynda C Charters for redigering av dette manuskriptet.
