Abstract
Bakgrunn
Twist2 har vist seg å fremme menneskelig svulst invasjon som i brystkreft og livmorhalskreft. Men om Twist2 fremmer menneskelig eggstokkreft progresjon er ikke avklart. Her undersøker vi hvilken rolle Twist2 i eggstokkreft invasjon og metastasering samt de underliggende molekylære mekanismene.
Metoder
Twist2 uttrykk ble oppdaget av Immunohistochemistry (IHC) på vevet microarray av menneskelig eggstokkreft kreftformer med bedømmelse i henhold til fargeintensitet og mønster. Twist2 genet ble stabilt innført i Skov-3 eggstokkreft celler for å undersøke endringer av cellulær morfologi, motilitet, invasivitet og EMT molekylære markører.
Resultater
Twist2 uttrykk er betydelig økt i eggstokkreft sammen med FIGO stadium av sykdommen, noe som indikerer at Twist2 kan være forbundet med ovarian cancer metastase. Overekspresjon av Twist2 indusert EMT fenotype inkludert nedregulering av E-cadherin og oppregulering av N-cadherin og β-catenin i humane eggstokkreft celler, noe som tyder på at Twist2 kan fremme β-catenin utgivelse fra E-cadherin /β-catenin komplekse gjennom inhibering av E-cadherin. Således ble β-catenin nedbrytning inhiberes grunn av hemming av APC, og Wnt /β-catenin veien ble deretter aktivert ved kjerne β-catenin opphopning, som kan aktivere transkripsjonen av nedstrøms målgener for å fremme tumorinvasjon og metastase. Sammen er disse dataene indikerte at β-catenin er involvert i Twist2-indusert EMT i eggstokkreft.
Konklusjon
Våre data indikerer at oppregulering av Twist2 er korrelert med FIGO stadium i menneskelig eggstokkreft . I denne rapporten viste vi at kjernefysisk β-catenin er akkumulert i Twist2-indusert EMT celler for å letter eggstokkreft invasjon og metastase
Citation. Mao Y, Xu J, Li Z, Zhang N, Yin H, Liu Z (2013) The Role of Nuclear β-catenin Opphopning i Twist2-Induced Eggstokkreft EMT. PLoS ONE 8 (11): e78200. doi: 10,1371 /journal.pone.0078200
Redaktør: Mechthild Hatzfeld, Martin-Luther-universitetet Halle, Tyskland
mottatt: 15 januar 2013; Godkjent: 10 september 2013; Publisert: 11.11.2013
Copyright: © 2013 Mao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (https://www.nsfc.gov.cn, nr 30872515, YB Mao) og grunnleggende forskning Midler til de sentrale universitetene i Kina (nr 2011121062, YB Mao), og Foundation Natural Science of Fujian-provinsen i Kina (No. 2012J01417, YB Mao). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
til tross for nylige fremskritt i forståelsen av eggstokkreft utvikling og progresjon, forblir eggstokkreft har høyest forbundet dødeligheten av gynekologiske kreftformen hos hovedsakelig vestlige land på grunn av avansert stadium av sykdommen ved diagnose (trinn III-IV) . De aller fleste kvinner er diagnostisert med disseminert intraperitoneal karsinomatose [1], [2]. Nyere litteratur tyder på at den epiteliale til mesenchymal overgang (EMT) spiller en avgjørende rolle i utviklingen av ovariekarsinomer [3], [4]. EMT er definert av en kompleks molekylær og cellulær program ved hvilken epitelceller mister sine differensierte egenskaper som celle-celle-adhesjon, apikale-basal polaritet, manglende celle motilitet og forsterkning av mesenchymale funksjoner, inkludert motilitet, invasivitet og økt resistens mot apoptose [5 ]. De tilsvarende celle ombygging og signalnettverk ser ut til å være aktiv under kreft metastase [6], [7]. Det har vært antydet at primær EOC kan gjennomgå en EMT prosess under lokal invasjon i bukhule og beholde mesenchymale funksjoner i avanserte svulster.
transkripsjonsfaktorer av Twist familien (Twist1, Twist2), snegl familie (SNAI1 /snegle , SNAI2 /slug), så vel som ZEB- familie (ZEB1, ZEB2), å få tak i EMT prosessen i kreft [5], [8], [9]. Twist2 har vist seg å fremme tumorprogresjon gjennom EMT i brystkreft [10]. Twist2 er en potensiell prognostisk markør for livmorhalskreft [11], adenoid cystisk karsinom [12], og tungen plateepitelkarsinom [13]. Twist2 er også korrelert med dårlig differensiering klasse og kort overlevelse i hodet og nakke plateepitelkarsinom [14]. Men om Twist2 fremmer menneskelig eggstokkreft progresjon er fortsatt dårlig forstått. Her undersøker vi hvilken rolle Twist2 i kreft progresjon eggstokkreft og de potensielle molekylære mekanismene bak Twist2-indusert kreft invasjon og metastasering. Vi viste Twist2 er sterkt uttrykt i eggstokkreft vev. Ektopisk uttrykk for Twist2 i eggstokkreft celler overfører en EMT fenotype. Videre kan β-catenin aktivering delta i disse Twist2 indusert EMT egenskaper.
Resultater
1. Økt Twist2 uttrykk ble korrelert med FIGO stadium i grunnskolen eggstokkreft
IHC analyser indikerte tilstedeværelsen av høye nivåer av Twist2 i kreftceller i primær ovarietumorer på vev array (figur 1). Twist2 ekspresjon ble betydelig økt i ovarian cancer (70,24%, 59 i 84 tilfeller) i forhold til det normale eggstokk-vev (P 0,05, figur 1, tabell 1). Den positive farging av Twist2 ble påvist både i kjernen og cytoplasma.
Tissue deler av eggstokkene karsinomer og normale eggstokker ble analysert ved IHC farging med et spesifikt monoklonalt antistoff mot humant Twist2. Den positive farging av Twist2 ble vist i brun farge. Seksjonene ble kontra med hemotoxylin vise kjerner. Representative bilder av Twist2 flekker i sammenkoblede normale eggstokk og epitelovarialcancer karsinomer vises. Ingen uttrykk for Twist2 kunne vært hos normale voksne eggstokk vev, mens positive uttrykk for Twist2 var hovedsakelig lokalisert i cytoplasma eller kjernen av serøs adenokarsinom og mucinous adenokarsinom ovarietumorceller. Magnitude × 200, × 400.
Ifølge histologiske typen klassifikasjon, ble sterkt uttrykk av Twist2 funnet i 19 av 69 serøs karsinom (27,54%), 1 av 8 mucinkjertler karsinom (12,5% ), ingen av 4 endometriod karsinom (0%), og to av fem Clear cellekreft (40%). Ingen signifikant forskjell kunne påvises i forskjellige tumor histologisk type (P 0,05). Ekspresjon av Twist2 ble økt sammen med FIGO trinnet (P 0,05), eksemplifisert som følger: 22,73% ved trinn I (10 i 44 tilfeller), mens 53,85% ved trinn IV (7 i 13 tilfeller). Totalt, på scenen jeg, 31,82% (14/44) tilfeller viste Twist2 negative uttrykk, 45,45% (20/44) tilfeller viste svak uttrykk, og 22,73% (10/44) tilfeller vises sterkt uttrykk; på scenen II, Twist2 negative 7,69% (1/13); svake uttrykk: 61,54% (8/13), og sterk positiv: 30,77% (4/13); på scenen III, Twist2 negative uttrykk: 57,14% (8/14), svak uttrykk: 35,71% (5/14), og sterkt uttrykk: 7,14% (1/14); på scenen IV, negative uttrykk: 15,38% (2/13), svak uttrykk: 30,77% (4/13), sterkt uttrykk. 53.85% (7/13)
Disse dataene viste at Twist2 protein er betydelig økt i eggstokkreft vev og det høye nivået av Twist2 ble korrelert med FIGO stadium av sykdommen, noe som antyder at Twist2 kan benyttes som en indikator på høy grad av malignitet og dårlig prognose i humane eggstokkreft. Men det er ingen sammenheng mellom Twist2 uttrykk og svulsten histologisk type.
2. Twist2 uttrykk påvirket cellemorfologi men ikke cellen spredning av Skov-3 celler
in vitro
For å verifisere om Twist2 er en viktig formidler av eggstokkreft, progresjon, etablerte vi cellelinjer stabilt overekspresjon Twist2 (fig. 2A). Vi deretter analysert Twist2 /Skov-3 celler og deres foreldre celler gjennom celle morfologisk observasjon, flowcytometri (FCM), og MTT analysen.
A. Ektopisk uttrykk for the Flag-taggedTwist2 i Skov-3 (Twist2 /Skov-3) eggstokkreft celler ble verifisert av Western blot. Twist2 /Skov-3 celler uttrykte både Twist2 og flagg-tag sammenlignet med vektorkontrollceller. B. Twist2 farging ble observert ved hjelp av laser scanning konfokal mikroskopi (Olympus) i SKOV-3-celler. Kjerner ble kontra med DAPI (i blått). Immunofluorescent farging av Twist2 i Twist2 /Skov-3 celler som viser celler med Twist2 (i grønt) i cellekjerner sammenlignet med vektorkontroll Skov-3 celler. Cellene var fra stabilt transfekterte prøvene. C. Celle morfologiske former ble observert ved hjelp av fasemikroskopi (Olympus). Twist2 /Skov-3 celler tok på fibroblast-lignende morfologisk form, mens Vector /Skov-3 kontrollceller dukket epitelceller form.
I den innledende karakterisering av disse cellene, observerte vi en tydelig morfologisk endring i cellene som overuttrykker Twist2 (fig. 2B). De SKOV-3-celler som uttrykker Twist2 gikk en fenotypisk endring og vises fibroblast-lignende mesenchymale morfologisk form, mens kontroll SKOV-3-celler (Vector /SKOV-3) vises plane epitelcelle morfologisk form (fig. 2B). Immuno-fluorescerende farging viste at Twist2 er lokalisert i kjernen, som var i overensstemmelse med det faktum at Twist2 er en transkripsjonsfaktor (Fig. 2C).
Vi evaluerte deretter spredning av SKOV-3-celler som uttrykker Twist2through analyser av cellesyklus distribusjon og cellevekst. Resultatene viste ingen tydelig effekt av Twist2 uttrykk på celleformering (Fig. 3A, 3B). Som Akt og ERK1 /2 er viktige indikatorer som er involvert i celle-proliferasjon, ble uttrykket av disse proteiner og deres fosforylering undersøkt ved Western blot-analyse. Konsekvent, vi gjorde ikke oppdage endringer i Akt, ERK1 /2, og deres fosforylering former i Twist2 /Skov-3 celler realtive til (fig. 3C) Vector /Skov-tre kontrollceller.
A. Strømningscytometri-analyse viste ingen forskjell av cellesyklusen fordeling mellom SKOV-3 kreftceller med eller uten Twist2 ektopisk ekspresjon. B. formeringshastigheten av de transfekterte celler, ble detektert og sammenlignet med den til vektorkontroll gjennom levedyktige celletellinger ved bruk av trypan-blå farging. Triplikate bestemmelser ble utført i hver gruppe av celler. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Ingen åpenbar påvirkning av Twist2 ble observert på cellevekst. C. Expressions av Akt, ERK1 /2, og deres phosphoralation former indikert Twist2 hadde ingen effekt på spredning av Western blot. Sammenlignet med Vector /Skov-3-celler ble ingen åpenbare endringer av Akt, ERK1 /2, og deres fosforylering former funnet i Twist2 /Skov-3 celler.
3. Twist2 Expression Forbedret Migrasjon og Invasion of Skov-3 eggstokkreft celler
Twist2 har vist seg å være en viktig induktor av EMT i brystkreft og livmorhalskreft. EMT prosess fremmer epitelceller skal vises fibroblast form, karakterisert ved økt bevegelighet og invasivitet [15]. For å avgjøre om Twist2 /Skov-3 celler har tilegnet seg økt evne til å migrere, utførte vi en sårtilheling analyse hvor bevegeligheten av celler som ligger på kanten av såret ble evaluert på grunnlag av deres evne til å kolonisere såret området. I nærvær av serum (10% FBS), ble sårhelbredelse observert raskere i Twist2 /SKOV-3-celler enn kontrollcellene gruppe ved (4A Fig.) 24 timer. Så det var ingen økning i spredning indusert av Twist2 (Fig. 3 C), kan det hende at Twist2 /Skov-3 celler har større celle migrasjon potensial
in vitro
i «sårheling» analysen (fig. 4A, 4B ). Disse resultatene ble bekreftet ved en transwell kammer assay inneholdende et ekstracellulært matrisesjikt (matrigel). Som vist på figur 4C, er antallet Twist2 /SKOV-3-celler migrert gjennom porene mer enn kontrollcellene gjorde.
A. In vitro sårheling analyse av Skov-3 kreftceller med eller uten Twist2 ektopisk uttrykk. Representative bilder av celler på «healing» områder på 12 og 24 timer etter skraping blir vist økt celle migrasjon i Twist2 /Skov-3 celler. B. analysert migrasjon resultatene etter den ene måten ANNOVA test (Graphpad Prism5 programvare). En P-verdi på 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. De Twist2-uttrykkende SKOV-3-celler migrerte raskere enn den vektor-transfekterte kontrollceller. C. In vitro matrigel invasjon analyse av SKOV-3-celler med eller uten ektopisk ekspresjon av Twist2. Kvantifisering indikerte at Twist2-uttrykkende celler er 8-9 folder mer omfattende enn de vektorkontrollceller i in vitro Matrigel invasjon assay. *,
p
. 0,005
4. Nuclear β-catenin ble akkumulert i eggstokkene carcinoma celler når Twist2 indusert EMT fenotype
Når Twist2 over uttrykker i eggstokkreft celler, kreftceller morfologi ble forvandlet til fibroblast-lignende form sammen med økt bevegelighet og invasivitet, mens ingen forandring ble funnet i celleformering. Våre data indikerer at tvangs uttrykk for Twist2 kan skyve disse EOCs å gjennomgå en epitelial-mesenchymale overgang.
EMT vanligvis innebærer avbrudd av tett veikryss, adherens veikryss, som bidrar til separasjon i individuelle celler [16], [17]. For ytterligere å avgjøre om uttrykket av Twist2 faktisk fremmer EMT i disse eggstokkreft celler, undersøkte vi uttrykket av E-cadherin og N-cadherin, to veletablerte epitelial til mesenchymale stakere i Twist2-uttrykke og vektor-transfektert Skov-3 celler. Vi fant at ekspresjon av E-cadherin (epitelial maker) ble bemerkelsesverdig redusert i Twist2-uttrykkende celler i forhold til kontrollcellene, men ekspresjonen av N-cadherin (mesenchymale maker) øket i celler som uttrykker Twist2 ved sanntids-PCR ( fig. 5A, 5B). Vi ytterligere bekreftet uttrykk resultatene av E-cadherin, N-cadherin med Western Blot (Fig. 5C).
A og B. Real Time PCR resultatene av Twist2, E-cadherin, N-cadherin og APC mRNA som uttrykker nivåer i Twist2-uttrykkende celler og vektor-transfekterte kontrollceller (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001). C. Western Blot resultatene av Twist2, E-cadherin, N-cadherin, β-catenin uttrykk i Twist2 /Skov-3 celler sammenlignet med Vector /Skov-3 kontrollceller. D. Fordeling av β-catenin i cytoplasma og cellekjernen detektert av cellefraksjoneringsmetode. P-foreldre Skov-3 kreftceller, V-vektor-transfekterte kontrollceller, T-Twist2-uttrykke Skov-3 celler.
Som Twist2 /Skov-3 celler vises de morfologiske endringer (fig. 2B), for å bedre potensiell migrere (fig. 4), og EMT markører uttrykk, vi konkluderte med at ektopisk ekspresjon av Twist2 fremmer en EMT fenotype i epitel-eggstokk-carcinoma-celler.
det er vel anerkjent at β-catenin -E-cadherin kompleks utgjør det strukturelle kjerne av adherens kontaktene, og hindrer β-catenin overføring til kjernen og dens transkripsjonelle aktivitet [18]. β-catenin ble også oppregulert i Twist2-uttrykkende celler i forhold til kontrollcellene med redusert E-cadherin (fig. 5C). Figur 5D viste β-catenin fordeling av cellefraksjoneringsmetode. Nuclear β-catenin økt i Twist2 /Skov-3 celler. I tillegg vil redusert APC mRNA (fig. 5B).
5. TOPflash transcriptional analyse av 293ft celler
For å påvise effekten av Twist2-indusert nukleær translokasjon av β-catenin på genekspresjon, sjekket vi nedstrøms målgener for eksempel c-Myc, Cyclin D1-i Wnt signalveien . Begge c-myc og Cyclin-D1 ble økt med Twist2 overekspresjon (figur 6). Vi målte TCF /LSF avhengig transkripsjonen aktivitet ved hjelp av topp /FOP flash reporter plasmider. Etter at rapportørgener, ble innført i 293ft-celler i 48 timer ble transkripsjonen aktivitet vurdert ved luciferase og Renilla aktivitet. 293ft celler viste signifikant forhøyet LSF /TCF avhengig transkripsjon med Twist2 kotransfeksjonen (i forhold til vektor kontroll, N = 3; P 0,001; figur 7).
Som c-myc og Cyclin-D1 er stort sett ansett som wnt målgener, vi videre undersøkt deres uttrykk av western blot gjentas tre ganger. Immunoblot-analyse som viser at både c-Myc og cyclin-D1 økes ved Twist2 /SKOV-3-gruppen sammenlignet med vektor /SKOV-3 gruppe i representative figuren.
For å måle TCF4 /LEF1 avhengig transkripsjonen aktivitet av 293ft cellelinjer ble cellene transfektert med TOP /FOP flash reporter plasmider. Etter gener transfeksjon i 48 timer, ble transkripsjonen aktivitet målt ved hjelp av Dual Luciferase Assay System reporter. Celler i FOP flash gruppene viste ubetydelige nivåer av transkripsjonen aktivitet. I kontrast, celler i TOPflash grupper ko-transfektert med Twist2 viste betydelig økning i signal. Resultatene er gjennomsnittet ± S.D. av tre forsøk (N = 3; P 0,001).
Ta sammen, disse dataene viser at Twist2 overekspresjon i Skov-3 celler forstyrrer celle-celle adherens kontakter og fremmer celle migrasjon. Med den reduserte E-cadherin, β-catenin frigjøres fra E-cadherin /β-catenin kompleks. I mellomtiden, β-catenin nedbrytning reduseres ytterligere ledsaget av redusert APC, noe som resulterte i akkumulering av fri β-catenin i cytoplasma og forårsaket β-catenin overføring til kjernen for å øke transkripsjonen aktivitet. Disse data indikerte at kjernefysisk β-catenin var involvert i Twist2-indusert EMT av eggstokkreft.
Diskusjoner
Eggstokkreft er en svært metastatisk sykdom og identifisering av molekyler og /eller signalveier involvert i kreftinvasjon og metastase er meget viktig for hvor tidlig stadium påvisning er fremdeles en barriere [4]. Eggstokkreft celler er utsatt for metastasering gjennom bukhulen hovedsakelig ved intra-abdominal formidling og ved lymfatisk formidling. Metastase er en kompleks prosess som involverer endringer i ekstracellulære matriks og celle-celle kryss. Epitelial til mesenchymale overgang (EMT) er et nødvendig skritt mot metastatisk tumorprogresjon under avløsning av kreftceller fra den primære svulsten nettstedet og tilhørighet til metastaser. Få studier har undersøkt hvilke faktorer som fremmer EMT av ovarialcancer (EOC) celler [4], [19].
Flere EMT-induserende regulatorer undertrykke E-cadherin transkripsjon,
via
interaksjon med spesifikke E-bokser av den proksimale E-cadherin promoter [20]. Mest relevant er sneglen (SNAI1 og SLUG) [21], [22], ZEB (ZEB1 og ZEB2) [23] og grunnleggende helixloop-helix (bHLH) (Twist1 [24]) transkripsjonsfaktorer familier. Bare nylig, overbevisende bevis viste at Twist2 overekspresjon var signifikant knyttet til livmorhalskreft progresjon [25], [26]. Twist2 aktiverer EMT-programmer og fremmer en kreft stamcelle-fenotypen i brystkreft [10]. Imidlertid har den biologiske funksjonen til Twist2 i svulsten forble stort sett ukjent.
I denne studien, gir vi den første bevis for at Twist2 uttrykk er forbundet med høy FIGO stadium i eggstokkreft. Det kan forventes at Twist2 spiller lignende EMT funksjoner i eggstokkreft. For å oppnå dette har vi innført
twist2
inn i SKOV-3 eggstokkreft cellelinje og undersøkt celler biologiske atferd inkludert spredning, migrasjon og invasjon. Vi fant at over-ekspresjon av Twist2 hadde ingen virkning på cellevekst og Akt, ERK1 /2 aktivering. Interessant, de Twist2 /Skov-3 celler økt migrasjon og invasjon av eggstokkreft celler, som vurderes av ripe sår analyse og invasjon analysen. Som EMT resulterer i forbedret cellemotilitet og invasjon, vi videre sjekket EMT markører. En overgang fra E-cadherin til N-cadherin er også en viktig funksjon i EMT i eggstokkreft [4]. Overekspresjon av Twist2 betydelig redusert E-cadherin og økt N-cadherin uttrykk på henholdsvis både mRNA og proteinnivåer.
E-cadherin er et trans glykoprotein av type-I cadherin super. Dets cytoplasmatiske del er bundet til aktin cytoskjelettet via catenins [27]. Canonical Wnt /β-catenin signal har en stor innvirkning på EMT under kreft progresjon [28], [29]. Wnt signaler hemme GSK3p kinase aktivitet for å stoppe nedbrytningen og tvinge en rask økning i nivåene av gratis, cytosoliske β-catenin, og veldig snart etterpå, translocates inn i kjernen hvor det binder seg til TCF /LSF transkripsjonsfaktorer [30], [31] . En reduksjon av E-cadherin nivåer frigjør ofte β-catenin fra adheren knutepunkt, noe som resulterer i atom β-catenin akkumulering, og den påfølgende transaktivering av et panel av målgener, blant dem slike som spesifiserer flere EMT-induserende faktorer [18], [28 ].
en fersk publisert studie på tidlig kranie dermal utvikling indikeres en konsekvent rolle for Wnt /β-catenin signal via Twist2 i dermal spesifikasjonen i ulike regioner av embryoet [32]. Twist2 kan være et direkte mål transkripsjon og kan mediere den funksjonelle rollen til Wnt signalisering i dermale forløpere. I vårt eksperiment, økt Twist2 kjernefysisk β-catenin. Videre er oppløselige og nonsoluble cytosoliske former av β-catenin strengt regulert av proteosom /ubiquitinering system som består av GSK3P, Axin, og adenomatøs polypose coli (APC) protein [25]. På grunn av nedregulering av APC, ble β-catenin degradering også undertrykt. En gang i kjernen, vil β-catenin megle aktivering av spesifikke mesenchymale gener. Vi viste en økning på c-myc og Cyclin-D1 i Wnt /β-catenin signalveien (Fig. 6). Fordi β-catenin som var nødvendig for ekspresjon av gener mesenchymale, sjekket hvorvidt den transkripsjonelle aktivitet av dette protein ble påvirket av ektopisk Twist2. Som vist på fig. 7, av aktiviteten av TCF4 /LEF1-avhengige promotor (TOP) ble oppregulert (to folder) i celler transfektert med Twist2. Derfor er disse resultatene indikerer at ekspresjon av mesenchymale gener er under styring av β-catenin gjennom TCF4 /LEF1-avhengige komplekser. Bekreftet av resultatet er vist i fig. 5D, kjernefysisk β-catenin distribusjon ble økt i Twist2 /Skov-3 celler. Dermed Twist2 kan øke TCF4 /LEF1 avhengig β-catenin transkripsjonen aktivitet.
I denne studien, gir vi bevis for at Twist2 påvirker cellulære atferd i Skov-3 celler, herunder endringer i morfologi og motilitet. På molekylært nivå, induserer Twist2 vesentlig endring av EMT markører. Videre Twist2 fremmet celle migrasjon og invasjon av Skov-3 celler. Derfor Twist2 fremmet β-catenin utgivelse fra E-cadherin /β-catenin komplekse gjennom hemming av E-cadherin. Med kjernefysisk β-catenin akkumulering, ble Wnt /β-catenin veien deretter aktiveres for å fremme en EMT fenotype.
Så langt vi kjenner til, viser vi for første gang at Wnt aktivering i Twist2-indusert EMT fremgang i eggstokkreft, og gir ny innsikt i deres metastasering.
Konklusjoner
Våre data tyder på at oppregulering av Twist2 er korrelert med FIGO stadium i menneskelig eggstokkreft. Selv om det ikke er noen sammenheng mellom Twist2 uttrykk og svulsten histologisk type, er Twist2 en potensiell indikator på høy grad av malignitet og dårlig prognose i klinisk eggstokkreft. Overekspresjon av Twist2 indusert EMT fenotyper i humane eggstokkreft celler
in vitro
. Nedregulering av E-cadherin og APC samt oppregulering av N-cadherin og β-catenin (i cellekjernen), tyder på at Twist2 fremmer β-catenin utgivelse fra E-cadherin /β-catenin gjennom hemming av E-cadherin. I tillegg, på grunn av nedregulering av APC, ble β-catenin degradering fortrengt. Derfor kanoniske Wnt /β-catenin veien ble deretter aktivert ved atom β-catenin akkumulering, og dermed utløste transkripsjon av nedstrøms målgener for å fremme tumorinvasjon og metastasering. Sammen er disse dataene indikerte at β-catenin er involvert i Twist2-indusert EMT i eggstokkreft.
Materialer og metoder
Material
Mus anti-Twist2 antistoff ble kjøpt fra Abnova bioteknologi. Mouse anti-Flag, anti-β-aktin, og anti-Akt antistoffer ble kjøpt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA). Kanin anti-E-cadherin, Geit-anti-N-cadherin, kanin anti-IKB-α, kanin anti-β-catenin, mus anti-Oct-1, kanin anti-Cyclin-D1, kanin-anti-c-Myc, mus anti-kanin IgG, anti-mus IgG antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA, USA)
kanin anti-fosfor-Akt (Ser 473) antistoff ble kjøpt fra R . D Systems Europe . Kanin anti-ERK1 /2, kanin-anti-p-ERK1 /2, kanin anti-Akt, kanin-anti-p-Akt ble kjøpt fra Cell Signaling Company. ABC Kits og DAB underlaget kit ble kjøpt fra Thermo Scientific og Pierce, henholdsvis. Formalinfiksert og parafininnstøpte eggstokkreft vev microarray chipsen fra Alenabio Company. Forskningsprotokollen og design ble godkjent av etikkomiteen Xiamen University (ID No: 20100602). Alle våre kliniske undersøkelser ble gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen.
immunhistokjemisk farging
Tissue array-seksjoner i formalinfiksert og parafin-embedded human primær eggstokkkreft ble undersøkt for å vurdere ekspresjonen av Twist2, og immunhistokjemisk farging (IHC) ble utført som beskrevet tidligere [25], [33]. Twist2 ble vist å spesifikt gjenkjenne de tilsvarende proteiner (Fig. 1A). Diaminobenzidin ble anvendt for å visualisere den immunhistokjemiske reaksjonen, etterfulgt av kontra med hematoksylin. For å fremstille den negative kontrollen, ble det primære antistoff erstattet med normal mus IgG. IHC flekker på vev utvalg ble gjentatt for 3 ganger, analysert gjennom standard lysmikroskopi. Positive celler viste brune granulat i cytoplasma eller cellekjernen
Den positive celle prosent ble bestemt ved å beregne prosentandelen av positive celler i totale observerte celler: Hvis 10%, 0, 10% -20%, en. ; 20% -50%, 2; 50%, ble 3. intensiteten besluttet ved å sammenligne farging av kreftceller: ingen farging eller tvetydige flekker, 0; svake flekker, 1; medium flekker, 2; sterk farging, 3. De to scorene ble multiplisert å kategorisere flekker: 0-1, negativ (-), 2-4, positive (+), ≥5, sterk positive (++)
Generation. av Twist2-overekspresjon Stabil eggstokkreft celler
Den menneskelige eggstokkreft cellelinje Skov-3 ble innhentet fra ATCC. Cellene ble opprettholdt i McCoys 5A medium supplert med 10% føtalt bovint serum og penicillin /streptomycin. The Flag-Twist2-uttrykke plasmid hadde blitt bygget i vår tidligere studie [25]. The Flag-Twist2-uttrykke plasmid og pBabe-puromycin vektor var co-transfektert inn Skov-3 eggstokkreft celler bruker lipofectamine2000
TM transfeksjon reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens anvisninger. De Twist2-uttrykker stabile kloner og vektorkontroll kloner ble oppnådd henholdsvis gjennom utvalg med puromycin. De Twist2 uttrykk nivåer i de utvalgte stabile kloner ble deretter bekreftet gjennom immun-blot analyse med Twist2 og flagg antistoffer.
Cell morfologiske Observasjon og Confocal Immunofluorescent Farging
Cell morfologiske former ble observert ved hjelp av fasemikroskopi (Olympus). Immunhistokjemisk farging ble utført på Twist2 /SKOV-3 og vektor /SKOV-3 eggstokk-kreft celler som tidligere beskrevet [25]. Farging av Twist2- og vektor-transfektert ble observert Skov-3 celler og analysert ved hjelp av laser scanning konfokalmikroskopi (Olympus).
Cell Vekst analysen
Cellene ble sådd i normal medium til høstes. Cellevekst ble bestemt via MTT-assay som tidligere beskrevet [34]. Formeringshastigheten av de transfekterte celler, ble detektert og sammenlignet med den til vektorkontroll gjennom levedyktige celletellinger ved bruk av trypan-blå farging. Triplikate bestemmelser ble utført i hver gruppe av celler. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Den celleproliferasjon rate (%) ble beregnet som følger: antall celler i den eksperimentelle gruppen /antall kontrollgruppen x 100%
sårheling assay
Cellene ble sådd ut på seks. brønners plater (1 × 10
5 celler /skål), og når de nådde over 90% samløpet, ble en ripe gjort over cellen monolayer med spissen. Celler ble forsiktig vasket med PBS i 3 ganger og opprettholdes i friskt medium. Celler ble inkubert i 24 timer og fotografert ved å bruke et invertert mikroskop vevskultur ved x 100 forstørrelse. Analyser ble utført minst tre ganger og data ble presentert som gjennomsnitt ± SD. Migrasjonen potensial mellom Twist2-uttrykkende celler og kontrollceller ble sammenlignet ved relativ gap avstand. Og vi analyserte resultatene etter den ene måten ANNOVA test (Prism5 programvare). En P-verdi på p 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Cell Invasion analysen
For invasjon analysen, 5 × 10
3 celler ble sådd på Matrigel-belagte membran inserts (BD. Bioscience). Den nederste kammer inneholdt 0,75 ml McCoys 5A supplert med 10% føtalt bovint serum som et kjemotiltrekkende. Celler ble inkubert i 24 timer ble cellene rester inne i innsatsen fjernes med en bomullsdott, og celler som hadde trengt Matrigel å invadere til den nedre overflate av membranen ble fiksert i metanol og farget med H E. Etter lufttørking av membranen, ble cellene tellet ved x 100 forstørrelse på 10 tilfeldige synsfelt under et mikroskop. Tre uavhengige eksperimenter ble utført i hvert enkelt tilfelle.
Cell sykling analyse via flowcytometrisystemer
Cell sykling ble identifisert via flowcytometri analyse som tidligere beskrevet [34]. I korthet ble cellene sådd ut i 24 timer, deretter ble høstet, vasket to ganger med PBS og fiksert i 70% etanol ved 4 ° C over natten. Cellepelletene ble suspendert i propidiumjodidfarging-løsning (20 ug /ml propidiumjodid og 0,2 mg /ml RNase i PBS) og inkubert i 30 minutter ved 37 ° C. Prøvene ble deretter analysert ved strømningscytometri.
Isolering av subcellulære fraksjoner, og Western Blot analyse
Cell fraksjonering og Western blot-analyse ble utført som våre tidligere publikasjoner [34], [35]. Detaljer om cellefraksjonering er som følgende: Hel-celle ekstrakter ble fremstilt ved å skrape celler av petriskåler, vask celle pellets to ganger i PBS, og deretter resuspending pellets i to-pakket cellevolum av RIPA buffer [150 mM NaCl /50 mM Tris HCl, pH 7,5 /0,25% (vekt /ol) deoksycholat /1% Nonidet P-40/5 mM natriumortovanadat /2 mM natriumfluorid /protease-inhibitor blanding]. Nukleære og cytoplasmiske ekstrakter ble isolert ved vasking cellepelletene i buffer A (10 mM Hepes, pH 7,5 /10 mM KCl /1,5 mM Mg
2 Cl /0,5 mM NaF /1 mM glyserol fosfat /protease-blanding), og lyserings i buffer A + B (buffer A pluss 0,5% Nonidet P-40) i en 02:01 blanding.
