Abstract
Bakgrunn
Med en million nye tilfeller av tykktarmskreft (CRC) diagnostisert årlig i verden, er CRC den tredje vanligste diagnosen kreft i den vestlige verden. Pasienter med stadium I-III CRC kan kureres med kirurgi, men står i fare for gjentakelse. Kolorektal kreft er preget av tilstedeværelsen av kromosomslettinger og gevinster. Store genomisk profilering studier har imidlertid ikke utført i denne sykdommen. Antallet en spesifikk genetisk avvik i en tumorprøve kunne korrelere med tilbakefall overlevelse eller total overlevelse, som kan føre til dens anvendelse som biomarkør for terapeutiske avgjørelser. På dette punktet er det ikke tilstrekkelig med markører for prediksjon av tilbakefall av sykdommen i tykktarmskreft, som kan brukes i klinikken for å diskriminere mellom scene II pasienter som vil ha nytte av adjuvant kjemoterapi. For eksempel har den fordelen av adjuvant kjemoterapi er mest tydelig demonstrert i fase III sykdom med en ca 30 prosent relativ reduksjon i risikoen for tilbakefall av sykdommen. Fordelene ved adjuvant kjemoterapi i stadium II sykdommen er mer usikre, er risikoen for tilbakefall er mye mindre i den samlede gruppen og de spesifikke pasienter med risiko er vanskelig å identifisere.
Materialer og metoder
i denne studien ble matrise-komparativ genomisk hybridisering analyse (matrise-CGH) brukes til å studere høyoppløselige DNA kopiantall endringer på 93 tykktarmskreft prøver. Disse genomiske data ble kombinert med parametere som
KRAS
mutasjonsstatus, mikro status og clinicopathological egenskaper.
Resultater
Både store og små kromosom tap og gevinster ble identifisert i vårt utvalg kohort. Tilbakevendende gevinster ble funnet for kromosom 1Q, 7, 8q, 13 og 20 og tapene var for det meste funnet for 1p, 4, 8p, 14, 15, 17p, 18, 21 og 22. Data-analyse viste at tap av kromosom 4 er knyttet til en dårligere prognose i våre pasienter serien. I tillegg til disse forandringer, ble to interessante små områder med overlapping identifisert, som kan være forbundet med tilbakefall av sykdommen. Gevinsten av 16p13.3 locus (inkludert RNA
bindende protein
,
fox-en homolog
genet,
RBFOX1
) ble koblet med en verre tilbakefall overlevelse i vår pasient kohort. På den annen side, tap av
RBFOX1
ble bare funnet hos pasienter uten tilbakefall av sykdommen. Mest interessant, ovennevnte egenskaper ble også funnet i stadium II pasienter, for hvem er det en høy medisinsk behov for identifisering av nye prognostiske biomarkører.
Konklusjoner
I konklusjonen, kopiere antall variant av den 16p13.3 locus synes å være en viktig parameter for prediksjon av tilbakefall av sykdommen i tykktarmskreft
Citation. Mampaey E, Fieuw A, Van Laethem T, Ferdin L, Claes K, Ceelen W, et al. (2015) Fokus på 16p13.3 Locus i Colon Cancer. PLoS ONE 10 (7): e0131421. doi: 10,1371 /journal.pone.0131421
Redaktør: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, TYSKLAND
mottatt: 25 februar 2015; Godkjent: 02.06.2015; Publisert: 29.07.2015
Copyright: © 2015 Mampaey et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering: Denne forskningen ble støttet med tilskudd fra den belgiske regjeringen: FPS Helse, næringsmiddelkjeden miljø og sikkerhet, og DG Health Care – Cell kreftplan (Nasjonal kreftplan. – tiltak 29). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
med en million nye tilfeller av tykktarmskreft (CRC) diagnostisert årlig i verden, er CRC den tredje vanligste diagnosen kreft i den vestlige verden og den nest største årsaken til kreftrelaterte dødsfall i både menn og kvinner (9% av alle kreft) [1]. En av utfordringene i CRC er å få en reduksjon i dødelighet ved gjennomføring av screeningprogrammer fører til tidlig oppdagelse og behandling av forstadier til kreft [2]. Terapeutiske avgjørelser er basert på en iscenesettelse system som beskriver tumorutbredelse, tilstedeværelse eller fravær av spredning til lymfeknuter og fjernmetastaser (TNM klassifisering) [3]. Tidlig stadium CRC kan kureres ved kirurgi alene. Fordelen med adjuvant kjemoterapi har vært mest tydelig demonstrert i fase III, mens fordel i stadium II sykdommen er fortsatt kontroversielt [3-5]. I dag stadium III pasienter blir trolig overbehandlet: alle pasienter får cellegift mens om lag halvparten av pasientene ikke opplever tilbakefall før innføringen av adjuvant behandling [6]. På den annen side er trinn II pasienter sannsynligvis underbehandlet, ettersom en betydelig del av dem vil utvikle tilbakevendende sykdom. Identifisering av høyrisiko stadium II pasienter som vil ha nytte av adjuvant kjemoterapi er svært nødvendig, men har så langt vist seg vanskelig å påvise i kliniske studier. Bruken av adjuvant behandling i fase II-pasienter er basert på en risikovurdering vurdere på bl.a. mikro (MS) status, lymphovascular og perinevral invasjon, tumor differensiering og antall undersøkte lymfeknuter [6].
Det er behov for identifisering av ytterligere (bio) markører for prediksjon av tilbakefall i denne undergruppen av pasientene. Dette vil forhåpentligvis føre til identifisering av pasienter som kan ha nytte av adjuvant kjemoterapi [3].
Nylig, mye fremgang har blitt gjort i forståelse av tykktarmstumorbiologi. Den histologiske sekvens av kolorektal kreftutvikling er preget av flere ulike genetiske og epigenetiske forandringer [7,8], som inaktiverer
APC
mutasjoner i familiær adenomatøs polypose (FAP) eller tap av funksjon av mismatch reparasjonsgener i arvelig non-polypose tykktarmskreft (HNPCC) [9,10]. I 1990 Fearon
et al
. foreslo en kaskade av mutasjoner i ulike gener som er ansett som den klassiske eller kromosomal instabilitet (CIN) pathway [7]. Den første hendelsen i de tidlige stadiene av en kolorektal svulst er
APC
inaktivering, fulgt over tid av flere mutasjoner av
KRAS
og
TP53
gener, samt slettinger av kromosom 18q [7,11]. De fleste av de sporadiske CRC er karakterisert ved disse forandringer, og er lokalisert på den venstre siden av tykktarmen. I tillegg til dette, har to andre veier, som er involvert i etiologien av CRC blitt identifisert. Femten prosent av sporadiske CRC og 95% av HNPCC syndromer ble vist å gjennomføre endringer i mikrosatelitt ustabile (MSI) pathway [10]. Til slutt, 20-30% av CRC har endringer av taggete vei, ofte diagnostisert med et CpG-øy metylert fenotype (CIMP) og /eller metylering av
MGMT
gen [12,13]. Disse (epi) genetiske endringer kan påvirke sykdomsforløpet og dermed utfallet av pasientene.
En annen form for genetiske endringer som finnes i tykktarmssvulster er DNA kopi nummer endringer (CNAS), som allerede har blitt studert i tykktarmskreft, likevel uten konsensus [14-17]. På grunn av genomisk ustabilitet av svulster, disse CNAs er ofte tilstede i tumorer og representerer potensielle nye biomarkører for prediksjon av tilbakefall av sykdommen.
I denne studien ble CNAs analysert i et stort panel av tykktarmskreftpasienter i forskjellige stadier av sykdommen med sikte på å vurdere om spesifikke CNAs forholder seg til pasientenes prognose.
Materialer og metoder
Pasienter og kliniske data
En serie med 159 primær kolon adenokarsinom resections var undersøkt, prospektivt samlet mellom 2004 og 2012 fra institutt for Gastro-intestinal kirurgi på Universitetssykehuset i Gent i Belgia. Pasientene ble fulgt inntil dødsdato eller inntil kliniske data cut-off (mars 2014). Plasseringen av svulst i tykktarmen ble betegnet som passer for tumorer som ligger i blindtarmen, colon ascendens og proksimale halvparten av den tverrgående kolon. Plasseringen ble utpekt som venstre når svulsten ble plassert i den distale halvdel av tverrgående kolon, synkende kolon og sigmoid. Analyser ble utført innenfor hver svulst scenen, regnet fra dato for diagnose for tilbakefall eller dato for siste oppfølging for tilbakefall av sykdommen (alle trinn uten stadium IV) og død eller siste oppfølging for total overlevelse (alle stadier sammen). Når en sammenheng mellom overlevelse og en viss markør ble undersøkt i løpet av alle kreft stadier sammen, ble tilbakefall pasienter regnes som stadium IV pasienter og for disse pasientene å overleve i denne konkrete analysen ble regnet fra datoen for diagnostisering av tilbakefall.
pasienter som ble behandlet med adjuvant kjemoterapi enten mottatt 5-FU i henhold til endret de Gramont (spesielt stadium II pasienter) eller endring FOLFOX 6 (stadium III pasienter) i løpet av 6 måneder. Fire pasienter ble behandlet i en klinisk studie, og kan ha fått flere biologiske legemidler. Stage IV pasienter ble behandlet med en rekke sammenhengende palliative regimer.
En skriftlig informert samtykke til deltakelse ble innhentet fra hver pasient. Studien ble godkjent av kommisjonen for medisinsk etikk ved Universitetssykehuset i Gent (Belgia registreringsnummer: B67020096625). Kliniske data ble hentet fra de medisinske filer.
Vevsprøver
En patolog, før formalin fiksering, samplet både primær tumor og makroskopiske normalt vev fra reseksjon prøver. Normalt vev ble tatt så langt unna som mulig fra svulsten i samme reseksjon prøven. Alle prøver var friskt frosset innen maksimalt 30 minutter etter kirurgisk fjerning og lagret ved -80 ° C. En patolog scoret alle tumorprøver for svulst celle innhold på haematoxylin /eosin farget frysesnitt. Til slutt ble 93 av 159 kreftprøver som inneholder minst 50% tumorceller beholdt.
KRAS mutasjon og MSI fenotype
Alle 159 tumorprøver ble profilert for tilstedeværelse av sju somatiske
KRAS
mutasjoner i kodon 12 og 13 (12ALA, 12ASP, 12VAL, 12CYS, 12SER, 12ARG og 13ASP) ved hjelp av TheraScreen KRAS RGQ PCR kit (Qiagen) på formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) tumorvev (analyse i henhold til ISO15189 akkreditering). Annet
RAS
mutasjoner ble ikke undersøkt. MS status for alle 159 tumorprøver ble analysert ved fragmentanalyse på ABI3130xl genetiske analysator (Applied Biosystems) ved hjelp av programvaren GeneMapper 4 (Applied Biosystems). BAT25, BAT26, D2S123, D17S250, NR21, D18S55, NR24 og NR27 er de åtte undersøkte gjenta markører. Svulster ble klassifisert som MSI da ble observert ustabilitet på 25% av markørene. MSI pasientene kan deles inn i to grupper, MSI-høy og MSI-lav, i henhold til antall avvikende markører. Imidlertid er tallene var for lave for riktig statistisk analyse. I situasjoner hvor skillet ble gjort, er det beskrevet i teksten.
DNA ble ekstrahert ved hjelp av DNeasy blod og vev kit (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. Kvaliteten og mengden av DNA-prøvene ble målt med en Nanodrop ND-1000 instrument (Thermo Scientific).
Array komparativ genomisk hybridisering
Kopier nummer endringer ble studert av oligo-baserte matrise-CGH på tumorprøver med minst 50% tumorceller. Prøver med mindre tumorceller could skjevhet resultatene. Prøvene ble profilert på en Custom SurePrint G3 Menneskelig CGH Microarray, 4x180K (G4125A, Agilent Technologies). DNA i kolon tumorprøver ble merket med fluorescerende fargestoff Cy3 (Perkin Eimer) og den samme mengde av kommersielt tilgjengelig referanse hann og hunn genomisk DNA (Kreatech) ble merket med Cy5 (Perkin Eimer). Videre behandling ble utført i henhold til produsentens instruksjoner (Agilent Technologies). Fluorescensstyrkene ble målt ved hjelp av en Agilent scanner (G2505C, Agilent Technologies). Data ble hentet med Feature Extraction v10.1.1.1 program (Agilent Technologies) og videre behandlet med arrayCGHbase [18]. De cut-off verdier for vunnet og tapt segmentene var henholdsvis 0,33 og -0,33. Avvik som var til stede i mer enn 10 tilfeller i en separat skjermet klinisk genetikk kohort av 1000 prøver ble vurdert som mulige grunnlovskopitall varianter (normal kopi nummer forandringer) og ble ekskludert fra videre analyse. Alle resultater rapporteres ble manuelt validert.
statistikker
Den statistiske miljø R (versjon 2.12.1) ble brukt til å utføre hierarkisk klynge og heatmap analyse og å konstruere grafen viser genomet brede frekvenser på alle presiseringer, gevinster og tap i alle prøvene. Alle andre statistiske analyser ble utført i SPSS statistikk (versjon 21). (*) P 0,05, (**) p 0,01 og (***) p 0,001 ble ansett som statistisk signifikant i to-tailed tester. Ettersom alle data var normalfordelt, ble ANOVA brukes til å sammenligne populasjoner og Pearson korrelasjon ble anvendt for assosiasjon mellom variablene. Overlevelses analyser ble utført med Kaplan-Meier-metoden og log rank test. Cox regresjonsanalyse ble brukt til å beregne hazard ratio.
Resultater
Kliniske kjennetegn
De kliniske data er oppsummert i S1 tabell. Alle tumorer i denne studien var primær kolon adenokarsinomer, som var ubehandlet ved reseksjon. Pasientene var hovedsakelig fra kaukasisk etnisitet.
Når det gjelder kjønn forening, sykdom klassifisering, stedet for primærtumor, scene, differensiering, perinevral og lymphovascular invasjon, dette settet med 159 svulster ligner de fleste andre rapporterte pasient kohorter av sporadisk CRC (S1 tabell).
svulstene ble likt fordelt mellom menn og kvinner (57,9% vs 42,1%). Den mucinous variant av adenokarsinom ble diagnostisert i 20,1% av svulstene. Alle pasientene ble iscenesatt ved hjelp av AJCC-7 retningslinjer [19]. Pasientene ble likt fordelt over de fire stadier, med litt flere pasienter i stadium II (36,5%). Halvparten av pasientene (49,7%) som mottas adjuvans (31,2%) eller smertestillende middel (18,5%) kjemoterapi. Ved slutten av oppfølgings, 105 pasienter (66%) var fremdeles i live (S1 tabell). Blant de 159 pasientene som inngår i denne studien, 68 (52,7%) hadde en økt carcinoembryonic antigen (CEA) nivå ved diagnosetidspunkt. De hadde en dårligere prognose enn et nivå under 3,4 ng /mL. Både metastatisk eller lokalt residiv og 2-års total overlevelse (OS) var signifikant bedre for pasienter med lav CEA nivå ved diagnose (R = 0,260, ** P = 0,003 for tilbakefall overlevelse (RFS), R = 0,271, * * P = 0.002 for to år OS) (S1 File).
KRAS mutasjonsstatus og MS status og deres sammenhenger med clinicopathological data
Som vist i S1 tabell,
KRAS
-mutations ble påvist hos 51 pasienter (33,1%). Åtte av disse mutasjonene ble plassert i kodon 13 (pGly13Asp), ble alle andre ligger i kodon 12 av
KRAS
genet. Blant de 159 pasientene som ble testet for MSI, 87,9% av tykktarm kreft viste mikro stabilitet (MSS), to pasienter (1,3%) var MSI-low og 16 pasienter (10,7%) var MSI-høy (S1 tabell).
i vår pasientpopulasjon, observerte vi en signifikant sammenheng mellom
KRAS
mutasjon og MS status (R = -0,198, * P = 0,017).
KRAS
mutasjonsfrekvensen var høyere i MSS pasienter enn hos MSI pasienter (S2 Table).
Vi fant en signifikant korrelasjon mellom MS status med lymphovascular invasjon (R = -0,181, * P = 0,038) og området av primærtumor (R = -0,291, *** P 0,001). Vi fant MSI minst i en pasient i alle ledd, men for det meste i den tidlige fasen (to MSI pasienter i fase I, sju i stadium II og en MSI pasient både i stadium III og IV) (tabell 1). En signifikant korrelasjon ble funnet mellom MS status og tumor klassifisering (R = 0,173, * P = 0,034) (S2 tabell). Dette betyr at pasienter med MSI har vanligvis en liten tumor som ligger i den høyre tykktarmen, i denne kohort oftest trinn II mucinous adenokarsinom uten lymphovascular invasjon. De kolorektal tumorer med MSI meste er
KRAS
villtype (S2 File).
En utvidet tabell over pasientkarakteristika kan bli funnet i S1 og S2 bord.
DNA kopi antall forandringer
etter scoring av alle tumorprøver, 93 prøver med minst 50% av tumorcellene ble beholdt for matrise-CGH analyse. Nitti ut av disse 93 kolon karsinom viste genomiske forandringer (fig 1). Pasienter med økt CEA nivå hadde flere CNAs enn pasienter med normal CEA nivå ved diagnose (* P = 0,023) (figur A i S3-fil). CNAs i vår pasient kohort var mindre rik på MSI pasienter enn i MSS pasienter, som vurderes av 180k matrise-CGH (* P = 0,016) (Figur B i S3-fil). Alle MSI pasienter hadde mindre enn ti forandringer, mens det gjennomsnittlige antall endringer for den totale pasientmateriale ligger 12,98 (± 0,982). Når vi så for endringer i de ulike tumorstadier, fant vi et høyere antall endringer for MSI pasient i stadium IV, mens i de andre tumorstadier, MSI pasientene hadde mindre CNAs forhold til MSS pasienter (** P = 0,003) (Figur C i S3-fil). Clustering analyse identifiserte ingen statistisk signifikant sammenheng mellom klase grupper (basert på en eller flere spesifikke endringen) og klinisk parameter i vår database (S1 figur).
Gevinst er representert i blått, tap i rødt.
antall CNAs ble delt i tre grupper etter å ha utført en ROC-kurve (data ikke vist). To loddepunktene ble etablert; den første ved 12 CNAs og den andre ved 20 CNAs. På den måten deles vi kolon karsinom i tre grupper: tumorer med mindre enn 12 endringer, tumorer med mer enn 20 endringer og en mellomliggende gruppe av tumorer med 12 til 20 forandringer
overlevelsesanalyse, beregnet i henhold til. antall endringer, avslørte en kortere to-årig OS for pasienter med mer enn 20 endringer i alle tumorstadier sammen (** P = 0,004) (figur 2A). Hos pasienter med stadium IV svulst, forskjellen var bemerkelsesverdig større (figur 2B): den midlere overlevelse av pasienter med mer enn 20 endringer var halvparten av den for pasienter med mindre enn 20 endringer (* P = 0,015). Uventet, i tumor trinn I og II, dårligere prognose ble funnet i pasientgruppe med mindre enn 12 endringer (* P = 0,019) (figur 2C og 2D).
(A) For alle trinn, ** P = 0004; (B) for stadium IV, * P = 0015; (C) for stadium I, * P = 0019 og (D) for fase II, * P = 0019. I overlevelseskurven i tre grupper kan skilles; gruppen med mindre enn tolv endringer (blå), gruppen med tolv inntill tjue endringer (grønn) og gruppen med mer enn tjue endringer (rød).
Det er også en sammenheng mellom differensiering grad av tumoren og antall endringer. Pasienter som har godt differensierte svulster, hadde mindre enn 12 CNAs, samlet og for hvert trinn separat. Pasienter med dårlig differensierte svulster og med svulster som frakter mer enn 20 CNAs, hadde en verre to år OS og spesielt når vi bare sammenligne stadium IV pasienter (** P = 0.006 og ** P = 0.010 henholdsvis) (S2 figur).
Array komparativ genomisk hybridisering (matrise-CGH) analyse viste at den hyppigste CNAs i kolon karsinom var gevinst av kromosomer 1q, 7, 8Q, 13, 20 og 20Q og tap av kromosomer 1P, 4, 8p, 14 , 15, 17p, 18, 21 og 22 (figur 1). Vi fant også tilstedeværelsen av flere isochromosomes i våre prøver for kromosomer 1, 5 og 8 (henholdsvis i 5,4%, 5,4% og 7,5% av våre pasienter). Tap av kromosom 4 ble vesentlig knyttet til en kortere RFS (gjennomsnittlig RFS er 241,7 uker for pasienter med et tap av kromosom 4 og 433.96 uker for pasienter uten kromosom 4 tap, *** P 0,001) (figur 3A). Tap av kromosom 1, 3, 4 og 9 ble koblet til en kortere to-årig OS (henholdsvis P = 0,053, ** P = 0,005, ** P = 0,002 og P = 0,069) (figur 3B og fig AC i S4 File ). Gevinst på kromosom 7 og 20 ble vist å være signifikant sammenheng med en bedre 2-årig OS (henholdsvis * P = 0,048 og * P = 0,035) (Tall DE i S4 fil).
Tap av kromosom 4 er knyttet til en kortere RFS, *** P 0001 (A) og en mindre 2-årig OS, ** P = 0,002 (B). Pasienter uten en endring av kromosom 4 er presentert i grønt, de med tap av kromosom 4 i blått.
kromosom 16p13.3 endring
Locus 16p13.3 ble funnet å være en tilbakevendende endring, da det er til stede i 35% av vår pasient kohort av 93 pasienter. Åtte pasienter viste gevinst på den distale del av denne locus og 24 pasienter viste et tap med de mest tilbakevendende minste delen av overlapping (SRO) fra 6,5 till 7 Mb. Åtte pasienter presentert med en homozygot delesjon. Den SRO består ekson 3 og 4 i
RBFOX1
genet (6-7Mb). Kopier nummer variant profiler av normalt vev av de åtte homozygot tilfeller ble vurdert å utelukke et konstitusjonelt kopiantall variant. Resultatene viste at de homozygote sletting ikke var grunnlovskopitallvarianter, men ble somatisk kjøpt endringer (S3 fig). Mer enn 70 gener, for eksempel
CREBBP
,
MIR1225
,
RAB40C Hotell og
RAB26
, ligger i den distale delen av 16p13.3 locus. De to sistnevnte gener er medlemmer av
RAS
onkogen familie, som spiller en viktig rolle i kolon kreftutvikling.
Generelt pasienter uten 16p13.3 endringer utviser mindre CNAs (R = -0,430 , *** P 0,001). Dette gjelder for alle tumor trinn (fig 4a), så vel som for hver tumorstadium separat (data ikke vist).
(A) Forholdet mellom endring av 16p13.3 locus og antallet av CNA i tilsvarende pasient for alle kreft etapper, R = -0430 og *** P 0001. (B) Kaplan Meier overlevelseskurve viser en dårligere prognose for pasienter med en gevinst på 16p13.3 locus enn alle kreft etapper, ** P = 0010. Gevinst er representert i grønt, er tapene i blått og pasienter uten en endring representert i rødt.
I stadium IV svulster ble funnet en signifikant samvariasjon mellom tilstedeværelse av 16p13.3 endring (gevinst eller tap) og svulsten i den høyre kolon (R = -0,384, * P = 0,036). I alle andre tumorstadier, kan dette funnet ikke bekreftes, selv ikke når alle ledd ble vurdert sammen.
Ingen sammenheng ble funnet mellom to års OS og tilstedeværelsen av en 16p13.3 endring (Tall AD i S5 File). Men i metastatisk gruppen, var en trend til stede (figur E i S5 File). Pasienter som viste
RBFOX1
tap, viste en dårligere to-års OS enn pasienter uten denne slettingen (P = 0,393).
Til slutt, en signifikant korrelasjon ble vist i alle kreft etapper mellom tilstedeværelsen av en 16p13.3 endring og RFS (fig 4B og Figur A i S6-fil). Når en gevinst på 16p13.3 var til stede, prognosen for disse pasienter over alle kreft etapper var verre enn prognosen for pasienter uten 16p13.3 endring eller med et tap av
RBFOX1
genet (HR = 5,018 , ** P = 0,020). Når den samme analyse ble gjort for hver enkelt svulst scenen for seg, ble en border signifikant korrelasjon mellom 16p13.3 endring og tilbakefall av sykdommen bare observert i fase II tumorer (* P = 0,022) (figur B-D i S6-fil). Ingen av pasientene som hadde et tap av
RBFOX1
genet, led av en lokal eller metastatisk tilbakefall. Tvert imot pasienter uten en endring eller med en gevinst i 16p13.3 hadde en høyere risiko for tilbakefall. Den log-rank test for tilbakefall i fase II svulster viste en sterkere signifikant korrelasjon for gevinst på 16p13.3 og tid for tilbakefall (** P = 0,008), med en gjennomsnittlig tid til tilbakefall av 166 uker for pasienter med en gevinst på 16p13 .3 og 443 uker for pasienter uten 16p13.3 endring (figur E i S6 File).
Diskusjoner
De pasientkarakteristikker i denne studien i stor grad samsvarer med det som er rapportert i litteraturen. Noen tidligere rapporterte funnene kan imidlertid ikke valideres i denne studien, som en bedre prognose for pasienter med MSI-høye svulster som beskrevet av Gryfe og medarbeidere [20]. Colontumorer med
KRAS
mutasjon er mindre sannsynlig å presentere mikro ustabilitet. Korrelasjonen mellom
KRAS
mutasjon og MS status har allerede blitt vist i tidligere studier og kompliserer bruken av denne markøren i forhold til prognose [21-23].
Dette kan delvis skyldes det faktum at en reell forskjell fra MSI tumorer hos MSI-høy og MSI-lav ikke kunne gjøres. Foreningen av MSI svulster med histologi av mucinkjertler adenokarsinomer, som ble beskrevet før, ble bekreftet i vår pasientpopulasjon [24].
Vår studie spørsmål ved om kopi nummer forandringer kan brukes som en prognostisk markør for prediksjon av tilbakefall av tykktarmskreft, spesielt i stadium II svulster. Ved hjelp av matrise-CGH analyse har vi identifisert gående CNAs blant pasienter med tykktarmskreft med ulike stadier og kliniske kjennetegn. Styrkene i vår studie er det høye antall pasienter og integrering av clinicopathological egenskaper. En annen styrke er at vi er begrenset studien til tykktarmskreft, fordi det er blitt foreslått før at det store avviket i publiserte studier er på grunn av det faktum at tykktarm og endetarm tumorer ble undersøkt sammen [25]. I vår studie, 97% av kolon tumorprøver har genomiske forandringer. Det faktum at antallet CNAs er høyere i fase II-MSS tumorer sammenlignet med MSI tumorer er blitt foreslått før, og ble validert ved Brosens et al. [14]. Nakao og kolleger fant også funnet en overhyppighet av kopinummerendringer hos pasienter med MSS mot MSI-H (20% og 5% henholdsvis). Dette gjaldt også for gevinster, tap, presiseringer og slettinger skille [26]. Også gruppen av Xie fant en lavere CNA prevalens i MSI kolorektal tumorer enn i MSS svulster [27]. Jo lavere antall CNAs i MSI svulster kan være en forklaring til det bedre utfallet av pasienter med en MSI tumor [20]. Våre resultater bekrefter at pasienter med stadium II svulster, og mer spesifikt med pT3N0 svulster utstilling høyfrekvente MSI, har en bedre prognose. Deres prognose synes å være verre når de ble behandlet med adjuvant kjemoterapi basert på 5-FU [28].
Forsterkning av kromosom 13 og 20 og tap av kromosom 18 er de vanligste genomisk endringer i tykktarm kreft og disse funnene var bekreftet i vår studie [29]. I tillegg ble andre tilbakevendende gevinster og tap på hel-kromosomer funnet. Gevinst ved 1Q, 7, 8Q, 13, 20 og 20Q og tap på 1p, 4, 8 p, 14, 15, 17p, 18, 21 og 22 ble det meste funnet. Forekomster av disse CNAs er i overensstemmelse med rapporterte data, men de ble aldri rapportert alt sammen i en studie [15-17,25,30,31]. Tap av kromosom 1p og forsterkning av kromosom 1q er mest sannsynlig fører til dannelsen av en isochromosome, som er tilstede i 5% av vår pasientpopulasjon. I litteraturen er det svært lite informasjon om dannelsen av isochromosomes i CRC cellelinjer og enda mindre i pasientprøver [15,32]. Mer informasjon om funksjonaliteten til denne isochromosome dannelse kan bli funnet ved å forlenge pasientens kohort.
Statistisk analyse viste at tap av kromosomer 1, 3, 4 og 9 ble koblet med en kortere overlevelse. På den annen side er forsterkningen av kromosomer 7 og 20 forbundet med en bedre 2-års OS. Videre fant vi en sterk signifikant sammenheng for tap av kromosom 4 og tilbakefall av sykdommen. Tidligere studier har vist, både ved karyotyping og med meta-analyse av CGH studier, at tap av kromosom 4 er assosiert med dårlig klinisk resultat [15,33]. Mer spesielt, i trinn II tykktarmskreftpasienter, tap av kromosom 4q er allerede blitt forbundet med sykdoms tilbakefall [14]. Tap av kromosom 4 synes derfor å være en viktig begivenhet i etiologien av tykktarmskreft og kan brukes som en prognostisk markør for tilbakefall i denne sykdommen.
Tumor genomer ofte har mange subchromosomal og fokale forandringer ved siden av endringene av komplette kromosomer og kromosomarmer [34,35]. De matrise-CGH data i denne studien viste en gjennomgående endret locus, 16p13.3, som inneholder
RBFOX1 (RNA bindende protein
,
fox-en homolog)
genet. Dette locus har ikke blitt rapportert som tilbakevendende endring med en klar rolle i utfallet i andre rekke-CGH studier med en akseptabel mengde pasienter med CRC [14-17,25,32,33]. Bare noen få studier har nevnt genetiske endringer på 16p13.3 i CRC [27,30,31]. Våre resultater bekrefter de sistnevnte studiene. I vår studie ble to SROs i denne locus knyttet til viktige kliniske parametre. Forsterkning av den distale 5 MB del av locus ble funnet i 9% av pasientene i denne studien. Tap av exon 3 og 4 i
RBFOX1
-genet var til stede i 26% av pasientene, med tilstedeværelse av en homozygot delesjon av
RBFOX1
i en tredjedel av dem. For å utelukke muligheten for et konstitusjonelt kopi nummer variant, ble normalt vev testet og funnet å være normal. Derfor kan 16p13.3 endring bli klassifisert som en somatisk variant, bare til stede i kreftceller.
Pasienter med en 16p13.3 endring ble funnet å vise flere CNAs enn pasienter uten en endring av 16p13.3 locus. Dette gjelder for alle tumor faser sammen, så vel som for hver tumor trinn separat. En gevinst i 16p13.3 locus var assosiert med en dårligere RFS for alle stadier sammen samt for stadium II svulster separat, noe som er et svært interessant funn på grunn av den høye kliniske behov for nye prognostiske markører i stadium II tykktarmskreft. I forskjellige solide tumortyper, som bryst, lunge, hepatocellulær og kreft i bukspyttkjertelen gevinst på 16p13.3 var assosiert med sent stadium sykdommen, lavere overlevelse og dårlig differensiering og et sent stadium sykdommen [36-39]. Ulike gener som ligger på 16p13.3 locus ble antatt å være innblandet i dårlig prognose: i lungekreft
TSC2
ble brakt frem, i bukspyttkjertelkreft
PDPK1 product: [37,39]. Den 16p13.3 locus bærer totalt 167 kjente proteinkodende gener som
AXIN1
,
RAB40C Hotell og
RAB26
er viktige gener i CRC. Det hadde allerede vært vist at
AXIN1
ble mutert i kolorektal kreft og villtype kan indusere apoptose i kolorektal kreft celler [40].
RBFOX1
genet er også plassert i denne regionen. Bare noen tidligere publikasjoner vurderer dette genet i CRC ble funnet. En siterer spesielt høy forekomst i Bangladesh befolkning med tidlig stadium CRC [41]. Sammenheng med utfallet ble ikke undersøkt i denne lille pasientgruppen.
