Abstract
Sensoriske nevroner gi viktige tilbakemeldinger til mønstergenererende motorsystemer. I krepsdyr stomatogastric nervesystemet (stns), tilbakemeldinger fra fremre mage reseptor (AGR), en muskel reseptor nervecellen, former aktiviteten av motorkretser i stomatogastric ganglion (STG) via polysynaptiske baner som involverer anterior ganglia. AGR soma ligger i rygg ventrikkel nerve posterior til STG, og det har vært antatt at dens axon passerer gjennom STG uten å knytte kontakter. Ved hjelp av høy oppløsning konfokalmikroskopi med dye-fylt nevroner, viser vi her at AGR fra krabbe
Kreft borealis
har også lokale anslag innenfor STG og at disse anslagene danne kandidatkontaktsider med STG motoriske nerveceller eller med synkende inngangsfibre fra andre ganglia. Vi utvikler og utnytte en ny maskering metode som tillater oss å potensielt separat presynaptiske og postsynaptiske farging av synaptiske markører. AGR prosesser i STG vise mangfold i form, antall filialer og forgrening struktur. Antallet AGR anslagene i STG varierer fra en til tre enkle å formere forgrenede prosesser. Anslagene kommer i nær kontakt med mage motoriske nevroner og synkende nevroner og kan også være elektrisk koblet til andre nerveceller i stns. Derfor, i tillegg til godt beskrevet langsløyfereaksjonsveier, er det mulig at AGR er involvert i integrasjon og mønster regulering direkte i STG.
Citation: Goeritz ML, Bowers MR, Slepian B, Marder E (2013) Neuropilar Anslag av fremre Gastric Receptor Neuron i Stomatogastric Ganglion av Jonah Crab,
Kreft Borealis
. PLoS ONE 8 (12): e79306. doi: 10,1371 /journal.pone.0079306
Redaktør: Melissa J. Coleman, Claremont høyskoler, USA
mottatt: 04.03.2013; Godkjent: 20 september 2013; Publisert: 03.12.2013
Copyright: © 2013 Goeritz et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Støttet av National Institutes of Health gi NS 17813-32 til Eve Marder. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Sensory tilbakemelding fra muskelreseptorene former motor neuron aktivitet i mono- og disynaptic ( «short-loop») strekk eller motstand reflekser. I tillegg har de fleste refleks trasé har polysynaptiske ( «long-loop») komponenter som er avgjørende for å tilpasse reflekser til ulike atferdsmessige tilstander. Faktisk kan fase-spesifikke sensoriske tilbakemelding til virveldyr og virvelløse dyr motoriske nerveceller i løpet av rytmisk motorisk aktivitet forårsake reflekser for å reversere eller bli en del av rytmegenerer nettverk selv [1-7].
De underliggende mekanismene for sensorisk integrasjon under refleks modifikasjon ikke er fullt ut forstått. Men mange funksjonelle aspekter av tilbakemelding integrasjon, for eksempel presynaptisk inhibering og antidromic spiking, kan knyttes til strukturer av motor eller sensoriske nevroner [8]. Undersøke morfologi av et nevron i detalj åpner døren til interessante spørsmål. Hvordan variabel er strukturer av identifiserte nevroner over enkelte dyr? Hvilke parametere må bevares for å opprettholde konsistent funksjon i et nettverk? Disse spørsmålene er spesielt vanskelig å håndtere i store nettverk hvor celletype identifikasjon er tvetydig og forverret av kompliserte forgrening strukturer.
Det er en stor mengde bevis for forskjellige regler som regulerer aspekter av cellemorfologi under nettutbygging. Fordelingen av tiltrekkende og avstøtende molekyler og de respektive reseptorer i den tredje ryggmargen kan bestemme posisjonen til soma, axon vekst kjegle veiledning, og midtlinjen kryssing av axon [9-13]. Formen og plasseringen av samme nervecellen imidlertid ofte variere fra dyr til dyr, sett i krepsdyr stomatogastric ganglion (STG) hvor bare noen av funksjonene i nervecellen morfologi deles på tvers av dyr [14-16]. For bedre å forstå disse aspektene av neuron morfologi, her ser vi en sensorisk nervecelle i STG som er involvert i et rikt sett med refleks trasé, men har en relativt enkel forgrening struktur.
Rytmisk aktive nettverk i stomatogastric nervesystem (stns) kontroll bevegelse av krepsdyr magemusklene. Under mage mill aktivitet, er protraction og tilbaketrekking av magen tennene kontrollert av samordning av mage mill nettverk [17]. Som i hummer og kreps, den Anterior Gastric Receptor (AGR) i
C. borealis
har en bipolar soma som ligger i den i rygg ventrikkel nerve (DVN) eller, sjeldnere, i bakre del av STG og prosjekter til rygg gastrisk nerve (DGN) [18]. Bilaterale dendritter prosjektet inn i to mage mill 1 (
GM1
) muskler der toppene er initiert i nærheten av de
GM1
muskler [19]. AGR axon prosjekter i en lang løkke sti gjennom STG og gjør stimulerende og hemmende forbindelser i fremre paret kommissurale ganglia (varekost) med projeksjon nevroner som fôrer tilbake til STG motorkretser [17,20-24].
Den eneste AGR er en muskel kraft reseptor i
GM1
muskler. AGR neuron integrerer proprioseptive informasjon fra begge sider av dyret, men også fungerer på samme måte som en interneuron ved å påvirke gastrisk og pyloriske nettverk aktivitet, uavhengig av dens reseptor-steder [25]. Flere dendrittiske og aksonal spike innvielse soner svare på ulike nevromodulatorer [21,24-27]. Videre neuropeptides skifte AGR avfyring mellom tonic spiking modus eller sprengning modus, som hver aktivere en annen mage motor mønster [28]. Nyere arbeider har vist at handlingene til AGR er påvirket av andre sensoriske nevroner (Barriere et al., 2008), og at effekten av AGR avfyring avhenger av når den er aktiv under mage mill rytmer (Smarandache et al., 2008).
Så langt er alle disse fysiologiske handlinger på mage og pylorusstenose nettverk aktivitet har blitt tilskrevet den lange sløyfen polysynaptiske refleks vei gjennom fremre hjul. Ingen detaljert studie av AGR morfologi i STG eksisterer og, så langt, anslagene i STG neuropil har ikke blitt beskrevet. Vi tilbyr nå anatomiske beskrivelser av AGR projeksjoner inn i STG neuropil.
Metoder
Dyr og disseksjoner
Voksen Jonah krabber (
Kreft borealis
) ble hentet fra Commercial Hummer (Boston, MA). Alle dyr ble holdt i kunstig sjøvann tanker ved 10-13 ° C på en 12-timers lys /12-timers mørk syklus uten mat. Krabber ble bedøvet på is i 30 minutter. Disseksjonene ble utført som tidligere beskrevet [29] i avkjølt fysiologisk saltoppløsning bestående av: 440 mM NaCl, 11 mM KCl, 26 mM MgCl
2, 13 mM CaCl
2, 11 mM Trizma-base, 5 mM maleinsyre, pH 7,45.
Elektro
stns ble låst ned i en Sylgard-belagt parabolen. STG ble desheathed og intracellulære opptak fra somata og neuropil ble gjort med 12-40 mÊ glassmikroelektroder fylt med 0,6 M KSO
4 og 20 mM KCl, forsterket med 1x HS headstages og Axoclamp 2A og 2B forsterkere (Molecular Devices) . Ekstracellulære aktivitet ble registrert med rustfritt stål pin elektroder som ble plassert inn i vaselin brønner på motoriske nervene og forsterkes og filtreres med en differensialforsterker (AM-systemer). For identifisering av motoriske nevroner, ble intracellulære soma opptak matchet med ekstracellulære opptak fra den aktuelle motor nerve. Under innspillingen ble stns kontinuerlig superfuseres med avkjølt (9-13 ° C) saltvann
Cell fyller
somata eller aksoner ble fylt med enten:.
a. 2% Lucifer Yellow CH dipotassium salt (LY, Sigma, katalognummer L0144) i filtrert vann, etter
b. 4% tetramethylrhodamine-dekstran 3KDa, lysin fikses (TMR, molekylære prober, katalognummer D3308) i 0,2% KAc, etter
c. 4% neurobiotin tracer (Vector Laboratories) i 50 mM Tris-buffer og 0,5 M KCl, eller
d. 10 mM Alexa Fluor 568- eller 594-hydrazide natriumsaltet i 200 mM KCl (Molecular Probes, katalognummer A10441 og A10442).
For alle sporstoff, tips av lav motstand glasselektroder (3-16 mÊ) ble fylt igjen av kapillær virkning i 10 minutter. For TMR, ble baksiden av elektrodene fylt med 2M KAc, og etterlater en liten åpning mellom KAc og TMR i spissen. Lucifer Gule og Alexa Fluor-hydra ble injisert for 20-50 minutter med negative pulser av -3 til -11 nA på 0,5 s varighet på 0,1-1 Hz til de fine neuropil prosesser i cellen var synlige med et fluorescerende mikroskop (Leica MF165 FC). TMR og Neurobiotin ble injisert i minst 50 minutter ved hjelp av 3 nA positive strømpulser (neurobiotin) eller 4-13 nA positive strømpulser (TMR) på 0,5 s varighet på 1 Hz. Med mindre annet er angitt, ble preparatene fiksert med 3,5% paraformaldehyd i fosfat-bufret saltvann (PBS; 440 mM NaCl, 11 mM KCl, 10 mM Na
2HPO
4, 2 mM KH
2PO
4 , ph 7,4) i 40 til 90 minutter ved romtemperatur i løpet av 3 timer etter fylling med LY, neurobiotin og TMR og innen 30 minutter etter fylling med Alexa Fluor-hydra. Preparatene ble vasket med 0,01 M PBS-T (0,1 til 0,3% Triton X-100 i PBS) og lagret i 0-7 dager ved 4 ° C før behandling.
Dye forsterkning
LY signal ble forsterket ved tilsetning av et polyklonalt kanin-anti-Ly-antistoff (1: 500; Molecular Probes) og hensiktsmessig Alexa Fluor-konjugert sekundært anti-kanin-antistoff ( 1: 500; Molecular Probes) i løpet immunohistokjemisk prosessering. Neurobiotin ble visualisert ved tilsetning av streptavidin-konjugert Alexa Fluor fargestoffer. (1: 500, molekylære prober) til det sekundære antistoff mix (se neste avsnitt)
Immunohistochemistry
Vi brukte en rotte monoklonalt antistoff mot substans P antistoff til å merke
Kreft borealis
tachykinin-relatert peptid (CabTRP, Nøyaktig Kjemisk og Scientific, Westbury, NY, # NC1 /34HL, 1: 300 fortynning) [30,31], et monoklonalt antistoff mot Drosophila synapsin GST-fusjonsprotein (SYNORF1, [32]; utviklingsstudier Hybridom Bank (Univ Iowa), # 5F10, 1. 500 fortynning), og en kanin polyklonale antistoff mot Lucifer Yellow (Molecular Probes, katalognummer A-5750 , 1: 1000 fortynning). Antistoff spesifisitet for synapsin-aktig og CabTRP lignende immunolabeling i
C. borealis
ble tidligere demonstrert [30,31,33]. Antisera ble fortynnet i 0,01 M PBS-T ved den passende konsentrasjon og påføres over natten ved romtemperatur, etterfulgt av 6×10 minutter vaskinger med PBS-T
For sekundær deteksjon, Alexa Fluor -. Konjugerte geit polyklonale antistoffer mot mus eller kanin IgG (H + L-kjeder, sterkt kryss absorbert; Molecular Probes) ble anvendt for å visualisere immunreaktivitet. Antistoffene ble anvendt i en konsentrasjon på 1: 500 i PBS-T-i 2-3 timer ved romtemperatur. Forberedelsene ble deretter vasket 4×15 minutter i PBS. STGs ble deretter montert på pre-renset lysbilder (25x75x1mm, Superfrost, VWR) i Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA), med 9mm diameter, 0.12mm dybde silikon segl avstandsstykker (elektronmikroskopi Sciences, Hatfield, PA) under # 1.5 Dekk (Fisher Scientific).
statistikker
AGR prosess lengder ble analysert i Excel (Microsoft). Betydning ble testet med t-tester i Sigmaplot. Feil er standardavvik.
Bilde kjøp og behandling
Flislagte stabler av confocal bilder ble samlet inn med en SP5 CLEM mikroskopet med Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF) programvare. For flere etiketter, sekvensiell bildebehandling og trange utslipps innstillinger ble brukt for å hindre krysstale. Confocal bilder ble ervervet som fliser med en 63x glyserol objektiv (Leica HCX PL APO 63x /1.3 GLYC CORR CS (21 ° C) på 2048×2048 eller 1024×1024 oppløsning på 0,12 til 1,01 mikrometer trinn og deretter justert og sydd med et GUI-basert MATLAB verktøy skrevet av Ted Brookings. Bildestakker ble konvertert til .ims filer med Imaris 7,0-7,4 (bitplan) filtrert og ned-samplet til en tredjedel av oppløsningen i x- og y-dimensjoner. den Imaris Slice og overgå moduler ble brukt for å justere kontrast og lysstyrke og vise stabler som maksimal intensitet projeksjoner eller som Blend mode anslag. Delsett av z-stabler ble vist i blanding modus anslag med redusert opacity for å bedre visualisering av celle fyll og protein fordeling på samme tid. Filament og volum rekonstruksjoner av celle fills ble gjort med Imaris Filament modulen i manuell modus for å bestemme avdelings lengder og avdelings volumer.
Separasjon av synapsin-lignende merking i og rundt fylt prosesser
synapsin lignende immunoreactive merking innenfor fylt prosesser ble isolert fra det samlede synapsin lignende signal ved hjelp av overflate rekonstruksjoner av den fylte celle som en maske. De overflate rekonstruksjoner ble utført med Imaris Surface-modulen ved hjelp av en manuelt innstilt terskel for intensitet til å skille mellom bakgrunnen og cellefyll. Overlappingen av den rekonstruerte celleoverflate maske og den synapsin lignende immunoreaktivt signal ble lagret som en ny signalkanal ( «synapsin-inne»). For å fange synapsin-lignende merking i tilknytning til den fylte celle ble denne fremgangsmåte gjentatt med en ny overflate maske av den fylte celle, denne gang som genereres ved hjelp av en nedre terskel for intensitet, fange «skinnet» rundt celleoverflaten. Dette resulterte i en maske som over estimerte volumet av cellen og tillater oss å isolere synapsin-lignende merking i nærheten av den fylte celle ved å subtrahere «synapsin-inne» -signal fra dette nye signalkanal, ved hjelp av den «Channel aritmetikk «-funksjonen i Imaris.
det er viktig å påpeke at en høy samplingsfrekvens under bildet oppkjøpet, helst to ganger oppløsningen av den brukte objektiv (Nyquist rate), er kritisk for å unngå tap under påfølgende filtrering og å tillate tilstrekkelig nøyaktig overflate rekonstruksjoner.
Resultater
AGR prosjekter i den synaptiske neuropil
Vi brukte fargestoff fyller å spore AGR axon og sine prognoser i STG. Posisjonen av midtlinjen bipolar AGR i stns har tidligere blitt beskrevet (Combes et al., 1995) (figur 1). Posisjonen til soma i forskjellige preparater er noe variabel, slik soma kan finnes så mye som 500 mikrometer posteriort for STG i dorsal ventrikulære nerve (DVN), eller det kan sees ventralt under cellelegemer i den bakre region av STG, ganske nær STG neuropil.
Vi fant AGR anslagene fra hoved axon inn i neuropil av hver STG at vi undersøkte (N = 29) (figur 2). Confocal avbildning avslørt AGR anslag med varierende lengde og forgrening mønster i STG. Antallet AGR fremspring inn i det STG neuropil varierte fra en til tre, og deres morfologi var bemerkelsesverdig mangfoldig, fra minimalt til komplekst forgrenet (figur 2). Av de 29 fargestoff fylt AGR nevroner, 17 hadde en prosess forgrening av hoved axon inn i STG neuropil, 10 hadde to prosesser, og i to preparatene ble tre projeksjoner inn i STG sett. Fellestrekk som ble sett gjennom mange AGR celle fills ble krokformede grener i fremre del av ganglion (figur 2A) (N = 13 av 23 AGRs), grener som endte i klo-lignende prosesser (figur 2B) (N = 8 av 23 AGRs), og oppsvulmede hevelse av AGR prosesser (figur 2B) (N = 18 av 23 AGRs).
Prikkete linjer skissere neuropil området av ganglion i alle deler av figuren. A1. Volum-rendret syn på LY dye-fylt AGR med enkel projeksjon, forgrening videre inn i fire sub-grener i STG neuropil. AGR soma ligger i
stn
utenfor nederst i venstre hjørne av rammen. Blend mode projeksjon av 8 fusjonert confocal bildestakker, som hver består av 84 optiske skiver (ervervet ved oppløsning av 0.067μm x 0.067μm x 0.378μm). Scale bar er 30 pm. A2 viser nærbilde av eske området i A1, viser det utvidede slutten av AGR projeksjon i STG. Scale bar er 5 pm. B1. Volum-rendret syn på LY dye-fylt AGR med enkel projeksjon, forgrening videre inn i to korte sub-grener i STG neuropil. AGR soma ligger i
stn
utenfor nederst i venstre hjørne av rammen. Blend mode projeksjon av fire fusjonert confocal bildestakker, hver bestående av 226 optiske skiver (ervervet ved oppløsning av 0.174μm x 0.174μm x 0.294μm). Scale bar er 30 pm. B2 viser en volumgjengitt overflaten projeksjon av eske området B1 fra en annen vinkel, med vekt på stor ballong-lignende utvidelse (ikke soma) av aksonal AGR projeksjon. Scale bar er 10 um. C. Volum-rendret syn på LY dye-fylt AGR med enkel projeksjon, forgrening videre inn i to undergrener i STG neuropil. AGR soma ligger i
stn
utenfor nederst i venstre hjørne av rammen. Blend mode projeksjon av 5 fusjonert confocal bildestakker, hver bestående av 169 optiske skiver (ervervet ved oppløsning av 0.068μm x 0.068μm x 0.462μm). Scale bar er 30 pm. D. Volum-rendret syn på LY dye-fylt AGR med to enkle anslag i STG neuropil. AGR soma ligger i
stn
utenfor nedre venstre hjørne av rammen. Blend mode projeksjon av 18 fusjonert confocal bildestakker, hver bestående av 115 optiske skiver (ervervet ved oppløsning av 0.183μm x 0.183μm x 0.504μm). Scale bar er 30 pm. E. Volum-rendret syn på LY dye-fylt AGR med to anslag, hver forgrening videre inn i to eller tre sub-grener i STG neuropil. AGR soma ligger i
stn
utenfor nederst i venstre hjørne av rammen. Blend mode projeksjon av 10 fusjonert confocal bildestakker, hver bestående av 264 optiske skiver (ervervet ved oppløsning av 0.179μm x 0.179μm x 0.38μm), ventral visning av samme preparat som figur 3. Målestokk er 30 pm. F. Volum-rendret syn på LY dye-fylt AGR med tre anslag, en av dem forgrening videre inn i to undergrener i neuropil. AGR soma ligger i
stn
utenfor nederst i venstre hjørne av rammen. Blend mode projeksjon av ni fusjonert confocal bildestakker, hver bestående av 229 optiske skiver (ervervet ved oppløsning av 0.168μm x 0.168μm x 0.252μm). Scale bar er 50 pm.
Vi målte forgrenings egenskaper i 17 AGRs som ble fotografert med høy oppløsning (tabell 1). I preparater som bare har en enkelt AGR gren fra hoved axon, prosessen forgrenet i gjennomsnitt 3 ganger. Dens lengde varieres på tvers preparater og i gjennomsnitt 240 ± 136 um (standard avvik) (figur 2A-C). Antallet terminale segmenter var 1,7 ± 0,8. AGR prosesser med to fremspring inn i neuropil tendens til å være kortere i gjennomsnitt (176 ± 95,4 mikrometer for det første, p = 0,014, og 109 ± 94,41 um for den andre grenen), med litt flere individuelle under grener (2,5 ± 1,3 terminal segmenter), men på grunn av den store variasjon i gren tall, denne forskjellen ikke var statistisk signifikant (p = 0,160) (figur 2D-F). Det var heller ingen signifikante bevaring av total projeksjon lengde når vi normalisert for neuropil lengde (gjennomsnittlig neuropil lengde = 544 ± 81,1 um, N = 17) og sammenlignet den summerte gren lengde i blandinger med en eller to prosesser (p = 0,69) (tabell 1). Imidlertid, i preparater med to fremspring inn i neuropil, som vist i figur 2 D og E, jo mer bakre (nærmere AGR soma) prosessen var betydelig kortere enn den fremre fremspring (89 ± 73 um versus 168 ± 99 um, respektivt , p = 0,003).
Antall grener
N
en
st gren lengde
1
st gren lengde, normalisert for neuropil størrelse
2
nd gren lengde
2
nd gren lengde, normalisert for neuropil størrelse
3
rd gren lengde
3
rd gren lengde, normalisert for neuropil størrelse
Total gren lengde
Total gren lengde, normalisert for neuropil størrelse
18240 ± 136,2235 ± 118,3 —- 241 ± 136,2235 ± 118,32 7109 ± 94,189 ± 73,3176 ± 95,4168 ± 98,6 til -286 ± 94,8258 ± 85,93 2175 ± 219,2169 ± 202,372 ± 31,877 ± 18,160 ± 56,660 ± 48,6307 ± 103 306 ± 89.7Table 1. AGR forgrening egenskaper.
CSV ned CSV
Et annet påfallende anatomiske trekk var lokalisering av AGR grener med hensyn til ganglion arkitektur. STG somata er plassert i en klynge rundt neuropil i den bakre region av ganglion. Disse neuroner sende en primær neurite mot midten av ganglion (grov neuropil), hvor den forgrener seg trinnvis mindre prosesser og en eller flere av aksoner som forlater ganglion gjennom de tilkoblede nerver. De minste prosesser av STG nevroner er plassert i mellom midten av ganglion og cellelegemer på utsiden, hvor de danner den fine eller synaptiske neuropil, et skall-lignende struktur rundt den grove neuropil som er i det indre av ganglion (Figur 3) [34]. Den fine neuropil er området hvor synaptiske interaksjoner skje [35]. Det kan være merket med antistoffer mot presynaptiske proteiner slik som synapsin (synorf) [14,32,33,36]. Vi fant ut at AGR axon var noen ganger utenfor sentrum til høyre eller venstre, men kjørte alltid på den mest ventral side av STG (n = 27) (figur 3AB). Derfra AGR projiseres dorsalt gjennom grov neuropil ved midten av STG og inn i dorsal fin neuropil (figur 3B).
A1. Volum-rendret dorsal visning av LY dye-fylt AGR (grønn), projisert langs dorso-ventral aksen. A2. Lateral, maksimal intensitet projeksjon av samme ganglion. B1. Dobbel merking med anti-synapsin antistoff (lilla) avslører den synaptiske neuropil i STG. B2. Lateral projeksjon av anti-synapsin merket ganglion viser ventralt plassert AGR axon og dens rygg anslag i den synaptiske neuropil. Blend mode (A1, B1 og B2) og maksimal intensitet (A2) projeksjoner av 10 fusjonert confocal bildestakker, hver bestående av 264 optiske skiver (ervervet ved oppløsning av 0.179μm x 0.179μm x 0.38μm). Scale bar er 50 pm.
Lokalisering av kandidat kontaktsider mellom AGR andre celler
Vi ønsket å vite om AGR anslag kom i nærkontakt med andre STG nevroner. For dette har vi utført doble fyllinger av AGR og andre STG celler, med fokus på nevroner som er en del av mage mill nettverk, hvor AGR stimulering har de sterkeste effektene på nettverksaktivitet
in vivo Hotell og
in vitro
[24,25,37,38].
Doble fills av DG nervecellen og AGR i tre preparater avdekket flere områder av tilsynelatende tett kontakt på nivå med oppløsning tilgjengelig med konfokal mikroskop (figur 4A) . Vi utførte overflate rekonstruksjoner av en av disse parene for å få en bedre oversikt over den tilsynelatende kontaktsider. Det mest slående kandidat kontaktpunkt var ikke i den synaptiske (fine) neuropil, men i den grove neuropil i midten av ganglion, hvor en stor diameter prosess med DG ble observert tilsynelatende pakket rundt en AGR projeksjon. I tillegg ble en annen kandidat kontaktside AGR med en meget fin DG prosess sett i den synaptiske neuropil (figur 4A). Andre celler som kom inn i nær kontakt med AGR når vi utført dobbelt fyllingene var minst en av de fire mage-møllen nevroner (GM) (n = 3) og den ene side gastrisk neuron (LG) (n = 5). Nærmere inspeksjon av en dobbel fyll av GM nervecellen og AGR i to preparatene viste en enkelt kandidat stedet tydelig kontakt mellom to prosesser (figur 4B), tydelig sett i en overflate rekonstruksjon av kontakt området i innsatsen i figur 4B2. I samme forberedelse, veldig fine prosesser (~ 1 um diameter) av GM nervecellen også pakket rundt AGR axon (figur 4B3). Figur 4C viser en dobbel fyll av AGR og LG med kandidat kontaktsider på de større prosesser i den grove neuropil. Lignende kandidat kontaktsider ble sett i neuropil av fem ganglia med LG og AGR doble fyll.
A1. Dobbel Fyll av DG nervecellen med TMR (gul) og AGR neuron med LY (blå) viser kandidatkontaktsider i neuropil. Lateral blanding modus projeksjon av 18 fusjonert confocal bildestakker, hver bestående av 133 optiske skiver (ervervet ved oppløsning av 0.177μm x 0.177μm x 1.007μm). Scale bar er 40μm. A2. Rekonstruert overflaten visualisering av DG-AGR kandidat kontakt området i grove neuropil, rekonstruert fra de samme datasettet som A1. Scale bar er 10 um. B1. Dobbel fylle av en GM nevron med neurobiotin (grønn) og AGR neuron med Alexa Fluor 594-hydrazide (magenta). Blend mode projeksjon av 18 fusjonert confocal bildestakker, hver bestående av 185 optiske skiver (ervervet ved oppløsning av 0.088μm x 0.088μm x 0.504μm), background-trukket. Scale bar er 50 pm. B2. Nærbilde kandidat kontakt området i grove neuropil. Scale bar er 5 pm. En rekonstruert overflaten visualisering av kontakt området (innfelt i B2) gir et klarere syn. B3. Nærbilde kandidat kontakt området mellom gode neuropil prosesser av GM og AGR axon. Scale bar er 10 um. C. Dobbelt fylle av LG nervecellen med LY (grønn) og AGR neuron med Alexa Fluor 594-hydrazide (rød) viser tydelig kontakt området mellom LG primære neurite og AGR prosess. Blend mode projeksjon av 8 fusjonert confocal bildestakker, hver bestående av 155 optiske skiver (ervervet ved oppløsning av 0.177μm x 0.177μm x 0.336μm), background-trukket. Scale bar er 30 pm.
synkende projeksjon fibre
Ca 25 par med synkende nevroner prosjektet fra hjul og OG gjennom stomatogastric nerve
stn
til STG [39], hvor modulator frigjøring fra sine terminaler former aktiviteten av mage og pylorusstenose nevroner [40-43]. I fire forberedelsene, når vi fylt AGR med Lucifer Yellow for en lengre periode (2-3 timer), fant vi svake fargestoff spredning fra AGR til prosesser som var like i form til beskrevet projeksjon nevroner (figur 5A). Interessant, når vi gjentok eksperimentet med neurobiotin, et molekyl som passerer gjennom gap veikryss i krepsdyr nervesystemet, vi fikk ikke se noen kobling til andre celler. Vi ønsket å vite om de fargestoff kombinert prosesser i STG var projeksjoner av den moduler kommissurale Neuron 1 (MCN1), et par av regulerende celler i COG som aktiveres og regulert av AGR aktivitet via lang sløyfe trasé gjennom
stn Hotell og hjul, og lokke fram en gastric mill rytme [37,42-44]. MCN1 inneholder tre regulerende peptider i sine prognoser i STG; en av dem er en tachykinin-lignende peptid, CabTRP1a. Som MCN1 er den eneste kilde til tachykinin-lignende peptid i STG kan de to MCN1 anslagene i STG være spesielt merkes med et anti-substans P-antistoff, som gjenkjenner takykinin-lignende peptider på tvers av mange forskjellige arter [30,31]. Vi utførte immunolabeling av CabTRP å visualisere MCN1 terminaler i tre ganglia med dye-spredning fra AGR til
stn
prosesser. I en av disse preparatene, et dye-kombinert
stn
prosess merket positivt for CabTRP og derfor var sannsynlig MCN1. I de to andre preparater, har de to MCN1 fremspring ikke er sammenfallende med fargestoff-koblede prosessen i STN (figur 5B). Men når vi spilte dobbel merking av AGR og CabTRP i ganglia uten dye-spredning, vi konsekvent funnet minst en av AGR filialer i umiddelbar nærhet eller pakket rundt en MCN1 axon før det arborized i neuropil (figur 5C-D) ( N = 7 av 7).
A. Langsiktig (2 timer) LY dye-fill av AGR nevron (magenta) viste dye-kombinert synkende STN fibre. B. Double merking for CabTRP i samme forberedelse viser at de fargestoff kombinert STN fibre var ikke MCN1 anslag. A og B er Blend Mode projeksjoner av 12 fusjonert confocal bildestakker, hver bestående av 200 optiske skiver (ervervet ved oppløsning av 0.187μm x 0.187μm x 0.504μm). Scale bar er 50 pm. C. AGR prosesser (LY fargestoff fylt, magenta) er i nær apposisjon til anslag fra de MCN1 neuronene som var merket med et anti-substans P-antistoff (grønn). Blend mode projeksjon av 12 fusjonert confocal bildestakker, viser en 47μm tykk mid-delen av ganglion (127 av 210 optiske skiver, ervervet ved oppløsning av 0.187μm x 0.187μm x 0.713μm). Scale bar er 50 pm. D. Et nærbilde av neuropil viser en klo-lignende avslutning av LY dye-fylt AGR projeksjon (magenta) i nær kontakt med fine MCN1 prosesser (grønn), og to forskjellige AGR terminaler i åpenbar kontakt med større diameter MCN1 prosesser (piler). Blend mode projeksjon av 24μm tykk midtseksjon i samme preparat som 4B, roteres 180 ° rundt dorso-ventral aksen (66 av 210 optiske skiver, ervervet ved oppløsning av 0.187μm x 0.187μm x 0.713μm). Scale bar er 15 pm.
Til slutt utførte vi dobbelt opptak av AGR og uidentifiserte prosesser i stomatogastric nerve (STN) (figur 6). Vi registrerte fra 1-5
stn
aksoner per ganglion. I de fleste gangliene når begge celler ble overvåket intracellulært, fant vi ingen
stn
prosesser som ble elektrisk koblet til AGR (N = 7). Men ved en anledning elektrisk kobling på dagens injeksjon i enten AGR eller uidentifiserte STN prosessen ble sett og
stn
prosessen var dye-fylt. Innsatsen i Figur 6A viser en overflate rekonstruksjon av et område med tett kontakt mellom AGR og dette synkende uidentifisert
stn
prosess i den fine neuropil. Dessverre var vi ikke i stand til senere å finne, ta opp fra, eller fylle den samme
stn
projeksjon i andre ganglia.
Double fylle av en uidentifisert STN prosess med LY (grønn) og AGR neuron med Alexa Fluor 594-hydrazide (magenta) viser nær apposition av prosesser over et stort område i STG neuropil. Rekonstruert overflaten visualisering av 9 fusjonert confocal bildestakker, hver bestående av 229 optiske skiver (ervervet ved oppløsning av 0.168μm x 0.168μm x 0.252μm). Scale bar er 50 pm. Sett viser nærbilde av eske området, avslører tydelige kontaktsider mellom AGR projeksjon terminaler og fine prosesser av den uidentifiserte projeksjon nervecellen.
Antatte kjemiske synapser av AGR i STG
Vi neste nøye undersøkt fordelingen av potensielle synapser i AGR celle fylles. Vi har brukt overflate rekonstruksjoner for å separere synapsin-lignende immunreaktivitet i AGR fra signalet i resten av den synaptiske neuropil (se metodedelen). Figur 7A viser isolert synapsin signal overlappet med AGR cellefyll.
