Abstract
Preklinisk terapeutisk vurdering for tiden er avhengig av vekstrespons av etablerte humane cellelinjer xenopodet inn immunkompromitterte mus, en strategi som er vanligvis ikke prediktiv av kliniske utfall. Immunocompetent genmodifisert mus (GEM) avledede svulst allograft modellene har svært medgjørlig prekliniske alternativer og analysegrunnlag for klinisk lovende immunmodulerende midler. Skrivbart journalister er avgjørende for nøyaktig sporing av tumorvekst og respons, spesielt for metastaser. Dessverre, journalister som luciferase og GFP er fremmede antigener i immunkompetente mus, potensielt hindrer tumorvekst og konfunderende behandlingstiltak. Her vurderes vi verdien av reporter-tolerisert perler som leverallograft mottakere ved å målrette minimal uttrykk for en luciferase-GFP fusjon reporter til fremre hypofysen (kalt «Glowing hodet» eller GH mus). Luciferase reporter-GFP uttrykt i tumorceller indusert uønskede immunresponser hos villtype-mus, men ikke i GH mus, som transplantasjons verter. Antigenisiteten av optiske reportere resulterte i en reduksjon i både vekst og metastatisk potensial av den merkede tumor i villtype-mus sammenlignet med de GH mus. Videre kan reporter uttrykk også endre tumor respons på kjemoterapi eller målrettet terapi i en kontekstavhengig måte. Dermed GH mus og eksperimentelle tilnærminger vetted her gi konseptet validering og en strategi for effektiv, reproduserbar preklinisk vurdering av vekst og responskinetikk for spor svulster
Citation. Day CP, Carter J, Ohler ZW, Bonomi C, El Meskini R, Martin P, et al. (2014) «Glowing hodet» Mus: A Genetic Tool Aktivere Pålitelig Preklinisk bildebasert evaluering av kreft hos immunkompetente allografts. PLoS ONE 9 (11): e109956. doi: 10,1371 /journal.pone.0109956
Redaktør: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 29 april 2014; Godkjent: 09.09.2014; Publisert: 04.11.2014
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Data Tilgjengelighet:. Forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette prosjektet er finansiert helt eller delvis med føderale midler fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, i henhold til kontrakt nummer HHSN261200800001E . Dette arbeidet ble støttet delvis av den Developmental Therapeutics Program i Divisjon for kreft behandling og diagnostisering og egenutført Research Program for Senter for Cancer Research, NCI, NIH. Leidos Biomedical Research Inc. gitt støtte i form av lønn for forfatterne John Carter, Zoe Weaver-Öhler, Carrie Bonomi, Rajaa El Meskini, Philip Martin, Cari Graff-Cherry, og Lionel Feigenbaum, men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. De spesifikke roller disse forfatterne er formulert i § «forfatter bidrag «
Konkurrerende interesser:. Medforfattere John Carter, Zoe Weaver-Öhler, Carrie Bonomi, Rajaa El Meskini, Philip Martin, Cari Graff-Cherry og Lionel Feigenbaum er ansatt av Leidos Biomedical Research Inc. Leidos Biomedical Research Inc., er dedikert til en enkelt kontrakt for å drive Frederick National Laboratory for Cancer Research (FNLCR), et statlig finansiert Research and Development Center. Det er ikke involvert i noen sysselsetting, rådgivning, patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter etc. relatert til denne studien. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Den gjennomsnittlige medikament utviklet av store farmasøytiske selskapene har blitt anslått til å koste mellom 4 og 11 milliarder dollar [1], koster gjennomsnittlig kreftpasient ca $ 100 000 per år. Disse svimlende kostnader drives delvis av en manglende evne tidlig i utviklings rørledning til pålitelig identifisere stoffer som vil være effektiv, og den generelle godkjenning rate for en onkologisk forbindelsen er for tiden ca 5% [2]. Mye av denne feilen kan tilskrives utilstrekkelighet prekliniske modeller som brukes i terapeutisk evaluering. Historisk sett har prekliniske dyrestudier benyttes tiår gamle etablerte humane cellelinjer, transplanterte som xenografter subkutant i immunkompromitterte mus [3]. Dessverre har disse modellene hatt begrenset effekt-prediktiv verdi for legemiddelutvikling, men har vært ansett avgjørende for å bedre legemiddel produktivitet og pasientbehandling [4].
ferdighet prekliniske studier av kreft er knyttet til hensiktsmessigheten av dyremodell selv. Paramount er tilstedeværelsen av et fullt funksjonelt immunsystem, noe som er involvert i praktisk talt alle trinn av sykdomsutvikling, og kritisk bestemmer behandlingstiltak [5]. Tumorceller kommuniserer gjensidig og dynamisk med immunsystemet og andre microenvironmental celler i løpet av metastatisk progresjon og også etter terapeutisk intervensjon [6]. Dette samspillet er riktig modellert både i stedegne genmanipulerte mus (GEM) kreft modeller og ved orthotopic transplantasjon av GEM-avledet allografts (GDA står for) inn fullt immunkompetente vert mus [7], men ikke effektivt i dagens menneskelige kreft xenograft modeller. Til slutt bør terapeutisk og biomarkør evaluering ideelt stole på prekliniske kreft modeller recapitulating
naturlig forekommende
metastaser, den mest dødelige kreft fase.
medgjørlig prekliniske modeller krever evnen til å nøyaktig overvåke sykdomsutvikling og behandlingsrespons , legge til rette for innføring av relevante kliniske endepunkter [8]. Sykdom overvåking er viktig for metastaser og ellers undetectable svulster. Optisk avbildning av celler som uttrykker lette genererende proteiner dominerer for tiden overvåking teknologier på grunn av deres evne til å måle sanntid hendelser, kostnadseffektivitet og tidseffektivitet [9]. Men de fleste spormarkørproteiner, inkludert den populære ildflue luciferase (ffLuc) og maneter forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP), er xenobiotisk til pattedyr. Deres uttrykk naturligvis induserer forskjellige immunresponser hos immunkompetente dyr, noe som resulterer i inkonsekvent aktivitet [10], [11], avstøtning av transplantater [12] og undertrykkelse av metastatisk aktivitet [13], blander sammen gyldigheten av prekliniske konklusjoner. Dermed er effektiv bruk av xenobiotiske journalister begrenset til enten korttidsstudier, eller fullt immunsupprimerte dyremodeller, noe som begrenser prekliniske alternativer [9], [13].
For å overvinne disse problemene, har vi utviklet en GEM modell som er immun-tolerant både ffLuc og EGFP å tjene som en vert for transplantasjon av merket syngene svulster. Bruke rotte veksthormon (rGH) promoter, uttrykk for en ffLuc-EGFP fusjonsprotein ble rettet mot den fremre hypofysen, et ikke-immune privilegert område fjernt fra vanlige overvåkede organer i prekliniske studier, og dermed skape den «Glowing hodet» (GH) mus [14]. Vi viser at i villtype mus immunresponser indusert av xenobiotiske journalister vesentlig påvirke progresjon og terapeutiske reaksjoner fra Skrivbart transplantert svulster. Viktigere, bruk av pre-tolerisert GH mus reduserer eller eliminerer disse avvikene, noe som resulterer i mer pålitelige, medgjørlig prekliniske modeller.
Materialer og Metoder
Lentiviral vektorer
lentiviral vektor som uttrykker ildflue luciferase-forbedret grønt fluorescerende protein-fusjonsprotein (FerH-ffLuc-EGFP) ble tidligere beskrevet [10]. Det ble her modifisert for å fjerne EGFP og sette inn en intern ribosombindingssete (IRES) og histon H2B-merket EGFP (H2B-EGFP) for å generere FerH-ffLuc-IRES-H2B-EGFP, som retter seg mot uttrykk for ffLuc og EGFP til cytoplasma og cellekjernen, henholdsvis. Detaljert informasjon om vektorsekvensen vil bli gitt på forespørsel til Dr. Dominic Esposito (e-post: [email protected])., Leidos Biomedical Research, Frederick, MD, USA
Dyr
for å redusere bioluminescence absorpsjon og eksperimentell variasjon, albino 6- til 8 uker gamle innavlet hunnmus på en C57BL /6 (C57BL /6
c-brd /c-brd /Cr) eller FVB /N bakgrunn ble anvendt som verter for transplantasjonsstudier. F1 mus fra oppdrett av C57BL /6 med 129 (B6, 129) mus ble brukt som isogene verter i studiet av NRas
Q61K /p19
ARF-null melanom, som ble hentet fra en blandet genetisk bakgrunn [ ,,,0],15], [16]. Alle dyr som brukes i dette forskningsprosjektet ble tatt vare på og brukt humant henhold til følgende retningslinjer: Den amerikanske Public Health Service politikk på Humane Stell og bruk av dyr (1996); Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr (1996); og amerikanske myndigheter Prinsipper for Utnyttelse og vedlikehold av virveldyr som brukes i testing, forskning og opplæring (1985). Alle mus forsøkene ble utført i henhold til dyrestudie protokoller godkjent av Animal Care og bruk Committee (ACUC), NCI, på Frederick National Laboratory for Cancer Research, som er akkreditert av AAALACi og følger Public Health Service politikk på Care og bruk av forsøksdyr. Følgende protokoller ble godkjent av ACUC for å utføre denne studien. ASP # 08-084, 11-044 og 11-058
Musene i denne studien ble avlivet av CO2 kvelning etter NCI-godkjente ACUC retningslinjer : (1) Overfør musene til et CO2 kammer rett før avlivning. (2) Slå på CO2 på 2 liter per minutt for en standard størrelse av kammeret. (3) Innenfor omtrent to til tre minutter, bør voksne mus være immobile og svarer; når dette er tydelig, øke strømningshastigheten for høy eller omtrent 10 liter /min. (4) Ved puste opphører for alle dyr sett gjennom buret, stille timeren i 2 minutter. Ved slutten av to minutter, kan mus bli fjernet fra CO2-fylte bur. Sikre død ved gjør at det ikke er noen bevegelser av noe slag i ytterligere 60 sekunder utenfor CO2 fylte bur, ved hjelp av tidsuret.
Generasjon av «Glowing hodet» muse
rGH hGH konstruere [17] (en gave fra Dr. Rhonda Kineman, University of Illinois-Chicago, Chicago, IL) ble modifisert ved innsetting av en ffLuc-EGFP fusjonsgenet for å generere den fremre hypofysen målretting vektor, som ble brukt til å generere transgene mus i begge de C57BL /6 og FVB /N genetiske bakgrunn av blastocyst mikroinjeksjon. Små kolonier av homozygote transgene mus ble opprettholdt til avl, og deres heterozygot avkom brukes for alle prekliniske studier. All den transgene og avlsarbeidet ble utført gjennom Laboratory Animal Science Program, Frederick National Laboratory.
Murine svulster, kreft cellelinjer, og deres merking
Lewis lungekarsinom (LLC) vev var opprettholdes bare
in vivo
siden dens avledning fra den opprinnelige tumor lunge fra C57BL /6-mus [8]. Den spontant metastasizing serie HGF-tg /CDK4
R24C melanom hud transplantasjon ble generert fra en primær melanom indusert i HGF-tg /CDK4
R24C C57BL /6 mus ved epikutan bruk av kreftfremkallende DMBA [18]. HGF-tg /CDKN2A
– /- melanom var avledet fra svulster indusert i HGF-tg /CDKN2A
– /- FVB mus ved UV-bestråling [19]. Disse svulstene ble opprettholdt bare i syngene mus. For transplantasjon, ble høstede tumorvevet delt i 3 mm x 3 mm stykker, og hver av dem ble innsatt i en 5 mm snitt på huden av en mus. MVT-1 murine brystcancerceller ble avledet fra brysttumorer av MMTV-c-Myc /MMTV-VEGF-bi-transgene mus på en FVB /N innavlet bakgrunn [20]. De ble etablert som en cellelinje og vedlikeholdt gjennom in vitro-kultur. For transplantasjon, ble 1,0 × 10
6 celler preparert fra kultur og injisert subkutant i hver mus. Mutant NRas
Q61K /p19
ARF-null melanomceller ble generert som beskrevet [15], [16]. I det første avsnittet, ble 1,0 x 106 celler fra in vitro kultur inokulert i C57BL /6×129 F1 mus for å danne svulster. I disse tekstene ble fragmentene delt fra høstet svulst brukes til transplantasjon, som beskrevet ovenfor.
For å markere den
in vivo
vedlikeholdt svulster, cellesuspensjoner fremstilt fra
in vivo
-Utvidet svulster ble smittet
ex vivo
med lentivirus av
ex vivo
spinoculation [10], [21]. LLC vev ble infisert med lentivirus koding ffLuc-EGFP eller ffLuc-IRES-H2B-EGFP og deretter utsatt for
in vivo
sykling for å få jevnt-merket svulster, som beskrevet tidligere [8]. Cellelinjer ble merket med ffLuc-EGFP lentivirus
in vitro
, og EGFP
+ populasjoner ble isolert ved bruk av fluorescens-aktivert cellesorterer (FACS).
Prekliniske studier og patologisk analyse
For prekliniske studier, en cryogenically bevart merket svulst ble gjenopplivet og utvidet ved subkutan transplantasjon i mus. Disse tumorene ble resektert ved å nå 500 mm
3 og ekspandert gjennom passasjen inn i det nødvendige antall mus for selve studiene som er beskrevet i teksten. Tumorstørrelse ble målt manuelt og beregnes ved V (mm
3) = 0,5 x L x W
2, hvor L er lengden og W er bredden i mm. For preklinisk modellering av primære svulster, ble musene randomisert i grupper i henhold til studere design når deres tumorer nådde 125 mm
3. Kontrollgruppen mottok bærer løsning, og den eksperimentelle gruppen mottok behandling med kjemoterapeutiske midler. Dosen og tidsplan i hvert forsøk er angitt i resultatene. Når svulster vokste til 2000 mm
3, mus hadde nådd sine endepunkter og ble avlivet for videre studier.
For prekliniske modeller for spontane metastaser, primære svulster ble kirurgisk fjernet ved oppnådd 500 mm
3, og musene ble randomisert i grupper ifølge studien design. Metastase og tilbakefall ble overvåket periodisk med CCD bruke Xenogen IVIS system [8] for å måle BL fluks (foton /sek /radial grad). Kontrollgruppen mottok bærer løsning, og den eksperimentelle gruppen mottok behandling med kjemoterapeutiske midler. Dosen og tidsplan i hvert forsøk er angitt i resultatene. Når musene viste tegn til sykelighet, definert av dyret studieprotokoll (for eksempel kort av breathiness, problemer i bevegelse), nådde de sitt endepunkt og ble avlivet for videre studier.
De legemidler som brukes i denne studien ble hentet fra Drug Synthesis Kjemi Branch, DTP, NCI (Bethesda, MD). Paclitaxel ble oppløst ved 10 x den ønskede konsentrasjon i 100% etanol, fortynnet med et likt volum Chremaphor EL og deretter fortynnet til 1 x konsentrasjon med saltløsning før intravenøs injeksjon i mus. Gemcitabin ble oppløst i vann og injisert intraperitonealt i mus. Crizotinib ble resuspendert i 0,5% metylcellulose i 0,9% saltvann, og gitt en gang daglig ved oral tvangsforing (PO) i løpet av en tre-ukers periode ved 10 ml /kg. Mus som bærer subkutane svulster ble randomisert til 3 grupper basert på tumormåling (200-500 mm
3), og behandlet med bilen alene, crizotinib på 50 mg /kg, eller Crizotinib på 100 mg /kg.
Høstet vev ble fiksert i 10% formaldehyd og parafin-embedded. Tilstøtende seriesnitt ble farget med hematoxylin og eosin (H E) for histologisk analyse, eller brukes til GFP immunhistokjemi (ab6556, Abcam, Cambridge, MA, USA). Histopatologi ble utført av Dr. Miriam Anver (patologi og Histotechnology Laboratory, Leidos Biomedical Research, Frederick, MD). For kvantitativ analyse, ble lysbilder skannes ved hjelp av ScanScope XT system og bilder ble analysert ved Spectrum Plus patologi analyseprogramvare (Aperios Technologies, Vista, CA).
hormon og immunologiske markør analyse
Sera var fremstilt fra oppsamlet helt blod å følge konvensjonelle protokoller og lagret ved -80 ° C. Å analysere anti-GFP antistoff i serum, ELISA-plater (Nunc Maxisorp, katt # 439454, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) ble belagt med 31,25 ng av rekombinant GFP (MB-0752, Vector Laboratory, Burlingame, CA, USA) i hver brønn over natten ved 4 ° C. Den neste dag, sera og kontroll monoklonalt anti-GFP-antistoff (11814460001, Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) ble underkastet seriell fortynning med blokkeringsoppløsning (3% melk i fosfat-bufret saltvann [PBS]) for å nå området 1:25-1:2000 for det tidligere og 6.25-200 ng /ml for sistnevnte. 50 ul fortynnet serum eller kontroll-antistoff ble tilsatt til de belagte brønnene, etterfulgt av inkubasjon i en time ved romtemperatur. Etter vasking med PBS inneholdende 0,05% Tween 20 (PBST). Hest rødlig peroksyd (HRP) -konjugert geite-anti-mus-antistoff (115-035-062, Jackson Immunoresearch Laboratories) ved 1:1000 fortynning i blokkeringsløsning ble deretter tilsatt til hver brønn, etterfulgt av tilsetning av peroksidase-substrat (TMB 2- Component Micro peroxydasesubstrat Kit, 50-76-00, KPL, Gaithersburg, MD, USA) for fargeutvikling i henhold til produsentens anvisninger. Den A450 absorpsjon av platene ble målt ved hjelp av en mikroplateleser (VMax Kinetic ELISA Absorbance mikroplateleser, 97059-546, VWR Corp., Radnor, PA, USA). Muse veksthormon nivåene i sera ble analysert ved bruk av veksthormon (GH) ELISA kit (M0934, Biotang Inc., CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner som følgende. Sera ble fortynnet 2 ganger med RPMI 1640 medium, og standardløsninger ble fremstilt for konsentrasjonsområdet 0,3125 til 100 ng /ml. De standarder og prøver ble tilsatt i den angitte ELISA-platen, som ble inkubert ved 37 ° C i 40 min og vasket med vaskebuffer. Hver brønn ble deretter tilsatt med 50 ul vann og 50 ul biotinylert anti-GH-antistoff, og inkubert ved 37 ° C i 20 min. Etter vasking ble 100 pl av streptavidin-HRP konjugert tilsatt til hver brønn og inkubert ved 37 ° C i 10 min. Etter en annen vasking ble 100 pl av HRP-substrat-løsning tilsatt til hver brønn, inkubert ved 37 ° C i 15 min, etterfulgt av tilsetning av 100 ul stoppoppløsning. Den A450 absorpsjon av platene ble målt ved anvendelse Vmax mikroplateleser.
For å analysere celleoverflatemarkører, ble enkeltcellesuspensjoner fremstilt fra høstede milter mus og inkubert med 5 ul /ml av Fcy-reseptor-antistoff (14- 0161-85, eBiosciences, San Diego, CA, USA) for å blokkere for 20 min. Etter en vask med fargeløsning (PBS inneholdende 1% bovint serumalbumin [BSA]), ble de inkubert med 0,3 ul /ml rotte-anti-mus CD4 (550728, BD-Pharmingen, San Jose, CA, USA) eller CD8a ( 550281, BD Pharmingen-antistoff, eller isotype kontroll-antistoff (559 073, BD-Pharmingen) ved 4 ° C i 1 time, etterfulgt av vasking med farging oppløsning tre ganger. cellene ble så inkubert med 4 pl /ml Alexa 488- konjugert geit-anti-rotte-sekundært antistoff (A11006, Invitrogen, Grand Island, NY, USA) ved 4 ° C i 20 minutter. etter vasking med farging oppløsning tre ganger, ble cellene underkastet FACS-analyse (FACSCalibur, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) eller Cell Analyzer utstyrt med en filter optikk modul for FITC deteksjon å kvantifisere uttrykk for cellemarkører (Cellometer Vision, Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA, USA). dataene som genereres fra FACS og Cellometer Vision ble analysert og kvantifisert med programvare FlowJo (TreeStar, Inc. Ashland, OR, USA) og FCS Express (De Novo Software, Los Angeles, CA, USA), henholdsvis.
Statistisk analyse
Forskjeller i kvantitet distribusjon (f.eks tumorstørrelse, bioluminescens intensitet, CD8 /CD4-forhold) mellom studiegrupper ble analysert ved anvendelse av parametriske uparede t-test. For prekliniske studier, endepunktet var total overlevelse, definert som tiden før musen sykelighet i henhold til dyrestudie protokollen. Mus live på slutten av studien ble sensurert på denne datoen. Kaplan-Meier metoden og Mantel-Cox logrank-test ble utført for å sammenligne overlevelse av musegruppene. Statistisk signifikans ble etablert på
P
-verdi 0,05. Median overlevelsestid ble beregnet som den minste overlevelsestid for hvilken den overlevende funksjon nådde 50%. Beregningene ble gjort med GraphPad Prism 6 (La Jolla, California).
Resultater
Reporter aktivitet ffLuc-EGFP merkede murine svulster er inkonsekvent i immunocompetent syngene mus
den subkutant transplantert Lewis lungekarsinom (LLC) er en godt karakterisert metastatisk modell som nylig har blitt utnyttet i flere høyprofilerte prekliniske studier [22] – [24]. Vi har nylig hentet arkivert LLC vev aldri tilpasset cellekultur, og viste at etter transplantasjon og reseksjon metastase skjedde med svært kort ventetid i 90% av syngene WT C57BL /6 verts mus [8]. Her merket vi LLC med en ffLuc-EGFP-kodet lentivirus
ex vivo product: [10]. Siden viral transduksjon resultater i heterogen cellepopulasjon [25], utsettes vi dette merket svulsten til
in vivo
sykling å gjøre dem jevnt merket [8], [26]. Kort fortalt er mus med transplantert svulster overvåkes for metastaser, og metastatiske knuter vil bli slaktet for subkutan transplantasjon for å starte neste syklus. Siden hver nodul ble avledet fra en enkelt celle, svulsten avledet fra det er antagelig klonale. Derfor vil homogenitet bli styrket gjennom hver syklus. Som vist på fig. 1A, etter subkutant transplantasjon og reseksjon av den merkede LLC i fem mus, som oppstår metastaser ble lett oppdaget av
in vivo
bioluminesens (BL) bildebehandling. I denne passasje, selv om tumorer vokste i alle verter ble det metastaser detektert i bare on (# 160 i fig. 1A, nedre panel). Vi høstet lungene fra at mus og undersøkt det med
ex vivo
imaging (Fig. 1B, øvre panel). Den ujevnt fordelt BL intensitet reflekterte heterogenitet transduced celler i primærtumor (Fig. 1B, øvre panel). Vi samlet inn fra verts mus tre individuelle godt merket lungemetastaser, antas å være klonal, dele dem inn i fem fragmenter for transplantasjon i fem C57BL /6 mus. Merkede lunge knuter fra at mus ble samlet og transplantert inn ytterligere fem C57BL /6 mus; Men disse tumorene vokste deretter meget langsomt og /eller viste ingen påvisbar reporter aktivitet (Fig. 1B). Disse resultater viser at rapportøraktivitet i merkede celler ble ikke konsekvent opprettholdes over passasjer i syngeniske immunkompetente mus, selv etter klonal seleksjon.
A, murine Lewis lungekarsinom (LLC) celler ble infisert med ffLuc-EGFP-uttrykk lentivirus
ex vivo
, og subkutant transplantert inn i fem syngene albino C57BL /6 (c-Brd) mus (# 160-164). Reporter-aktivitet ble overvåket ved BL avbildning av subkutan tumorvekst (legeme) og lungemetastaser (bryst). På dag 15 etter inokulasjon, ble et metastatisk BL signal befinner seg i en av musene (# 160 i det nedre panel). B, The lunge ble høstet fra # 160, og en enkel glødende metastatisk nodule valgt å bruke
ex vivo
imaging (øvre panel) ble transplantert inn i fem c-Brd mus i andre passasje. Imaging Resultatene viste at reporteren aktiviteten ikke kunne konsekvent opprettholdt i de resulterende håndgripelig svulster (nedre panel).
For å finne ut om reporter konsistens var avhengig av tumortype, vi utvidet vår analyse til mus melanom. En NRas
Q61K-transformert, p19
ARF-mangel melanocyttisk cellelinje [15], [16] ble merket med ffLuc-EGFP lentivirus og transplantert subkutant i syngene immunkompetente mus. Etter reseksjon en høy BL lunge nodule ble valgt til subkutan transplantasjon i to mus (fig. S1 A, venstre panel). Begge tumorer oppviste en signifikant reduksjon i normalisert BL aktivitet under subkutan vekst (fig. S1A, høyre panel). Vi bekreftet disse resultatene i to andre modeller. Melanom celler høstet direkte fra en HGF-transgene /CDKN2A-knockout FVB /N mus ble transduced med ffLuc-EGFP genet
ex vivo
, og transplantert subkutant i syngene FVB /N mus. Mens alle svulster vokste, ble BL intensitet enten redusert eller økt saktere (Fig. S1B), og BL intensitet /størrelsesforholdet, tjenestegjorde som merking oppbevaring indikator, ble redusert i tre av fem svulster. I en annen modell, ffLuc-EGFP-uttrykkende mus MVT-en brystcancerceller transplantert inn i orthotopically melkefettputer fra syngene FVB /N mus viste også dårlig retensjon av BL-signalering (se nedenfor). Vi konkluderer med at ffLuc-EGFP uttrykk i allografts i immunocompetent villtype (WT) mus er inkonsistent opprettholdes mellom mus og /eller passasjer, uavhengig av tumortype, genetisk bakgrunn eller transplantasjon nettstedet.
Generering av et GEM modell immunologisk tolerant til GFP og luciferase journalister
Våre resultater antydet at immuniteten til xenobiotiske reporter genprodukter er i stor grad ansvarlig for deres inkonsekvens i sammenheng med en fullt fungerende immunsystem. For å omgå dette problemet, vi generert C57BL /6- og FVB /N-baserte GEM modeller erkjenner ffLuc og EGFP proteiner som selv. For sin høye spesifisitet, RGH gensekvenser [17] (Fig. 2A) var ansatt for å målrette uttrykk for en ffLuc-EGFP fusjonsgenet til fremre hypofysen av musen, og dermed unngå å forstyrre signalering fra de vanligste metastaser.
En Struktur av uttrykket vektor for generering av Glowing Head (GH) transgene mus. Uttrykk for en ildflue luciferase-EGFP fusjonsgenet (ffLuc-EGFP) ble rettet til muse fremre hypofysen ved hjelp av rotte veksthormon promoter (rGH) og veksthormon gensekvenser, som inkluderer en polyadenylylation nettsted (hGHpA)
20. B, Optisk uttrykk mønster av transgenet i GH mus som visualisert ved BL bildebehandling. Reporter aktivitet ble registrert i fremre hypofysen av begge kjønn og testiklene til hannmus. C er serumnivået av veksthormon fra alderstilpassede GH mus og villtype (WT) c-Brd mus ble vurdert ved ELISA (gjennomsnitt ± SE). Blod ble tatt ut ved den samme tid på dagen. Ingen signifikante forskjeller i sirkulerende veksthormon nivåene mellom GH og WT mus ble funnet. D, ffLuc-EGFP-merkede LLC svulster ble subkutant transplantert inn i WT, GH, og NOD-SCID mus. Blod ble trukket tilbake for å klargjøre sera når tumorene nådde 500 mm
3, og serumnivåene av anti-GFP-antistoff ble analysert ved hjelp av ELISA. Nivåene av anti-GFP-antistoff i WT mus er betydelig høyere enn de i GH og NOD-SCID-mus (p 0,005), men ingen forskjell ble funnet mellom de i GH og NOD-SCID-mus (p = 0,19). Sera fra friske musene uten tumortransplantasjon fungerte som kontroller for å definere nullpunktet.
Den fremre hypofysen er ikke en immun-privilegerte stedet, og er dermed en del av systemisk sirkulasjon [27]. De transgene-kodet ffLuc og EGFP proteiner uttrykt i fremre hypofysen under embryonal utvikling deltar derfor i valg av T- og B-celler og er anerkjent som selvantigener, noe som resulterer i deres tolerering. For å redusere lys absorpsjon av pigment i ffLuc-EGFP transgen ble avlet inn i albino C57BL /6F (c-Brd) bakgrunn. Grunnlegger linjer ble valgt ut fra hver stamme som viste mendelsk transgen arv og normal fruktbarhet. I vår tidligere undersøkelser har vi identifisert påvisningsgrensen for BL signal fra mus in vivo avbildning var 1,5 x 10
5 foton /sek /radian [8]. For å unngå mulige konfunderende effekter forbundet med høy transgene uttrykk, disse grunnlegger linjene stiller lav men konsekvent BL signal ovenfor bakgrunnsstoff (ca 2-6 × 10
5 foton /sek /rad) ble valgt (Fig. S2A). I samsvar med målretting rapportert for rGH arrangøren [17], BL-signalet var tydelig i hodet og testiklene av transgene linjer (figur 2B.); beskjedne signal kan også påvises i skjoldbruskkjertelen, men bare ved hjelp av
ex vivo
imaging (ikke vist). Den BL-nivåer i kroppen av GH mus er nær de i WT mus, noe som indikerer den høye spesifisitet av transgenet (fig. S2B). Basert på tuftene av reporter aktivitet og rGH promoter brukes til å målrette disse perler ble kalt «Glowing hodet» (GH) mus.
Den mulige virkningen av transgene uttrykk på hypofysefunksjonen ble evaluert ved å sammenligne sirkulerende veksthormon nivåene i GH og WT C57BL /6 mus. Vi fant at serumnivåer av veksthormon var ikke signifikant forskjellig mellom transgen og WT (Fig 2C.), Uavhengig av kjønn, noe som indikerer at uttrykk for ffLuc-EGFP transgenet ikke åpenlyst påvirke fremre hypofyse funksjon i GH mus.
for å vurdere de immunologiske konsekvenser av reporter uttrykk, celler fra ffLuc-EGFP-merkede LLC tumorer ble transplantert subkutant inn i GH og WT C57BL /6-mus samt MHC-sidestykke, redusert immunforsvar non-obese diabetic /alvorlig kombinert immunsvikt (NOD /SCID) mus (BALB /c bakgrunn). Når tumorer nådde 500 mm
3 blod ble tatt ut og sera testet for tilstedeværelse av anti-GFP-antistoff. Mens tumor-bærende WT mus besatt signifikante nivåer av sirkulerende anti-GFP-antistoff (fig. 2D og S2C fig.), Ble det ingen signifikant forskjell finnes mellom tumor-bærende GH og NOD-SCID-mus, som er kjent uskikket til å produsere antistoff (Fig . S2C). Disse dataene viser at mens immunogen i WT mus, er ffLuc-EGFP tolerert og anerkjent som selvstendig i GH mus.
Vekst og metastasering av tumorceller uttrykker Skrivbart xenobiotiske journalister er endret på WT og NOD /SCID-mus i forhold til GH mus
for å teste funksjonen til GH mus implantert vi ffLuc-EGFP-merket svulster subkutant i syngene WT og GH mus. Selv om tumorstørrelse øket på samme måte i begge typer av verts mus, ble BL økninger i tumorer vesentlig forsinket i WT mus sammenlignet med mus GH (fig. S3A). Dette resultatet antydet at bruk av GH mus som leverallograft mottakere kunne hjelpe korrigere uoverensstemmelser observert i BL signaler fra merket svulster transplantert inn immunkompetente mus. For å validere dette punktet, testet vi GH mus i en større skala studie som involverer både primærtumor og metastaser. Metastatisk MVT-1 brystkreft celler [20], [28] ble omformet med ffLuc-EGFP lentivirus og transplantert orthotopically inn melkefettputer av GH eller WT syngene FVB /N mottaker mus. Merkede MVT-1-celler, viste en betydelig forbedring i BL signalering over tid når transplantert inn i GH mus sammenlignet med WT, som mislyktes i å beholde signalering (fig. 3A og høyere paneler av fig. S4A). Siden Skrivbart journalister er avgjørende for overvåking metastaser, ansvarlig for de aller fleste kreftpasient døde, ble primær MVT-1 tumorer resected og verts mus følges over tid.
