Abstract
I tillegg til proteinkodende gener, det menneskelige genom gjør en stor mengde ikke-kodende RNA. Lange ikke-kodende RNA (lncRNAs) er blitt beskrevet som den største underklasse av det ikke-kodende transkriptomet i humane ikke-kodende RNA. I de senere årene har lncRNAs vært ansett for å være de viktigste regulatorer av tumor atferd. I denne studien, basert på tidligere forskning, undersøkte vi uttrykket og biologiske rollen som en nylig identifiserte kreftrelaterte lncRNA,
lncRNA-uc002kmd
.
en
. Vi analyserte forholdet mellom
lncRNA-uc002kmd
.
1 Hotell og endetarmskreft (CRC) i totalt 45 CRC og parede prøver tilstøtende, ikke-svulstvev. Vi fant ut at
lncRNA-uc002kmd
.
en
uttrykk ble vanligvis sterkt uttrykt i karsinom sammenlignet med vevet ved siden av carcinoma. Gjennom en serie eksperimenter, viste resultatene at
lncRNA-uc002kmd
.
en
regulerer CD44 som en molekylær lokkedue for miR211-3p. Våre data indikerer at overekspresjon av
lncRNA-uc002kmd
en
forbedret celleproliferasjon i CRC
Citation:.. Wu X, Han X, Li S, Xu X, Chen X, Zhu H (2016) Long ikke-kodende RNA ucoo2kmd.1 Regulerer CD44-Dependent cellevekst ved å konkurrere om MIR-211-3p i tykktarmskreft. PLoS ONE 11 (3): e0151287. doi: 10,1371 /journal.pone.0151287
Redaktør: Yifeng Zhou, Medical College of Suzhouuniversitetet, KINA
mottatt: 10 januar 2016; Godkjent: 25 februar 2016; Publisert: 14 mars 2016
Copyright: © 2016 Wu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. prosjektet ble støttet av en bevilgning fra Science Foundation Natural i Zhejiang-provinsen i Kina (LY16H160048). Også dette arbeidet ble støttet av et stipend fra Wenzhou Public Welfare Science and Technology Project (Y20140707), også ble støttet av en bevilgning fra Inkubasjon prosjekt The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University (FHY2014009). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en viktig folkehelseproblem globalt og er fortsatt en viktig årsak til kreftdødelighet i den industrialiserte verden, hovedsakelig på grunn av sin tilbøyelighet til å spre [1]. Det er den nest vanligste kreftdiagnose blant kvinner og den tredje vanligste blant menn [2]. Selv om prestasjoner i kolorektal kreft forskning er bemerkelsesverdig, nye og effektive terapeutiske strategier er fortsatt nødvendig. Letingen etter nye biomarkører for metastatisk progresjon i kolorektal kreft er presserende.
Lange ikke-kodende RNA (lncRNAs), som omfatter ikke-kodende transkripsjoner av mer enn 200 nukleotider, har blitt beskrevet som den største underklasse av ikke-kodende transkriptomet hos mennesker [3]. En betydelig mengde av tidligere forskning har fokusert på den regulatoriske og strukturelle rolle lncRNAs i flere viktige biologiske prosesser som kromosom inaktivering, celledifferensiering, genomisk imprinting og utvikling, og celleproliferasjon [4, 5]. I de senere årene, med et bredt rolle for lncRNA i kreftutvikling, økende antall studier på sin tilknytning til forekomsten av kreftutvikling (f.eks studier om CRC [2, 6], esophageal plateepitelkarsinom (ESCC) [7], og magekreft (GC) [8]) har blitt publisert. Til tross for disse funnene, vår nåværende kunnskap om de uttrykk mønstre og funksjonell rolle lncRNAs i CRC fortsatt begrenset.
Nylig, en studie fant en roman lncRNA i GC,
lncRNA-uc002kmd
.
1
, også kalt
GAPLINC
. Dette lncRNA danner en molekylær lokkedue for miR211-3p, som retter seg mot CD44 for degradering, og overekspresjon av
lncRNA-uc002kmd
.
en
kan derfor forbedre CD44 uttrykk ved å konkurrere om MIR-211- 3p, som bygger en modell for
lncRNA-uc002kmd
.
en
formidlet celle migrasjon og spredning i magekreft [9, 10]. Som en av de mest mulige stilk cellemarkører, spiller CD44 en nøkkelrolle i mange cellulære prosesser, inkludert kreft cellevekst og migrasjon [11]. I tillegg har tidligere studier vist at CD44 er et velkjent stamcellemarkør for CRC [12].
På grunnlag av denne informasjonen, vi hypotese i denne studien at
lncRNA-uc002kmd
.
en
kan spille en tilsvarende rolle i CRC. For å teste denne hypotesen, utledet vi en måte å avgrense transkripsjons aberrasjon av
lncRNA-uc002kmd
.
en
mellom CRC og sammenkoblede tilstøtende og ikke-neoplastiske vev.
materialer og metoder
forsøkspersonene
Homogen Han kinesisk består fagene som deltar i denne studien. Førtifem CRC og tilsvarende tilstøtende vevsprøver ble oppnådd fra pasienter ved First Affiliate Hospital of Wenzhou Medical University (Wenzhou). Det var ingen restriksjoner på alder, stadium av CRC, sex eller histologi. Ved rekruttering, ble hver deltaker planlagt for et intervju ved hjelp av en epidemiologisk spørreskjema, etter å ha gitt skriftlig informert samtykke. The Medical Ethics Committee of Wenzhou Medical University godkjent denne studien. De kliniske karakteristika av alle pasienter er listet opp i tabell 1, som beskrevet i detalj tidligere [13].
Cell kultur
Menneske kolorektal kreft cellelinjer, HCT116 og SW480, var kjøpt fra Celle Bank of Type Culture Collection av den kinesiske Academy of Sciences, Shanghai Institute of Cell Biology, og ble passert for mindre enn 6 måneder. Cellekultur prosedyrer har blitt publisert andre steder [13]. Celler ble dyrket ved 37 ° C i 5% CO
2 i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum, penicillin og streptomycin i en 10-ml kulturskål.
RNA-ekstraksjon og real- time kvantitativ polymerasekjedereaksjon
TRIzol
® reagens (Invitrogen) ble anvendt for å isolere total RNA fra celler og vev, i henhold til produsentens instruksjoner. Den relative genuttrykket av
GAPLINC
ble bestemt ved bruk av ABI Prism 7500 sekvens deteksjonssystem (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
GAPDH
ble anvendt som en indre standard kontroll, og alle reaksjoner ble utført in triplo [14, 15]. Primere som brukes for qPCR forsterkning inkluderte fremover GTTTCCTGGAAGGGCATTTT og omvendt CAATCAGGGCTCTTGGACTC.
Byggingen av reporter plasmider
Metoden for bygging av reporter plasmider har blitt publisert andre steder [9]. Den pGL3 promotervektor (GENECHEM) ble brukt til å konstruere plasmider pGL3-
lncRNA-uc002kmd
.
en
-3’UTR (plasmidet inneholder
lncRNA-uc002kmd
.
en
3’UTR) og pGL3- CD44-3’UTR. Alle konstruksjonene ble verifisert ved DNA-sekvensering.
Forbigående transfections og luciferase analysene
HCT116 og SW480 ble transfektert med reporteren plasmider ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, USA), i henhold til produsentens bruksanvisning. Bruk av Dual-luciferase reporter analysesystemet (Promega, Madison, WI, USA) for å måle luciferaseaktiviteten er i andre sammenhenger [16]. Tre uavhengige eksperimenter ble utført og hver gruppe inkludert 6 replikater.
Actinomycin D analysen
HCT116 og SW480 ble transient transfektert hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen) og co-transfektert med MIR-211-3p, som angitt, i 24 timer; cellene ble deretter utsatt for Actinomycin D (Sigma, St. Louis, MO). Cellene ble høstet og stabiliteten i
lncRNA- uc002kmd
.
1
mRNA ble analysert ved hjelp av kvantitativ revers transkriptase-PCR (QRT-PCR), som tidligere beskrevet [13].
Western blot
Western blot analyse ble utført for å vurdere CD44 og A-action uttrykk, som tidligere beskrevet [13]. The Western blotting-analyse ble gjentatt minst tre ganger.
Celleviabilitet analysen
Cell Counting Kit-8 (CCK-8) system (Dojindo Laboratory, Kumamoto, Japan) ble brukt til å måle celle levedyktighet, i henhold til produsentens instruksjoner [16]. Det var seks replikater for hver gruppe, og forsøkene ble gjentatt minst 3 ganger.
Statistiske analyser
Sammenhengen mellom uttrykket av
lncRNA-uc002kmd
.
1 Hotell og
CD44
genet i CRC vev ble undersøkt ved hjelp av enveis variansanalyse og lineære regresjonsmodeller. Forskjeller mellom gruppene ble vurdert ved hjelp av paret, 2-tailed t-test. En
P
-verdi av 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Cellular karakterisering av
LncRNA-uc002kmd
1
for å bestemme cellulær lokalisering av
lincRNA-uc002kmd
.
en
, nivåene av det kjernefysiske kontroll transkripsjon (
U6
) og cytoplasma kontroll transkripsjon (
GAPDH
mRNA) ble oppdaget av RT-qPCR i de nukleære og cytoplasmiske fraksjoner, henholdsvis. For HCT116-cellelinjen, avslørte QRT-PCR-analyse at (gjennomsnitt ± SEM) 89,8%
lincRNA-uc002kmd
.
1
ble påvist i atomfraksjonen, og 13,1% ble plassert i cytoplasmafraksjonen. Lignende resultater ble oppnådd med den SW480 cellelinje, spesielt 89,2% og 11,8%
lincRNA-uc002kmd
.
1
ble påvist i atomfraksjonen og de cytoplasmiske fraksjoner, henholdsvis (fig 1A) .
(A) nivåene av kjernefysisk kontroll transkripsjon (U6), cytoplasma kontroll transkripsjon (GAPDH mRNA) og
lincRNA-uc002kmd
.
en
ble vurdert av qRT- PCR i kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner. Dataene er gjennomsnitt ± SEM. (B) Northern blot analyse av
lincRNA-uc002kmd
.
en
uttrykk i CRC celler. (C) Maksimum CSF score til
lincRNA-uc002kmd
.
en
av analyse med PhyloCSF. Stillingen er -178,6075. (D)
lincRNA-uc002kmd
.
en
ble uttrykt på et høyere nivå i CRC vev i forhold til å matche CRC tilstøtende vev. Uttrykket nivået av
lincRNA-uc002kmd
.
en
ble analysert ved QRT-PCR normalisert til
GAPDH
. Data er representert som middelverdi ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter. (E) De lineære sammenhenger mellom
lincRNA-uc002kmd
.
en
uttrykk nivåer og CD44 mRNA ble testet. Den relative uttrykket verdien ble normalisert ved
GAPDH
uttrykk nivå. (F, G)
lincRNA-uc002kmd
.
en
uttrykk betydelig påvirket CD44 mRNA uttrykk. Knockdown av
lincRNA-uc002kmd
.
en
redusert CD44 uttrykk, mens ektopisk uttrykk for GAPLINC økt CD44 mRNA nivå. (H) Protein nivåer av CD44 ble undersøkt i CRC celler (HCT116-celler og SW480 celler) av Western blot.
LincRNA-uc002kmd
.
en
kunne påvises som en transkripsjon av den forventede størrelse av northern-blotting (fig 1B) i CRC-cellene. Samtidig, undersøkte vi koding potensialet i
lincRNA-uc002kmd
.
en
hjelp PhyloCSF, den PhyloSCF score er -178,6075, dette resultatet viste lav koding potensialet i
lincRNA -uc002kmd
.
en product: (fig 1c).
LncRNA-uc002kmd
.
en
er oppregulert i CRC vev
uttrykket nivået av
lncRNA-uc002kmd
.
en
ble undersøkt ved hjelp av real-time PCR i 45 par av CRC vev og matchet tilstøtende normalt vev. Detaljerte kliniske funksjoner er presentert i tabell 1.
lncRNA-uc002kmd
.
1
transkripsjoner ble uttrykt på et høyere nivå i svulstvev sammenlignet med tilstøtende normalt vev (fig 1D).
Association of
lncRNA-uc002kmd
.
1 Hotell og
CD44
i CRC
Vi testet sammenhengen mellom
lncRNA-uc002kmd
.
1 Hotell og
CD44
i ytterligere 15 par av CRC adjuvant ikke-kreft vev. Resultatene viste at pasienter med høyere
lncRNA-uc002kmd
.
en
uttrykk nivåer i CRC vev vises betydelig oppregulering av CD44 (
R
2
= 0,24,
P
0,05, fig. 1E)
Ved hjelp av spesifikke sirnas, knockdown av
lncRNA-uc002kmd
1
vesentlig redusert CD44 uttrykk, mens overekspresjon av
lncRNA-uc002kmd
.
en
forbedret CD44 mRNA nivåer (fig 1F og 1G). Western Blot Resultater konsekvent viste at knockdown av
lncRNA-uc002kmd
.
en
redusert CD44 protein nivåer i HCT116 cellelinje, mens overekspresjon av lncRNA-uc002kmd.1 økt CD44 protein nivåer. Lignende resultater ble funnet i SW480 cellelinje (fig 1 H).
LncRNA-uc002kmd
.
1
regulerer
CD44
uttrykk ved å konkurrere om Mir -211-3p
Tilfeldigvis miRNA kjent som MIR-211-3p ble spådd mål for både
lncRNA-uc002kmd
.
1 Hotell og CD44. For å bekrefte rollen MIR-211-3p i CRC celler, klonet vi 3 «UTR av CD44 og
lncRNA-uc002kmd
.
en
nedstrøms for en luciferase gen og co-transfektert disse reporterne med MIR-211-3p ligner i CRC celler. Som vist i figur 2A, MIR-211-3p betydelig redusert luciferase signaler på begge pressen. Videre målte vi CD44 og
lncRNA-uc002kmd
.
1
nivåer i CRC celler etter behandling med Mir-211-3p etterligner. Som forventet, CD44 og
lncRNA-uc002kmd
.
1
nivåene ble betydelig redusert (figur 2B). I tillegg til dette, tester vi uttrykket nivået av CD44 og MIR-211-3p i 15 par CRC vev, resultatene viser en negativ korrelasjon mellom miR211-3p og CD44 uttrykk nivåer (
R
2
= 0,24,
P
0,05;. fig. 2C)
(A) Begge
lincRNA-uc002kmd
1 Hotell og CD44 er målrettet av MIR-211-3p. MiR-211-3p betydelig redusert luciferase signaler om både
lincRNA-uc002kmd
.
1 Hotell og CD44. (B) Den CD44 og
lncRNA-uc002kmd
.
1
nivåer ble betydelig redusert. Dataene er gjennomsnitt ± SEM, normalisert til
GAPDH
. (C) De negative sammenhenger mellom
lincRNA-uc002kmd
.
1
uttrykk nivåer og CD44 mRNA ble testet.
Etter knockdown av
lncRNA- uc002kmd
.
en
av siRNA, klonet vi 3’UTR regionen CD44 inn en luciferase reporter og co-transfektert konstruksjonen med
lncRNA-uc002kmd
.
1
siRNA eller kontroll siRNA. Resultatene viste da at knockdown av
lncRNA-uc002kmd
.
1
signifikant reduksjon i intensiteten av luciferase. Alle disse resultatene antydet at Mir-211-3p kunne målrette
lncRNA-uc002kmd
.
1 Hotell og CD44, og at
lncRNA-uc002kmd
.
en
er nødvendig for de rike uttrykk for CD44 (fig 3A).
(A) reporteren vektor var co-transfektert til CRC celler, som ble behandlet av
lncRNA-uc002kmd
.
1
siRNA eller kontrollere siRNA. Luciferase signal ble betydelig redusert. (B) Celler ble høstet og stabiliteten
lncRNA-uc002kmd
1
mRNA ble analysert ved hjelp av QRT-PCR i forhold til tid 0 etter blokkering ny RNA-syntese med actinomycin D.; data er gjennomsnitt ± SEM, normalisert til
GAPDH
. (C) HCT116 og SW480-celler ble sådd ut i 96-brønners plater etter å ha blitt transfektert, og celleformering ble utført daglig i 3 dager ved bruk av CCK-8-analyse. Seks replikater for hver gruppe og forsøket gjentatt tre ganger. Data aremean ± SEM. *
P
0,05 sammenlignet med kontroller. (D) Det ble vist tumorvolumer av xenografter i hver gruppe 4 uker etter subkutant implanterte stabile CRC-celler. Midlere tumorvolumer fra seks nakne mus i hver gruppe er vist ved forskjellige tidspunkter. *
P
. . 0,05 sammenlignet med kontroller
LncRNA-uc002kmd
en
modulerer cellevekst
Vi undersøkte videre effekten av
lncRNA-uc002kmd
.
en
på celleproliferasjon i
vitro
. CRC celler ble transfektert med MIR-211-3p etterligner eller med en MIR-211-3p inhibitor, og transkripsjonsnivåer av
lncRNA-uc002kmd ble
nedregulert etter RNA syntese ble blokkert med actinomycin D i tilstedeværelsen av MIR-211-3p (nedregulert fra 100% til 54% ± 3,2% i nærvær av 1 pmol MIR-211-3p, og nedregulert fra 100% til 28% ± 3,2% i nærvær av 40 pmol MIR-211-3p).
Vi utførte CCK-8-analyser for å teste effekten av
LincRNA-uc002kmd
.
en
på celleproliferasjon i CRC celler. Vi observerte en konsekvent økning i celle spredning av HCT116 (38% økning) og SW480 (31% økning) cellelinjer når
LncRNA-uc002kmd
.
en
ble overexpressed på fysiologiske nivåer gjennom CCK -8-analyser, sammenlignet med kontrollen. Mens
lncRNA-uc002kmd
.
en
nedregulert cellene, spredning av HCT116 (50% reduksjon) og SW480 (27% reduksjon) cellelinjer ble konsekvent redusert (Fig 3C) .
LncRNA-uc002kmd
.
en
akselerere tumorvekst i xenograft
for å undersøke den biologiske betydningen av
LncRNA-uc002kmd
.
en
på tumorvekst, xenograft ble subkutant injisert med CRC celler. Som vist i figur 3D, veksten av tumorer fra oppregulert
LncRNA-uc002kmd
1
xenotransplantater ble signifikant økt sammenlignet med den for kontroll xenotransplantater:. 423,3 ± 71,6 mm
3 versus 600 ± 17,6 mm
3 for HCT116-celler (
P
0,05); og 420 ± 70,8 mm
3 versus 616.7 ± 21,7 mm
3 for SW480 celler (
P
0,05). henholdsvis
Diskusjoner
I denne studien identifiserte vi
lncRNA-uc002kmd
.
en
i CRC, og fant at det var dramatisk oppregulert i CRC vev ved hjelp av revers transkriptase polymerase chain reaction assay, indikerer potensiell funksjon av
lncRNA-uc002kmd
.
en
i CRC. En rekke forsøk har vist sammenhengen mellom
lncRNA-uc002kmd
.
en
, MIR-211-3p og CD44, avslutt at
lncRNA-uc002kmd
.
1
regulerer CD44-avhengig cellevekst ved å konkurrere om MIR-211-3p i tykk- og endetarmskreft. Våre funn tyder på den viktige rollen
lncRNA-uc002kmd
.
en
under CRC tumorigenesis.
LncRNAs er fremstår som sentrale aktører i ulike grunnleggende biologiske prosesser og en økende mengde forskning har foreslått at lncRNAs er viktige aktører i kreftutvikling [17-19]. Den mest kjente lncRNA, hotair, er oppregulert i galleblæren kreft (GBC) som fører til kreftmetastaser gjennom endret metylering av histon H3 lysin 27 (H3K27) og genekspresjon [20, 21].
Linc-POU3F3
økes i ESCC prøver, som gjennom samhandling med
EZH2
å fremme metylering av
POU3F3
, deretter fremme svulst utvikling [22]. Annet enn disse kommenteres-lncRNA, ikke-kommenterte lncRNA har hatt den ønskede effekt på utviklingen av mange ondartede svulster, som for eksempel tykktarmskreft-forbundet lncRNA (CCAL) fremme CRC progresjon av den aktiverte Wnt /β-catenin vei [23] . En fersk rapport fant at
lncRNA-uc002kmd
.
en
, også kjent som GAPLINC, var oppregulert i GC og vises også betydelige prediktive virkninger i diagnose og prognose av magekreft, mens i vår studie,
lncRNA-uc002kmd
en
var også involvert i markedsføringen av CRC utvikling.
Deretter undersøkte vi de mekanismer som
. lncRNA -uc002kmd
.
en
utøver sin funksjon i maligne CRC fenotyper. Våre resultater viste tydelig at når stanse
lncRNA-uc002kmd
.
en
uttrykk, CRC celleproliferasjon ble hemmet. Våre data også bekreftet at
lncRNA-uc002kmd
.
en
danner en molekylær lokkedue for miR211-3p. Det er allment kjent at mirnas er korte RNA-sekvenser, men målet sekvenser av de 3’UTRs av mRNA så negativt manipulere genekspresjon. Mirnas er involvert i forskjellige biologiske prosesser, slik som celleproliferasjon, utvikling, differensiering og metabolisme. Generelt mirnas spille en sentral rolle i genregulering, hovedsakelig ved å målrette rikelig proteinkodende gener. I økende grad har imidlertid mer forskning funnet at mirnas kan også utføre sin funksjon ved å målrette lncRNAs [24]. Teorien om konkurranse endogen RNA viste at koding gener og lncRNAs kan regulere hverandre gjennom deres konkurranse for miRNA binding [25]. Ifølge denne teorien, kan lncRNAs utøve sin innflytelse på mål ved å fungere som lokkeduer for mirnas.
I denne artikkelen har vi identifisert CD44 protein som en viktig del av
lncRNA-uc002kmd
.
en Anmeldelser – miRNA regulatoriske nettverk. Bruk av luciferase reporter analysen, fant vi at CD44 er undertrykt av MIR-211-3p, og denne funksjonen er svekket av
lncRNA-uc002kmd
.
en
overekspresjon. Vi har også funnet at nivået av CD44 protein gradvis øket med økende nivåer av
lncRNA-uc002kmd
.
1
.
CD44 er et celleoverflate-transmembran glykoprotein som spiller en betydelig rolle i en rekke biologiske funksjoner [26]. Tidligere studier har vist at CD44 spiller en avgjørende rolle i AML utvikling og varianter av CD44 kan påvirke sitt uttrykk, som fører til varierende risiko for AML [15]. I tillegg er en viktig CD44 stamcelle markør for flere faste tumorer, noe som fører til utvikling og progresjon av kreft [27]. CD44 kan brukes som en ny markør for egenskapene og styring av mange tumorer så som GC [28] eller CRC [11]. Nylig har mange studier viser en signifikant sammenheng mellom nivået av
CD44
uttrykk og brystkreft tumorigenicity, som fremhever den viktige rollen
CD44
i tumorprogresjon og metastase [11, 29, 30 ]. I vår studie, viste vi at miR211-3p binder seg til 3’UTR region av CD44, målretting CD44 for degradering. Gjennom miR211-3p lokkefugl,
lincRNA-uc002kmd
.
en
øker CD44 uttrykk.
Til sammen tyder våre funn på at
lincRNA-uc002kmd
.
en
kan forbedre CD44 uttrykk ved å konkurrere om MIR-211-3p, senere formidling celle migrasjon og spredning i CRC.
Takk
prosjektet ble støttet av et stipend fra Science Foundation Natural i Zhejiang-provinsen i Kina (LY16H160048). Også dette arbeidet ble støttet av et stipend fra Wenzhou Public Welfare Science and Technology Project (Y20140707), også ble støttet av en bevilgning fra Inkubasjon prosjekt The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University (FHY2014009).
