Abstract
Bakgrunn
Operasjon prøver har lenge vært brukt som viktige fag for kreftforskning . I samsvar med en økning på neoadjuvant terapi, har biopsiprøver nylig blitt viktig for kreft transkriptom. På den annen side, både biopsi og kirurgiske prøver er tilgjengelig for ekspresjon profilering for å forutsi klinisk resultat av adjuvant behandling; Det er imidlertid fortsatt uklart om kirurgisk prøven uttrykk profiler er nyttige for prediksjon via biopsiprøver, fordi lite har blitt gjort om komparative genuttrykk profilering mellom de to typer prøver.
Metode og funn
til sammen 166 prøver (77 biopsi og 89 kirurgiske) av normale og maligne lesjoner i spiserøret ble analysert ved mikromatriser. Genuttrykk profiler ble sammenlignet mellom biopsi og kirurgiske prøver. Kunstig indusert epitelial-mesenchymale overgang (aiEMT) ble funnet i de kirurgiske prøver, og også skjedde i muse esophageal epiteliale cellelagene under en iskemisk tilstand. Identifisering av klinisk signifikante undergrupper var tenkt å bli forstyrret av lidelse av uttrykket profil gjennom denne aiEMT.
Konklusjon og betydning
Denne studien vil fremkalle den grunnleggende feiltolkning inkludert undervurdering av den prognostiske evaluering makt markører av overvurdering av EMT i siste kreftforskning, og vil gi noen råd for nær fremtid som følger: 1) Å forstå hvor lenge vevet var under en iskemisk tilstand. 2) Utbredelse av biopsiprøver for
in vivo
uttrykk profilering med lave skjevheter på grunnforskning og klinisk forskning. 3) Kontroll celleinnholdet kreft og normal- eller nekrotisk vev forurensning i biopsiprøver for utbredelsen
Citation. Aoyagi K, Minashi K, Igaki H, Tachimori Y, Nishimura T, Hokamura N et al. (2011) kunstig fremkalt Epitelial-Mesenchymale Overgang i Kirurgiske Emner: dets implikasjoner i Clinical and Basic Cancer Research. PLoS ONE 6 (4): e18196. doi: 10,1371 /journal.pone.0018196
Redaktør: Irene Oi Lin Ng, The University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 24 desember 2010; Godkjent: 22 februar 2011; Publisert: 21 april 2011
Copyright: © 2011 Aoyagi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis av Program for fremme av grunnleggende studier i helsefag av National Institute of Biomedical Innovation; en Grant-in-Aid for tredje Omfattende 10-år Strategi for Cancer Control fra Helsedepartementet, Arbeids- og velferds av Japan; Princess Takamatsu Cancer Research Fund, og Stiftelsen for fremme av Cancer Research (RR: T.N.). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Ingen ekstra ekstern finansiering mottatt for denne studien
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er en viktig årsak til menneskelig dødsfall i. mange land. Genuttrykk profiler fra DNA-mikromatriser er individualisert og nyttig i diagnose og prognose av sykdommer [1]. Selv om noen kunstige faktorer slik som iskemi, hypoksi, hyponutrition, og kald stresset muligens oppstå under kirurgisk fjerning og prøven transport (fig S1), er kirurgiske prøver lenge vært brukt som viktige temaer for klinisk og grunnleggende forskning kreft. I samsvar med en økning på neoadjuvant terapi (i hodet og halsen, spiserøret, lunge, bukspyttkjertel, prostata, og brystkreft), biopsiprøver har nylig blitt viktig for kreft transkriptom. På den annen side, både biopsi og kirurgiske prøver er tilgjengelig for ekspresjon profilering for å forutsi klinisk resultat av adjuvant terapi (i mage, tykktarm, lever, blære, pankreas, hjerne, nyre, ovarie, cervical og brystkreft). Målene for microarray analyse var, for de siste ti årene, hovedsakelig kirurgisk samplesfrom utvikling og utbredelse av to typer microarray: oligonukleotid [2], [3] og cDNA [4], [5]. Men om et stort antall akkumulerte kirurgisk prøve uttrykk profiler er nyttige for prediksjon ved bruk av biopsiprøver fra tidligere behandlede pasienter er fortsatt uklart, fordi lite har blitt gjort om komparative genuttrykk profilering mellom de to typer prøver.
kjemoradioterapi (CRT) etterfulgt av kirurgi er standard behandling for kreftfaren i vestlige land. I Japan, neoadjuvant kjemoterapi etterfulgt av kirurgi og definitive CRT er standardbehandling [6], og for lokalavansert esophageal kreft (Stage II eller III), kirurgi var standard terapi der ca 5 år siden [7]. Dette gjør oss i stand til å skaffe både biopsi og kirurgiske prøver fra esophageal kreftpasienter og sammenligne genuttrykk profiler mellom disse to typer prøver. Her rapporterer vi at kunstig indusert epitelial-mesenchymale overgang (aiEMT) oppstår i kirurgiske prøver. Dens tilstedeværelse der har muligens forstyrret ikke bare med microarray- eller immunohistochemistory basert klinisk forskning, men også med grunnleggende forskning.
Resultater
Sammenligning av Expression Profiles mellom Biopsi og Kirurgisk reseksjon Esophageal tumorprøver innhentet fra ulike Cases
Vi først sammenlignet genuttrykk profiler mellom 35 friske biopsiprøver som ikke inneholder nekrotisk lesjon og 66 kirurgiske esophageal kreftprøver, som ble hentet fra en margin på svulsten etter eksponering for 4-7 timer under en iskemisk tilstand ved unsupervised clustering med 3.126 behandlet gener (Materialer og metoder). Det var ingen signifikant forskjell i kliniske eller patologiske stadium fordeling mellom disse to sett av esophageal kreft fordi lokalt avanserte tumorer (trinn II eller III) er viktige mål for både kjemoradioterapi og kirurgi [8] – [10]. Seksti av de 66 kirurgiske prøver (90,9%) og 29 av de 35 biopsiprøver (82,9%) dukket opp i en (til venstre) og b (høyre) prøve klynge, henholdsvis (figur 1A). For å undersøke antall differensielt uttrykte gener mellom disse to typer prøver med reproduserbarhet, sammenlignet vi uttrykk profiler blant tre uavhengige prøvesett (A, B og C): ytterligere 20 biopsiprøve satt versus tre kirurgiske prøvesett (A, B, og C) inneholder 20 tilfeldig utvalgte saker fra de 66 tilfellene (figur 1B, øverst). Antallet av differensielt uttrykte gener som er valgt av u-test (p 0,01) var 2, 295, 2328, og 2, 245 i sett A, B, og C, respektivt. Blant disse 3 sett, ble 1,495 gener (65,1% i A, 64,2% i B, og 66,6% i C) vanligvis identifisert (figur 1B, øverst). Derfor er mer enn 20% (1495/6000, 24,9%) av genene ble uttrykt forskjellig mellom biopsi og kirurgiske prøver fordi det gjennomsnittlige antall detekterbare gener i hvert tilfelle var ca. 6,000. Resultatene antydet at en stor forskjell mellom biopsi og kirurgiske prøver.
(A) Unsupervised clustering med 3.126 behandlet gener. Kirurgiske (a) og biopsiprøve klynger (b) er vist. (B) Sammenligning av ekspresjonsprofiler mellom tre uavhengige sett (A, B, og C): et tilfeldig valgt 20-biopsiprøve innstilt i forhold til tre kirurgiske prøvesettene (A, B og C) inneholdende 20 uavhengige tilfeller. Antallet av differensielt uttrykte gener som er valgt av u-test (p 0,01): 2, 295 i settet A, 2328 i sett B, og 2, 245 i settet C (øvre). Antallet av differensielt uttrykte gener med et 3-gangers skifte mellom to gjennomsnittlig signalintensitetene: 297, 273, og 300. Clustering- resultater med disse gensettene (lavere). (C) oppregulert gener i kirurgisk eller biopsiprøver. Ved bruk av alle profilene i henhold til strenge seleksjonsbetingelser (se Materialer og metoder), ble 38 og 219 gener identifisert som oppregulert gener i biopsi og kirurgiske prøver, henholdsvis.
Fra 1,495 gener, vi videre valgt forskjellig uttrykt gener blant de 3 settene som hadde en tre ganger endring mellom to gjennomsnittlig signal intensiteter av hvert gen mellom biopsi og kirurgiske prøver. Fra sett A, B, og C, 297, 273, og 300 gener identifisert, henholdsvis (figur 1B, lavere). Mer enn 80% av disse genene var over-uttrykt i kirurgiske prøver, noe som tyder på en fortrinnsrett nærvær av kunstige faktorer eller en forurensning av normale porsjoner.
For å ta opp begrunnelsen for forskjellen, vi endelig utvalgte gener som uttrykkes gjenom hele 35 biopsi eller 66 kirurgiske prøver i henhold til strenge vilkår med u-test (p 0,01), permutasjon test, og en 2 ganger endring, etc. (Materialer og metoder). Ved denne prosedyre ble 38 og 219 gener identifisert som opp-regulerte gener i biopsien og kirurgiske prøver, henholdsvis (tabell S1 og figur 1C). Interessant, i den kirurgiske prøver, ble mange EMT markører funnet å bli uttrykt og fortrinnsvis ofte. Microarray resultater fra 13 representative EMT markører inkludert fibronektin (FN), vimentin (VIM) og kollagen (kolonner) er vist i figur 2A. Videre har membransignal transdusere som cytokin, kjemokin, og reseptorer ble også funnet å være oppregulert i de kirurgiske prøver. Representant microarray og RT-PCR resultatene av
IL8
,
CXCR4
,
CXCL9
,
PDGFRB
,
CCL5
, og
TLR2
, henholdsvis er vist i figurene 2B og 2C. I korrespondanse med EMT, E-cadherin (
CDH1
) ble funnet å være nedregulert i kirurgiske prøver (Figur 2A, rett lavest).
(A) Expression mønstre av en epitelial celle markør E-cadherin (
CDH1
) og typiske EMT markører inkludert fibronektin (
FN
), vimentin (
VIM
), og kollagen (
Cols
). (B) Expression mønstre av 6 membransignal transdusere: et cytokin (
IL8
), to kjemokiner (
CXCL9 Hotell og
CCL5
), og tre membrantype reseptorer (
CXCR4
,
PDGFRB
, og
TLR2
). (C) Semi-kvantitativ RT-PCR resultatene av disse 6 membran transdusere i representative utvalg.
Sammenligning av Expression-profiler mellom biopsiprøver og kirurgiske resected Esophageal tumorprøver innhentet fra like saker
på samme ovennevnte måte, sammenlignet vi genekspresjonsprofiler mellom 18 biopsi og 18 kirurgisk resekterte esophageal tumorprøver, og er valgt 41 og 716 gener som ble identifisert som opp-regulerte gener i de to typer prøver, henholdsvis (tabell S2 og figur 3). I samsvar med ovennevnte resultater fra ulike tilfeller, ble mange EMT markører og membran signal transdusere også funnet å være oppregulert ofte i de kirurgiske prøver (Figur 4A). Enda viktigere, to EMT regulatorer,
ZEB1 Hotell og
ZEB2
, og noen EMT-relaterte myogenic transkripsjonsfaktorer inkludert
MEOX2 Hotell og
MEF2C
var i stand til å velges som oppregulert gener i kirurgiske prøver (figur 4A). Kvantitativ real-time RT-PCR bekreftet over-uttrykk for
ZEB1
,
ZEB2, FN, og VIM
i de 18 kirurgiske prøver av like saker (figur 4B). Den over-uttrykk for
ZEB1 Hotell og
ZEB2
ble også funnet i de 66 kirurgiske prøver av ulike tilfeller (figur S2), selv om disse to EMT regulatorer ikke kunne hentes ut fra uttrykk profiler under ovenfor strenge vilkår. SNAI1 /Snail, SNAI2 /Slug, ZEB1 /ZFHX1A, ZEB2 /SIP1 /ZFHX1B, TWIST1 /TWIST og TWIST2 er representative EMT regulatorer [11], [12]. Blant dem,
TWIST1
samt to
Zebs
var over-uttrykt i de to settene med esophageal svulster (Figur S3). For å undersøke om aiEMT i mRNA nivåer påvirker immunhistokjemi (IHC), utførte vi IHC på en typisk mesenchymale markør vimentin i biopsi og kirurgiske prøver av like saker. Bestemmes først vi betingelser under hvilke normale epitel-cellelag ikke kunne bli farget, men tumorceller med EMT kan være (figurene 5A, 5B), fordi udifferensierte lag (basal og parabasal) har blitt rapportert å uttrykke EMT-relaterte gener inkludert
VIM product: [4]. I tre av fem par av de undersøkte prøvene, ble tumorlesjoner av en kirurgisk prøve syntes å være farget mer sterkt enn de av en biopsiprøve (fig 5C-H); men det gjorde de resterende 2 parene ikke viser en slik forskjell (data ikke vist). Derfor ble aiEMT som skjedde i de kirurgiske prøvene i mRNA nivå antas å påvirke bare en undergruppe av kirurgiske prøver i nivået av EMT-relaterte proteiner.
Etter strengere seleksjon (se Materialer og metoder), 41 og 716 gener ble identifisert som oppregulert gener i biopsi og kirurgiske prøver, henholdsvis.
(A) Expression mønstre av 2 representative EMT regulatorer (
ZEB1 Hotell og
ZEB2
), 8 typiske EMT markører inkludert fibronektin (
FN
), vimentin (
VIM
), 3 kollagen (
COL1A2
,
COL3A1
og
COL14A1
),
FBN1
,
MYH11
, og
ACTC1
, og 2 EMT-relaterte myogeniske transkripsjonsfaktorer (
MEOX2 Hotell og
MEF2C
). (B) kvantitativ real-time RT-PCR resultatene av
ZEB1, ZEB2, FN, og VIM
. Lukket boks: kirurgisk prøven; Åpne boksen. Biopsiprøve
IHC av vimentin i en kirurgisk prøve som inneholdt normale deler, viste at normale esophageal epitelceller ikke var farget, men invasive kreftceller var (A, B). I tre av fem par av biopsi og kirurgiske prøver, over-uttrykk for vimentin ble observert i de kirurgiske prøver. (Biopsi: C, E, G, kirurgisk: D, F, H)
over-uttrykk for
ZEB1
,
ZEB2
, og
TWIST1
i kirurgisk reseksjon normalt vev
Vi har fått 4 biopsiprøver og 5 kirurgiske prøver av non -cancerous vev, og sammenlignet deres uttrykk profiler. På samme måte med de ovennevnte uttrykk profiler av tumorvev (figur 2, 4, S2 og S3), tre EMT regulatorer (
ZEB1
,
ZEB2
, og
TWIST1
) og to typiske EMT markører (
VIM Hotell og
FN
) ble funnet å være over-uttrykk i de 5 kirurgiske prøver (Figur 6A). Vår forrige rapport som viser involvering av ZEB2 og TWIST1 i EMT av normale og maligne esophageal epitelceller [9] støtter tilstedeværelsen der av kunstig fremkalt EMT.
(A) Over uttrykk for EMT-regulatorer (
ZEB1
,
ZEB2
, og
TWIST1
) og EMT-markører (
VIM Hotell og
FN
) i kirurgisk reseksjon normal spiserør mucosa. (B) Induksjon av mus
Zeb1
,
Zeb2
,
Vim
, og
Fn
etter iskemisk tilstand. Etter reseksjon av mus spiserøret, vi plasserte den på PBS i 0 eller 4 timer ved romtemperatur (under en iskemisk tilstand), umiddelbart fikk frosne snitt, fanget epitelcellelaget (øvre) med laser mikrodisseksjon, forsterket mRNA ved TALPAT [24] – [28], og innhentet uttrykk profiler ved hjelp av mus Expression Array 430 2,0 (Affymetrix, Santa Clara, CA). Eksperimenter ble utført på 3 mus.
Zeb1
,
Zeb2
,
Vim
, og
Fn
gener blir indusert 4 timer etter reseksjon (Nedre). *
P
0,05. (C) Kvantitativ real time RT-PCR av
Zeb1
,
Zeb2
,
Vim
, og
Fn
. Over-uttrykk for
Zeb1
,
Zeb2
,
Vim
, og
Fn
, vist ved mikromatriser, ble bekreftet.
til slutt, for å undersøke om disse 5 gener blir indusert i epitelceller ved kirurgisk reseksjon relaterte iskemi, resected vi en mus spiserøret, og plassert den på PBS i 0 eller 4 timer, og umiddelbart gjort frosne snitt fulgt av laser fanget mikrodisseksjon av epiteliale cellelagene (figur 6B, øvre). Expression profiler av muse epiteliale cellelagene på 0 eller 4 timer etter reseksjon viste at mus
Zeb1
,
Zeb2
,
Vim
, og
Fn
ble indusert 4 timer etter reseksjon (figur 6B, lavere). Kvantitativ real-time RT-PCR bekreftet over-uttrykk for
Zeb1
,
Zeb2
,
Vim
, og
Fn
etter reseksjon (figur 6C) . Siden samlet følsomhet muse Affymetrix matriser er kjent for å være lavere enn i mennesker, og anvendelse av en liten mengde av RNA, for eksempel laser-fanget fag er også kjent å redusere følsomheten microarray,
Twist1
mRNA i seg selv ikke kunne påvises i denne musen eksperimentet (data ikke vist).
For å undersøke om aiEMT i mRNA nivåer påvirker IHC, utførte vi IHC på en typisk mesenchymale markør vimentin 8 timer etter reseksjon. Her fant vi ut hvilke vilkår normale epiteliale cellelagene er farget. I alle de 3 uavhengige undersøkte prøvene, ble normal epitel-cellelag ikke funnet å være farget høyt 8 timer etter reseksjon (Figurene 7A-C). Avviket mellom mRNA-nivå og proteinnivå kan forklares med de to følgende grunner: 1) selv om udifferensierte lag (basal og parabasal) har blitt rapportert å uttrykke EMT relaterte gener inkludert
VIM product: [4], deres ekspresjonsnivåene var mye lavere enn tumor (figur 5B). 2) Det kan også være vanskelig å vise den omtrentlige to-ganger endring i mRNA nivå (figurene 6B, C) som i proteinnivået ved IHC, fordi IHC er dårligere enn RT-PCR i både følsomhet og kvantifisering.
etter reseksjon av mus spiserøret, vi plasserte den på PBS i 0, 4, 8 timer ved romtemperatur (under en iskemisk tilstand), umiddelbart gjort frosne snitt, og IHC av vimentin ble utført under mer sensitive forhold sammenlignet med figur 5 . Eksperimenter ble utført på 3 mus (A-C). Over-uttrykk for vimentin i mus esophageal epitel ble ikke observert selv etter 8 timers eksponering under en iskemisk tilstand. Pil: vimentin-positive glatt muskulatur, pilhodet. Mus stratifisert epitel-cellelag esophageal
Alle resultatene tyder på at EMT, spesielt i mRNA-nivå, blir indusert kunstig i både normal og ondartet epitelial celler ved kirurgisk fjerning relaterte hendelser (ischemi-indusert hypoksi og hyponutrition, og hypoksi-indusert betennelser, etc.).
kunstig fremkalt EMT (aiEMT) ved kirurgisk fjerning Hindrer microarray-baserte undergruppe Identifikasjon
Identifisering av klinisk signifikante undergrupper er svært viktig for personlig medisin og for legemiddelutvikling mot uløselige tilfeller. Når vi brukte uttrykket profiler av de 35 biopsiprøver innhentet fra pasienter behandlet av kjemoradioterapi [8], uten tilsyn clustering med 5,570 bearbeidet gener (Materialer og metoder) identifiserte en god responder gruppe bestående av 9 pasienter (7/9, 78% viser komplett respons på kjemoradioterapi) fra 35 (figur 8A, venstre). Når imidlertid profiler av de 66 kirurgiske prøver ble anvendt, uten tilsyn gruppering med 2,016 bearbeidet gener kunne ikke identifisere en hvilken som helst undergruppe (figur 8A, til høyre). Således biopsiprøve ekspresjonsprofiler syntes å være mer effektive i undergruppe identifikasjon enn de av de kirurgiske prøver. Faktisk har vi tidligere rapportert at biopsiprøve ekspresjonsprofiler kunne skille langsiktig eller kortsiktig overlevende etter definitive kjemoradioterapi [8]; imidlertid, kirurgisk prøve ekspresjonsprofiler aldri identifisert dårlige prognostiske undergrupper med omfattende lymfeknutemetastase [10]. Videre, i operasjons prøvene, ble EMT akselerert i 36 (85,7%) av 42 esophageal-kreft [9]. Denne høye andelen synes å være forårsaket av aiEMT.
(A) Unsupervised gruppering av 35 biopsi og 66 kirurgisk resekterte esophageal tumorprøver med 5,570 og 2,016 bearbeidede gener, respektivt. En prøve klynge med 2,971 gener vises bare i biopsiprøver. (B) Sammenligning av antall behandlede gener for ukontrollert clustering mellom biopsi og kirurgiske prøver. Antall behandlede gener og som vanligvis utvalgte gener er indikert. (C) Frekvensfordeling for andel av prøver av endelig behandlet-genet sett. Hver fordeling av 5, 570 gener i biopsiprøver (venstre) og 2,016 gener i kirurgiske prøver (Høyre) er indikert.
For å ta grunnen undergruppering er vanskelig i kirurgiske prøver, sammenlignet vi nummer og fordeling av hver av de fremstilte gener, som ble brukt for uovervåket clustering. Vi først valgte gener med en signalintensitet på mer enn 1000 i mer enn 10% av prøvene. Fra 35 biopsi og 66 kirurgiske prøver, 6,551 og 4,797 gener, henholdsvis, ble valgt. Fra disse genene, vi endelig valgte mer enn 3-ganger endrede gener ved å sammenligne gjennomsnittlig signalintensiteten av hvert gen i mer enn 10% av prøvene. I de 35 biopsiprøver, 85% (5570) av 6,551 først behandlet gener forble, mens antall endelige bearbeidede gener redusert fra 4,797 første bearbeidede gener til 2016 (42%) (figur 8B, øvre). Av de 2,016 endelig behandlet gener i de kirurgiske prøvene, ble 1724 (86%) inkludert i 5,570 endelig behandlet gener i biopsiprøver; imidlertid, 3846 (69%) av 5570 gener var unike for biopsiprøver (figur 8B, lavere). Dessuten viser frekvensfordeling (for prosentandel av prøvene) av disse to til slutt behandlet-gensettene at ca 60% av de behandlede 2016 genene i de kirurgiske prøver uttrykke i bare et begrenset antall tilfeller (0-10%) (figur 8C) . Følgelig kan aiEMT i kirurgiske prøver redusere antall behandlede gener nyttige for undergruppe identifikasjon.
Diskusjoner
Vi har nylig rapportert tilstedeværelse av crosstalk mellom Hedgehog (Hh) og EMT signalering i normal og ondartet epitelceller i spiserøret [9]. I denne rapporten
ZEB2
ble vist å være en nedstrøms genet av både en primær transcriptional transduser GLI1 i Hh signalering og av en annen EMT regulator, TWIST1, og at ZEB2 ytterligere oppregulert 5 kjemokin eller vekstfaktorreseptorer,
PDGFRA
,
EDNRA
,
CXCR4
,
VEGFR2
, og
trkB plakater (figur S4). Den Hh signal blokk hemmet esophageal keratinocyte differensiering og kreft celle invasjon og vekst. Følgelig over-uttrykk for
ZEB2 Hotell og
TWIST1
i kirurgiske prøver av både normale og tumorvev kan indusere EMT, noe som resulterer i overuttrykk av representative EMT markører
VIM
FN
, og
Cols plakater (figur 2, 4, 6, S2 og S3) og membransignal transdusere
IL8
,
CXCL4
,
CCL5
,
CXCR4
,
PDGFRB
, og
TLR2 plakater (figur 2). Over-uttrykk av membranen signal transdusere kan aktivere lenger ned-stream kaskader. Dette er en viktig årsak til den store forskjellen i uttrykksprofiler mellom biopsi og kirurgiske prøver (figur 1 og 3).
Omfattende forurensing av normale mesenchymale deler i kirurgisk resected tumorvev kan også forklare den overuttrykk av dem EMT regulatorer og EMT-relaterte gener, selv om trent patologer nøye skåret bulk vevsprøver fra hoved svulst, og etterlater en klar margin fra omkringliggende normalt vev (Materialer og metoder). Imidlertid, over-ekspresjon ble også observert i kirurgisk resekterte normalt vev og mus epitel-cellelag 4 timer etter reseksjon (figur 6). Derfor konkluderte vi med at kunstig fremkalt EMT, kalt aiEMT, skjedde i både normale og maligne epitelceller av de kirurgisk fjerning relaterte hendelser (ischemi-indusert hypoksi, ischemi-indusert hyponutrition, og hypoksi-indusert betennelser, etc.) (Figur S1 ).
i det siste har de hypoksi-induserbar faktorer (HIF-1A eller HIF-2A) er rapportert å direkte regulere TWIST1 [13], [14] og LOXL2, som angivelig stabilisert en EMT regulator, SNAI1 /SNAIL, gjennom fysisk interaksjon på SLUG domene og snegle lysinresidier K98 og K137 [15]. Den SNAI1 bindingssetet ble også funnet i 5 «promotor regionen
ZEB2 product: [16]. Over-uttrykk for både
HIF1A Hotell og
LOXL2
ble kun observert i kirurgisk resected tumorvev hentes fra ulike tilfeller (figur S5). Videre andre
HIF1
familier (
HIF1B Hotell og
HIF2A
) ble aldri over uttrykt i noen av de kirurgiske prøver. Derfor klarlegging av de molekylære mekanismene for aiEMT i kirurgiske prøver gjenstår for fremtidige studier. Men vi bemerket at iskemi-indusert hypoksi og /eller betennelse har blitt rapportert å slippe undertrykkelse av NFkB [17], som regulerer
ZEB1
,
ZEB2
, og
TWIST1
[18], [19] og at TGF-β signalering kan være involvert i aiEMT, fordi over-uttrykk for
NFKB1 Hotell og
TGFBR2
ble funnet i kirurgiske prøver (Figur S6).
som nevnt i innledningen, kirurgiske prøver har blitt brukt som viktige fag for klinisk og grunnleggende kreftforskning gjennom mange år. Derfor kan aiEMT i kirurgiske prøvene har muligens forstyrret eller hindret ikke bare microarray- eller immunhistokjemi basert klinisk forskning (diagnostisk markør identifikasjon, undergruppering, noe som gjør prediktorer, og prognose evaluering, etc.), men også grunnleggende forskning (gjør et signal sti kart , terapeutisk mål identifisering, etc.). Denne studien vil trolig vekke fundamental feiltolkning inkludert undervurdering av den prognostiske evaluering makt markører av overvurdering av EMT i siste kreftforskning, og vil gi noen råd for nær fremtid som følger: 1) Å forstå hvor lenge vevet var under en iskemisk tilstand ( fra starten av reseksjon til lager eller RNA forberedelse). Den totale mengden av tid bør aldri overstige 4 timer. 2) Utbredelse av biopsiprøver for
in vivo
uttrykk profilering med lave skjevheter på grunnforskning og klinisk forskning; for eksempel, for kliniske resultatet prediksjon av ikke bare neoadjuvant men også adjuvant kjemoterapi, radioterapi, og kjemoradioterapi slik som i tidligere rapporter [8], [20] – [23]. 3) Kontroll celleinnholdet kreft og normal- eller nekrotisk vev forurensning i biopsiprøver for utbredelsen. Ved sampling av en nål biopsi, bør tumor deler (2 mm x 2 mm) oppnås fra en margin (omkrets) av tumoren ved utelukkelse av sentrale nekrotiske lesjoner i henhold til endoskopi. Hvis nekrotiske lesjoner ble sterkt forurenset i prøvene, bør disse prøvene utelukkes ved å kvantifisere og kvalifisere RNA. Dersom prøvene inneholdt omfattende normale lesjoner, kan slike prøver utelukkes ved uttrykket profilen baserte scoring metode med normale og /eller tumor spesifikke gener.
Materialer og Metoder
vevsprøver
Alle spiserørskreft (plateepitelkarsinom) og ikke-kreft vev ble levert av Central Hospital eller East Hospital ved National Cancer Center etter å ha innhentet skriftlig informert samtykke fra hver pasient og godkjenning av Senter etikkutvalg.
alle kirurgiske prøver ble oppnådd fra pasienter uten neoadjuvant terapi, og alle biopsiprøver ble oppnådd før behandling. For de kirurgiske prøver, trente patologer nøye skåret bulk vevsprøver fra hoved svulst, og etterlater en klar margin fra den omkringliggende normalt vev. Således erholdt vi kirurgiske prøver fra en margin (omkrets) av tumoren. For nål biopsiprøver, ble svulst deler (2 mm x 2 mm) oppnådd under endoskopi fra en margin på svulsten ved utelukkelse av noen sentrale nekrotiske lesjoner. Dersom prøvene ble sterkt forurenset av nekrotiske lesjoner, ble disse prøvene ekskludert ved å kvantifisere og kvalifisere RNA. Dersom prøvene inneholdt omfattende normale lesjoner, ekskluderte vi slike prøver av uttrykket profilen baserte scoring metode med normale og /eller tumor spesifikke gener (under forberedelse).
Den totale prosessen med en spiserørskreft operasjon krever mye tid . Derfor ble det kirurgiske prøver skåret ut fra en margin av tumoren ved trent patologer etter utsetting i 4-7 timer under en iskemisk tilstand, og ble umiddelbart frosset ved -80 ° C inntil bruk. Tvert imot ble det nål biopsiprøver resekterte henhold til endoskopi umiddelbart frosset ved -80 ° C inntil bruk. Clinicopathological informasjon er gitt i tabell S3, S4, S5.
Laser mikrodisseksjon fulgt av RNA Utvinning og Amplification
Kryostatsnitt (8 pm) av frosne mus esophageal prøvene ble laser-microdissected med MMI CellCut system (MMI Inc., Rockledge, FL). Total RNA ble isolert ved å suspendere cellene i et ISOGEN lyseringsbuffer (Nippon Gene, Toyama, Japan) etterfulgt av utfelling med isopropanol. RNA ble amplifisert ved hjelp av en effektiv fremgangsmåte for å hi-fi-mRNA forsterkning, kalt TALPAT (T7 RNA polymerase promoter-festet, adapter ligation-mediert, og PCR-amplifikasjon fulgt av
in vitro
T7-transkripsjon) [24-28 ]
Microarray analyse
genuttrykk profiler ble oppnådd fra 166 prøver:. svulst sett (forskjellige tilfeller) av uavhengige 35 og 20 biopsiprøver og 66 kirurgiske prøver, en annen svulst innstilt (identisk sak) 18 biopsiprøver og 18 kirurgiske prøver, en normal sett av 4 biopsiprøver og 5 kirurgiske prøver. Totalt RNA hentet fra bulk vevsprøver var biotin-merket og hybridisert til høy tetthet oligonukleotid mikromatriser (Human Genome U95Av2 eller U133PLUS2.0 Array, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. For laser fanget mus esophageal epitel cellelag, ble Mouse Genome 430 2,0 Array brukt. De skannede dataene til gruppene ble behandlet av Affymetrix microarray Suite versjon 4.0 eller 5.0, som skaleres gjennomsnittlig intensitet av alle genene på hvert array til et mål signal fra 1000 for å sammenligne pålitelig variable flere arrays. Alle microarray data har blitt deponert i en MIAME kompatibel database, GEO; sjonsnummer SuperSeries GSE22954.
Gene Utvalg fra microarray data og hierarkisk Clustering
hierarkisk clustering er mye brukt som en av de unsupervised læringsformer. Hierarkisk clustering av microarray data ble utført ved bruk av GeneSpring (Agilent Technologies Ltd., CA, USA), Microsoft Excel, og Cluster Utforsker programvare [29] .For uten tilsyn clustering (figur 1A og 8A), vi først valgte gener med en signalintensitet på mer enn 1000 i mer enn 10% av prøvene, og fra disse genene, vi endelig valgt mer enn tre ganger endrede gener ved å sammenligne den gjennomsnittlige signalintensiteten av hvert gen i mer enn 10% av prøvene. For overuttrykt gener i de kirurgiske eller biopsiprøver, vi først valgte gener ved u-test (p 0,01), permutasjon test, og 2- eller 3-ganger skift mellom de gjennomsnittlige signalintensitetene av de to sett av prøver, og fra første valgte gener vi endelig valgt gener med mer enn 1000 i gjennomsnitt signalintensitet.
Semi-kvantitativ og kvantitativ RT-PCR
Total RNA ble isolert ved å suspendere cellene i Isogen lysis buffer (Nippon Gene, Toyama, Japan), etterfulgt av utfelling med isopropanol.
