Abstract
kreft stamceller (cscs), inkludert de av avansert prostatakreft, er et forslag til grunn for svulst motstand mot konvensjonell kreftbehandling. Derfor er nye terapeutiske midler presserende behov for å målrette cscs. Til tross for den minimale forståelse av deres virkningsmåter, er naturlige produkter og urteterapi vært vanlig anvendes ved forebyggelse og behandling av mange kreftformer.
Berberis libanotica
Ehrenb (BLE) er en plante rik på alkaloider som kan ha anti-kreft aktivitet og et stort potensial for å eliminere cscs. Vi har testet effekten av BLE på prostatakreftceller og våre data indikerte at dette ekstrakt induserte signifikant reduksjon i celleviabilitet og hemmet proliferasjonen av humane prostatacancercellelinjer (DU145, PC3 og 22Rv1) i en dose- og tidsavhengig måte. BLE ekstrakt induserte en forstyrrelse av cellesyklusen, noe som fører til en G0-G1 arrest. Videre bemerkes vi 50% celledød, kjennetegnet ved produksjon av høye nivåer av reaktive oksydative arter (ROS). Inhibering av cellulær migrering og invasjon ble også oppnådd ved behandling med BLE ekstrakt, noe som tyder på en rolle ved inhibering av metastase. Interessant, BLE ekstrakt hadde en stor effekt på cscs. Celler ble dyrket i et 3D-kule-formasjon assay for å anrike for en populasjon av kreft stilk /stamceller. Våre resultater viste en signifikant reduksjon i sfære formasjon evne. Tre runder med behandling med BLE ekstrakt var nok til å utrydde selvfornyelse evne svært motstandsdyktig cscs. I konklusjonen, tyder våre resultater en høy terapeutisk potensial til BLE ekstrakt i målretting prostatakreft og dets cscs
Citation. El-Merahbi R, Liu YN, Eid A, Daoud G, Hosry L, Monzer A, et al. (2014)
Berberis libanotica
Ehrenb Extract Viser antineoplastiske Påvirkning av Prostate Cancer Stem /stamceller. PLoS ONE 9 (11): e112453. doi: 10,1371 /journal.pone.0112453
Redaktør: Maria Cristina Vinci, Centro Cardiologico Monzino, Italia
mottatt: 23 juli 2014; Godkjent: 08.10.2014; Publisert: 07.11.2014
Copyright: © 2014 El-Merahbi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av midler fra Medisinsk praksis Plan-MPP (AUB-FM) og den libanesiske National Council for Scientific Research (CNRS) . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PC) er den vanligste diagnosen non-kutan malignitet og den tredje vanligste årsaken til kreftdødelighet i den vestlige mannlige befolkningen [1], [2]. Primær PC er androgen-avhengige i naturen og er vanligvis behandles med androgen deprivasjon (ADT). Oftest, men fører hormonbehandling til tilbakefall i et par år og PC etter hvert utvikler seg til en androgen-uavhengig stat, eller en såkalt kastrering motstandsdyktig PC (CRPC). CRPC er et offensivt metastatisk og dødelig form for PC og for tiden er det ingen kjent effektiv behandling for det
Prostatakreft stamceller (cscs) å dele opp eiendommer med normale stamceller som de pleier å uttrykke høye nivåer av.: aldehyddehydrogenase (ALDH) – en avgiftende enzym – [3], multiresistens (MDR) efflukspumper og ABC-transportører [4] – [6]. Disse defensive strategier gjengi konvensjonell terapi ineffektive, på grunn av tilstedeværelsen av fast proliferative celler i tumoren bulk og et stort potensiale for sparsom de antatte kreft stammen /stamceller [7]. I tillegg har det blitt antydet at prostata cscs ikke uttrykker androgene reseptorer (AR) [8], [9] og kan ikke svare på ADT som modne tumorceller gjør. Etter ADT, kan kreftstamceller ofte klarer å fylle den på tumormasse med androgen-uavhengig PC, som er et offensivt metastatisk og dødelig form for PC.
Et bredt spekter av strategier har vært ansatt for oppdagelsen av romanen legemidler som kan bære gunstige effekter for kreftpasienter. En målrettet terapi er et presserende behov for å utrydde ikke bare kreften bulk, men også CSC basseng innenfor tumoren. Tidligere arbeid i vårt laboratorium har vist evne til å berike en populasjon av PC-stammen /forløperceller ved å dyrke dem i 3D kuler dannende dyrkningsbetingelser, nemlig såkalte prostaspheres [10], [11]. Flere studier har nylig vist at en rekke bioaktive nærings forbindelser kan ha en anti-CSC effekt. For eksempel har det nylig blitt rapportert at palmeolje-ekstrahert gamma-tokotrienol [12], polysakkarid-P (PSP), en aktiv bestanddel ekstraheres fra sopp Tyrkia halen [13], og genistein, en viktig isoflavon bestanddel i soyabønner og soyaprodukter [14], utvise sterk hemmende aktivitet på protosphere formasjon evne og tumorigenicity av PC celler. Disse stoffene har vist seg å målrette prostata cscs
in vitro
, og undertrykke tumordannelse
in vivo
. Disse funnene markere potensialet bruk av urte bioaktive forbindelser for produksjon av terapeutiske midler rettet mot CSC, enten for forebygging eller behandling av PC.
Berberis libanotica
, spesielt sine røtter, har vært brukt i tradisjonell urte libanesiske rettsmidler for revmatiske og nevralgiske sykdommer [15], [16].
B. vulgaris Hotell og
B. stata
er de to mest studerte artene av
Berberis product: [17] – [20]. Alkaloider utgjør den største klassen av forbindelser rapportert å eksistere i
Berberis
arter, og representerer et meget bredt spekter av sekundære metabolitter med viktige biologiske aktiviteter [21], [22]. Ulike urte alkaloider utstillingen
in vitro og in vivo
anti-proliferative og anti-metastatiske effekter på ulike typer kreft. Alkaloider, slik som camptothecin [23] og vinblastin [24], har allerede blitt utviklet til anti-kreft medikamenter. Berberine, en stor alkaloid karakteriserer
Berberis
arter, har vært intensivt etterforsket for sine farmakologiske egenskapene. Det ble vist å hemme migreringen av melanoma cancerceller [25], og veksten av humane tunge plateepitel carcinom tumorer i en murin xenograft modell [26], øke tumor nekrose faktor-relatert apoptose-induserende ligand i brystkreft [27], og utøver en cytotoksisk effekt mot mange cellelinjer [25], [28], [29]. Til dags dato, de biologiske og phytochemical egenskaper
B. libanotica
ekstrakter har bare blitt undersøkt i to publikasjoner rapporterer inhibering av voksen T-celleleukemi levedyktighet via etanolfraksjon [30], og inhibering av nøkkelenzymer forbundet med Alzheimers sykdom [15]. Men lite er kjent om effekten av BLE pakke på PC og spredning og levedyktigheten til cscs. Derfor er målet med denne studien er å undersøke den terapeutiske effekten av
B. libanotica
rot ekstrakt (via ammoniakk-diklormetan ekstraksjon) for å hemme proliferasjon og reduserer levedyktigheten til humane PC-cellelinjer dyrket i en konvensjonell 2D-monolag modell. Videre vil denne studien fokusere på en avansert analyse (sfære dannelse assay) for å undersøke effekten av BLE ekstrakt i målretting en beriket befolkning på prostata cscs.
Materialer og metoder
Cell Culture
Menneske prostata kreft cellelinjer, PC3, DU145, og 22Rv1 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA), og ble sendt til oss som en gave av Dr. Kathleen Kelly ved National Institutes of Health ( Bethesda, MD). Celler ble dyrket i RPMI-1640-AQ medium (Sigma, USA) supplert med 10% FBS (Sigma, USA), 1% penicillin-streptomycin (Sigma, USA) og 1% ikke-essensielle aminosyrer (Sigma, USA) og inkubert ved 37 ° C i en fuktet inkubator (95% luft, 5% CO
2). Cellene ble høstet ved trypsin-EDTA ved 37 ° C (Sigma, USA). Celler ble pelletert, resuspendert og overført til ny-75 cm
2 vevsdyrkingskolber for vedlikehold, eller sådd for eksperimenter ved en konsentrasjon på 1 x 10
4 celler /cm
2 for PC3 og Du145 og 1,5 × 10
4 celler /cm
2 for 22Rv1 cellelinje.
bLE Utvinning
røttene til
Berberis libanotica
Ehrenb ble samlet inn i september 2011 fra Cedars-området i Nord-Libanon (høyde 1400-1700 m; omtrentlig GPS-posisjon: N 34 ° 14’41 «; E 36 ° 2’15»). Ingen spesielle tillatelser var nødvendig for disse stedene /aktiviteter som de ikke involverer truede eller vernede arter. Anlegget ble identifisert ved Pr. G. Tohme (CNRS, Libanon). Bilaget prøven (kodenummer BLCS12) ble avsatt i herbariet ved Fakultet for biovitenskap II, libanesiske University, Beirut, Libanon.
De planterøttene var skygge-tørket og pulverisert ved hjelp av en elektrisk blender. Den ammoniakk-diklormetan, ekstraktet ble fremstilt som følger: 10 g av anlegget pulver ble fuktet i 2 timer med NH
4OH-løsning, etterfulgt av (100 ml) diklormetan tilsetning. Blandingen ble oppmalt i 24 timer under magnetisk omrøring, etterfulgt av filtrering. Den organiske fase ble konsentrert ved 40 ° C under redusert trykk, og kryo-tørket. De oppnådde ekstrakter ble holdt på et kjølig sted i mørke beholdere. Den rotasjonsfordamper brukte var IKA RV 10 BASIC og lyophiliser var LYOVAC GT4.
MTT /Cvtotoksisitetsmålinq
Anti-proliferative og cytotoksiske effekter av BLE ble målt
in vitro
via MTT ([3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid]) analyser. DU145 og PC3-celler ble sådd ut i 100 pl komplett medium i 96-brønners kulturplater ved en tetthet på 7500 celler /brønn og 22Rv1 celler ved en tetthet på 13250 celler per brønn. Celler ble inkubert over natten i inkubatoren og deretter behandlet i tre paralleller med forskjellige konsentrasjoner ekstrakt fortynnet i 100 pl komplett medium i 24, 48 og 72 timer. I tilfelle av ROS-passiveringsmidlet N-acetyl-L-cystein (NAC; Sigma), ble DU145-celler forbehandlet med 5 mM NAC i 30 minutter, og cellene ble deretter behandlet med 30 ug /ml BLE ekstrakt i 24 og 48 timer som ovenfor . For hvert tidspunkt ble 20 ul av 5 mg /ml – 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) -MTT reagens ble tilsatt til hver brønn og inkubert ved 37 ° C i 4 timer. Til slutt ble 100 ul Oppløsningsløsningen tilsettes til hver brønn for å oppløse de formazankrystaller. Den reduserte MTT optiske tetthet (OD) ble målt ved en bølgelengde på 595 nm ved anvendelse av en ELISA-leser (Multiskan Ex). Prosentandelen av cellelevedyktighet ble presentert som en OD forholdet mellom de behandlede og ubehandlede celler i de angitte konsentrasjoner.
trypanblått Exclusion Metode
Supernatanter inneholdende døde celler ble samlet opp og festet levende celler ble høstet med trypsin EDTA og tilsatt til supernatanten. Cellepelleten ble resuspendert i 100 ul media, og 50 ul av cellesuspensjonen ble blandet med 50 ul av trypanblått og deretter lever /døde celler ble tellet ved bruk av et hemocytometer.
Cell Cycle Analysis ved strømningscytometri
DU145 og PC3-celler ble sådd i duplikater inn i 6-brønners plater i en tetthet på 1 x 10
5-celler /brønn og ble inkubert i 24 timer før behandling for 24, 48 eller 72 timer. Cellene ble deretter høstet, vasket to ganger med PBS, sentrifugert ved 1500 rpm i 5 minutter ved 4 ° C, resuspendert i 1 ml kald PBS, fiksert i 4 ml kald absolutt etanol og deretter lagret ved -20 ° C ° til farging og analyse. Fikserte celler ble deretter behandlet i 1 time med 200 ug /ml DNase-fri RNase A, farget med 1 mg /ml propidiumjodid (PI) (Sigma, USA) og inkubert i 10 minutter i mørke i et strømningsrør (BD Flacon ). Fluorescens av PI, et mål på DNA-innhold i en cellepopulasjon, ble gjort ved hjelp av strømningscytometri (FACScan, Becton Dickinson). Totalt 10.000 gated hendelser ble kjøpt for å vurdere andelen celler i ulike stadier av cellesyklusen. Analyse av cellesyklusfordelingen ble utført ved anvendelse av FlowJo Software.
laktatdehydrogenase (LDH) analyse
Cytotoksisiteten av BLE ekstrakt på DU145-cellelinjen ble bestemt ved å måle aktiviteten av laktatdehydrogenase (LDH ) frigjøres fra cytosol av skadede celler ved hjelp av en Cytotoksisitet Detection Kit PLUS (LDH) (Roche Diagnostics GmbH). Analysen ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Kort sagt ble mellom supernatantene til kontroll og behandlede celler oppsamlet og like stort volum av reaksjonsblandingen ble tilsatt. Reaksjonsblandingene ble inkubert i 20 minutter ved romtemperatur i mørke. Etter inkubering ble absorbans bestemt ved 490 nm ved bruk av en ELISA-plateleser. Prosentandelen av cytotoksisitet ble beregnet som:. (Exp.value – spontan kontroll release) ÷ (max.control frigjøring – spontan kontroll release) × 100
ROS deteksjon av Nitro Tetrazolium analysen
DU145 cellene ble dyrket i triplikat i et 96-brønn plate med en tetthet på 1 x 10
4 celler /cm
2 og ble deretter inkubert i 24 timer før bLE ekstrakter behandling for 24, 48 eller 72 timer. I hver betingelse, ble ROS-produksjon vurderes ved en nitro tetrazolium assay (NBT, Sigma). Kulturmedier ble aspirert og cellene ble inkubert i PBS inneholdende 1 mg /ml NBT ved 37 ° C i mørke i 60 minutter. NBT ble redusert med ROS til en mørkeblå uløselig form av NBT kalt formazan som kan bli visualisert. For å kvantifisere formazanprodukt, ble den intracellulære formazanforbindelsen oppløst i KOH 2 M og DMSO 5 M løsning, og absorbans ble bestemt ved 630 nm ved hjelp av en ELISA-plateleser.
apoptose analysen
apoptose var analysert ved hjelp av det cellulære DNA-fragmentering ELISA (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland) for påvisning av BrdU-merkede DNA-fragmenter i kultursupernatantene og cellelysatene. Analysen ble anvendt i henhold til produsentens protokoll og som tidligere beskrevet [31]. Celler ble inkubert med 30 ug /ml BLE ekstrakt i 48 timer i nærvær eller fravær av 5 mM N-acetyl-L-cystein ble tilsatt 30 minutter før BLE behandling. Apoptose i kontroll ubehandlede celler ble justert til 100%, og resultatene ble nedtegnet som prosent av kontroll.
sårheling assay
For sårheling, eller bunnen av analysen ble cellene sådd ut i en seks -godt plate med de samme tall, og inkubert inntil de nådde 80-90% konfluens. Cellene ble deretter behandlet med 10 ug /ml mitomycin C (Sigma) i 2 timer for å blokkere cellulær proliferasjon. En steril 200 mL piss ble anvendt for å skrape sår med samme bredde på hvert monolag, ble platene deretter vasket to ganger med PBS for å fjerne de frigjorte celler, og de gjenværende celler ble dyrket i komplett medium med eller uten behandling. Bilder ble deretter tatt ved 0, 12, 30 og 48 timer. Den avstanden som cellene inn i såret området nummerert nedleggelse av sårene. Forsøket ble gjentatt tre ganger med duplikate målinger i hvert eksperiment.
Sphere Formation Assay
I denne studien ble alle tre cellelinjer, PC3, DU145 og 22Rv-1, var i stand til å danne kuler i ikke-heftende kultur, noe som tyder på nærvær av kreft stilk-lignende celler i disse cellelinjene. Etter telling av enkeltcellesuspensjon av prostatakreftcellelinjer, ble en konsentrasjon på 1000 celler /brønn suspendert i kald Matrigel ™ /serumfritt RPMI-1640 (01:01) i et totalvolum på 50 ul. Celler ble sådd på samme måte i en sirkulær måte rundt den nederste kanten av en brønn i en 24-brønners plate og tillatt å størkne i inkubator ved 37 ° C i 45 minutter, før 0,5 ml komplett RPMI-1640 -2% FBS medium ( med eller uten behandling) ble tilsatt forsiktig i midten av hver brønn. Spheres ble fylt opp med varmt media som i den opprinnelige seeding (med eller uten behandling) hver to til tre dager. Sfærer ble tellet etter 13 dager. Å forplante kuler, ble mediet aspirert og Matrigel ™ ble spaltet med 0,5 ml oppløsning Dispase (Invitrogen, Carlsbad, CA, 1 mg /ml, oppløst i RPMI-1640 medium ufullstendig) i 60 minutter ved 37 ° C. Sfærer ble oppsamlet, inkubert i 1 ml varm trypsin-EDTA ved 37 ° C i 5 minutter, og deretter ført gjennom en 27-gauge sprøyte 5 ganger. Cellene ble talt ved et hemocytometer og re-seeded.
Transwell Invasion Assay
For invasjonen analysen, 2,5 x 10
5-celler ble sådd i et serumfritt medium med eller uten behandling i toppkammeret på Matrigel ™ belagte membran (24-brønns innsats, porestørrelse, 8 pm; Falcon), og et medium supplert med serum ble benyttet som en chemo-tiltrekningsmiddel i det nedre kammer. Hver brønn ble nylig belagt med 100 ul av Matrigel ™ (BD Bioscience) i en fortynning på 1:10 i kald PBS og ble deretter lufttørket over natten før invasjonen analysen. Celler ble tillatt å migrere gjennom membranen belagt med Matrigel ™ ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator i 24 og 48 timer. Ikke-migrerende celler i det øvre kammer ble deretter forsiktig skrapet av med en bomullsspiss applikator. Invaderende celler på den nedre overflate av membranen ble fiksert og farget med hematoksylin og eosin. Etter farging, ble det totale antallet invaderende celler telles under lysmikroskop (× 10 mål) fra 6 sammenhengende felt for hver brønn.
RNA ekstraksjon og kvantitativ real time PCR (QRT-PCR)
Total RNA ble ekstrahert fra celler, behandlet eller ikke-behandlet med 30 ug /ml bLE ekstrakt i 48 timer, ved bruk av RNeasy Micro Kit (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. cDNA ble generert fra total RNA ved hjelp av Super Script III First Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen), og PCR ble utført ved anvendelse av platina Taq-polymerase (Invitrogen). For kvantitativ RT-PCR, ble amplifisering trinnet skjer ved hjelp av SYBR grønn PCR masterblanding (Applied Biosystems, Bedford, MA). Alle reaksjoner ble kjørt i duplikat ved hjelp av spesifikke primere som er oppført nedenfor, og alle verdier ble normalisert til huset holde genet GAPDH. Primerne som ble brukt var: GAPDH-F: 5 «ACCTGGCTAGCGAAAAGCAA3»; GAPDH-R: 5’CCACTTTGTCAAGCTCATTTCCT3 «; Sox2-F: 5’AACCCCAAGATGCACAACTC3 «; Sox2-R: 5’GCTTAGCCTCGTCGATGAAC3 «; Oct4-F: 5’AGAACATGTGTAAGCTGCGG3 «; Oct4-R: 5’GTTGCCTCTCACTCGGTTC3 «; Nanog-F: 5’ACCTCAGCTACAAACAGGTGAA3 «; Nanog-R: 5’AAAGGCTGGGGTAGGTAGGT3 «; CD44-F: 5’TTTGCATTGCAGTCAACAGTC3 «; CD44-R: 5’GTTACACCCCAATCTTCATGTCCAC3 «; CD166-F: 5’TGGCAATATCACATGGTACAGG3 «; CD166-R. 5’AGCCTTGGTTGTCTTGTACTC3 «
Data Analysis
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Microsoft Excel 2013. Betydningen av dataene ble analysert ved hjelp av en t-test, og forskjeller mellom to betyr med p 0,05 (*) og p. 0,01 (#) ble vurdert som viktig og svært viktig, henholdsvis
Resultater
bLE ekstrakt hemmet PC celleproliferasjon i en dose og tidsavhengig måte
Vårt første mål var å undersøke
in vitro
effekter av bLE pakke på PC cellevekst og levedyktighet. Ved hjelp av MTT-analyser (fig. 1A), spredning aktivitet av PC-cellelinjer Du145, PC3 og 22Rv-1 ble funnet å være inverst korrelert med ekstrakt-konsentrasjonen i kulturmediet. Etter 72 timers behandling ble påbegynt den hemmende virkning ved lave konsentrasjoner og signifikant inhiberte proliferasjon med 50% når PC-celler ble dyrket i media som følger med 30 ug /ml BLE ekstrakt. Ved høyere konsentrasjon ekstrakt (100 ug /ml), rundt 75% av den anti-proliferativ effekt var signifikant oppnådd. Disse resultatene var forenlig med konfluens endringer i kultur (figur S1) og verifisert av trypanblått eksklusjons analyser (Fig. 1B). Ved høye konsentrasjoner (60 og 100 ug /ml), ble det observert øket cytotoksisitet og celledød.
Etter inkubasjon av de tre prostatakreft-cellelinjer (DU145, PC3 og 22Rv-1) i 24, 48 og 72 t med eller uten behandling med bLE ekstrakt, ble celleproliferasjon bestemt. Resultatene er uttrykt som en prosentandel av den studerte gruppen sammenlignet med kontroll. Data representerer et gjennomsnitt av fem uavhengige eksperimenter. Dataene er rapportert som gjennomsnitt ± SD (* P 0,05; # P 0,01).
BLE ekstrakt indusert cellulær toksisitet på DU145 cellelinje
BLE var cytotoksiske og indusert betydelig celledød i DU145 cellelinjen i et dose- og tidsavhengig måte (fig. 2). Den cytotoksiske potensialet i BLE ekstraktet ble bestemt basert på måling av intracellulær LDH-enzym, som er en stabil cytosoliske enzymet frigjøres i cellekulturmediet ved plasmamembranskade. En 30% cytotoksisk virkning ble betydelig oppnådd etter 48 timer med 100 ug /ml og ved 72 timer med 60 ug /ml. Men den maksimale prosentandel av celledød var rundt 50% etter 72 timer med behandling i en konsentrasjon på 100 ug /ml av BLE ekstrakt.
Celledød ble bestemt ved laktat-dehydrogenase (LDH) assay ble behandlet med eller uten indikerte konsentrasjoner av BLE ekstrakt til 24, 48 og 72 timer. Celledød ble beregnet som prosentandelen av LDH-frigivelse i henhold til et tidligere nevnte formel. Data representerer et gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter. Dataene er rapportert som gjennomsnitt ± SD (* P 0,05; # P 0,01).
BLE pro-oksidativ aktivitet indusert DU145 celledød
Intracellulær reaktive oksygenforbindelser (ROS ) produksjon ble målt ved anvendelse av nitro tetrazolium (NBT). Intensiteten av fargestoffet er omvendt proporsjonal til tilstedeværelsen av ROS. Resultater fra Figur 3 angir en dose- og tidsavhengig reduksjon av NBT. NBT reduksjons ble initiert ved 24 timer med 100 ug /ml, mens den maksimale prosentandel av NBT reduksjons var etter 72 timers behandling med 100 ug /ml BLE ekstrakt. Interessant, i nærvær av en ROS scavenger (N-acetyl-L-cystein, NAC), BLE mislyktes i å påvirke cellenes levedyktighet ved 24 timer og 48 timer. Videre BLE-indusert cellulær DNA-fragmentering, en indikasjon på apoptose og celledød, ble ikke sett i nærvær av NAC (fig. S2). Dette tyder på at BLE ekstrakt induserer celledød ved induksjon av ROS produksjon.
ROS-produksjon ble målt ved nitro tetrazolium (NBT) reduksjon i DU145 cellelinje med eller uten behandling med indikerte konsentrasjoner av BLE ekstrakt til 24, 48 og 72 timer. NBT reduksjon ble beregnet som prosentandelen av kontroll av den samme gruppe. Data representerer et gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter. Dataene er rapportert som gjennomsnitt ± SD (* P 0,05; # P 0,01).
BLE ekstrakter indusert cellesyklus arrest i G0-G1 fase
I et forsøk på å forstå hvordan BLE ekstrakt er i stand til å redusere celletallet og hemme celleproliferasjon, søkte vi å analysere cellesyklus. Vi undersøkte cellulært DNA-innhold fordeling ved strømningscytometri etter 24, 48 og 72 timer fra behandlingen. Cellesyklusanalyse viste at DNA-innholdsdistribusjon blir endret i BLE-behandlede PC3 (tabell 1) og DU145 (Tabell 2) celler. Som oppsummert i tabell 1, BLE behandling av PC3-celler med enten 10 ug /ml eller 30 pg /ml forårsaket en økning, i løpet av 24 timer, i antall celler i G1-fasen av cellesyklusen, og gir bevis på G1 arrest. Etter 48 timer og 72 timer etter behandling, økte G1 populasjonen fra mindre enn 50% i kontrollgruppen for mer enn 60% i PC3-celler behandlet med BLE ekstrakt ved 10 ug /ml eller 30 pg /ml. Interessant nok ble dette i forbindelse med en samtidig reduksjon i prosentandelen av celler i S-fasen, og en oppsamling av pre-G1 (G0) faseceller. Samme profil ble sett når DU145-celler ble utsatt for den samme behandling og analyse (tabell 2). Disse dataene antyder at BLE behandlingsresultater i en forstyrrelse av cellesyklusen.
BLE ekstrakt sterkt redusert migrasjon og invasjon evner DU145 cellene
Neste, vi undersøkt virkningen av BLE ekstraktet på cellemigrering og invasjon ,, to fenotyper som er forbundet med progresjon til metastase. Ved hjelp av en sårhelende assay, i nærvær av mitomycin C for å inhibere celledeling, BLE behandling undertrykte betydelig cellemigrering evne DU145-celler sammenlignet med kontrollen, hvorved såret ble fullstendig leget etter 48 h (fig. 4A og B) . Disse data var kompatible med invasjon analysen der ved behandling med 30 ug /ml BLE ekstrakt, invasjon evne til, som reaksjon på FBS, ble signifikant redusert med mer enn tre folder sammenlignet med kontrollen (Fig. 4 C og D). Interessant, BLE behandling signifikant redusert basal invasjon (uten FBS) av cellene når sammenlignet med kontrollen. Dessuten, og etter korrigering for virkning på proliferasjonen /apoptose, effekten av BLE på invasjon forble signifikant mellom behandling og kontroll-gruppen. Dette tyder på at BLE ekstrakt har en høy hemmende effekt på PC-celle migrering og invasjon.
(A) En ripe, i DU145-celler, ble laget ved hjelp av en gul spiss, og bilder ble tatt ved t = 0 timer, 12 timer, 30 timer og 48 timer, med eller uten behandling, og kvantifisering av diameteren til lukking av sår ble målt over tid (B). Data representerer et gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter. Dataene er rapportert som gjennomsnitt ± SD (* P 0,05; # P 0,01). (C): representative bilder av trans-invasjon godt assay. DU145 celler ble sådd ut på Matrigel ™ belagte membran i det øvre kammer til det trans godt og ble enten behandlet eller ikke behandlet med 30 ug /ml BLE ekstrakt i nærvær eller fravær av FBS i det nedre kammer. Celler som invaderte til det nedre kammer etter 48 timer ble fiksert med metanol, farget med H E, telles og representert som en prosentandel av invaderte celler sammenlignet med kontrollen (D). Data representerer et gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter. Dataene er rapportert som gjennomsnitt ± SD (* P 0,05; # P 0,01).
BLE ekstrakt rettet en beriket befolkning på PC stilk /stamceller ved hjelp av 3D-kuler-formasjon analysen
evnen til å danne og forplante kuler i ikke-klebende kulturen er en av karakteristikkene av cscs. For å bekrefte at BLE behandling kan hemme prostata CSC egenskaper, dannelse av prostaspheres fra PC-cellelinjer ble studert i nærvær eller fravær av BLE ekstrakt. I denne analysen ble prostaspheres generert ved å bygge 1000 enkle celler per brønn i Matrigel ™ ved lav serumkonsentrasjon (2% FBS). Etter dyrking DU145-celler i 13 dager, et lavt antall av disse cellene var i stand til å danne tumor kuler i ubehandlede tilstander med en kule-formingsenhet (SFU) på 6,8%. Imidlertid førte behandling med 20 ug /ml eller 30 pg /ml BLE ekstrakt betydelig redusert antall prostaspheres med mer enn 50% (Fig. 5A). I tillegg ble ingen kuler observert i brønner behandlet med BLE ekstrakt i en konsentrasjon over 30 pg /ml. Interessant var den gjennomsnittlige størrelse på BLE ekstraktbehandlede prostaspheres var signifikant mindre sammenlignet med kontrollen (Fig 5B og D), og dette kan forklares ved den signifikante reduksjon i det gjennomsnittlige antall celler pr prostasphere som vist i figur 5C.
(A) Sphere-dannende enhet (SFU) er vist, med eller uten BLE behandling (20, 30, 60 og 100 ug /ml). Genererte kuler er referert til som G1 (Generasjon 1) kuler. SFU blir beregnet i henhold til følgende formel: SFU = (antall kuler telles ÷ antall inngangsceller) x 100. Data representerer et gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter. Dataene er rapportert som gjennomsnitt ± SD (* P 0,05; # P 0,01). (B) Representative bilder av DU145 prostaspheres med eller uten BLE behandling. Bilder ble visualisert ved Carl Zeiss mikroskop med 10x forstørrelse og analysert av Carl Zeiss Zen 2012 image programvare. (C) Kvantifisering av den gjennomsnittlige diameter av DU145 prostaspheres med eller uten behandlingsbetingelsene. Data representerer et gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter. Dataene er rapportert som gjennomsnitt ± SD (* P 0,05; # P 0,01). (D) Kvantifisering av gjennomsnittlig antall celler per DU145 prostasphere med eller uten behandling. Data representerer et gjennomsnitt av tre uavhengige eksperimenter. Dataene er angitt som middelverdi ± SD (* P 0,05; # P 0,01).
selvfornyelse aktivitet er ansett for å være en av de viktigste kjennetegnene på stammen /stamceller. Derfor, for å sikre at vår pakke er i stand til å målrette den selvfornyende CSC bassenget, ble sfære formasjon aktivitet vurderes over fem generasjoner. DU145-celler som var i stand til å danne kuler i den første generasjon (G1) ble samlet og formeres ved å dissosiere kulene inn i enkeltceller, og deretter det samme antall celler (1000 celle /brønn) ble re-seeded. Assayet ble utført inntil den femte generasjon (G5), etter en eksperimentell design som er vist i figur 6B. Behandling med 20 ug /ml BLE ekstrakter var tilstrekkelig til å redusere dannelsen sfære evnen til rundt 50% når det er behandlet en gang og konsekvent over fem generasjoner (Fig. 6A). Interessant, ved påfølgende behandling og spredning av celler som var i stand til å motstå og overleve den første BLE behandling på G1, ble svært degradert SFUs produsert på G2, og ingen prostaspheres ble dannet på G3. Spesielt, celler som ble behandlet én gang på G1 var i stand til å gjenvinne sin sfære-dannende egenskaper ved ytterligere formering av de prostaspheres i fravær av noen behandling (Fig. 6B). Dette tyder på at serie behandling med BLE ekstrakt er nødvendig, og er i stand til å målrette den svært motstandsdyktig cscs, og dermed sluknings deres selvfornyelse evne. Spesielt,-celler behandlet med 30 ug /ml BLE ekstrakt viste en signifikant reduksjon i uttrykket nivåer av Sox2, Oct4, Nanog, CD44 og CD166, alle markører som er kjent for å bli uttrykt i prostata kreft stamceller, sammenlignet med kontroll ikke-behandlede celler (fig. S3).
(A) SFU erholdt fra serielt passert prostaspheres i løpet av fem generasjoner vist under ubehandlede betingelser (alltid få tak) og med 20 ug /ml BLE ekstrakt-behandlet tilstand (behandlet en gang etter forplantning av kontroll). (B) Prostata CSC ble anriket fra DU145 cellelinje og behandles med enten BLE ekstrakter (20 ug /ml) eller media (kontroll) (G1). Etter hver forplantning, ble celler som opprinnelig ble behandlet med BLE ekstrakt (20 ug /ml) eller medium (kontroll) sådd ut i separate brønner. Spheres ble spredd i fem generasjoner i duplikater av hver tilstand. SFU telles, og et gjennomsnitt av to uavhengige eksperimenter er vist. Dataene er rapportert som gjennomsnitt ± SD (* P 0,05; # P 0,01).
Diskusjon og konklusjoner
Det overordnede målet for kreftbehandling er å målrette bare kreftceller , og samtidig la levedyktige normale celler uskadd. I denne studien
Berberis libanotica
ekstrakt oppviste antineoplastiske effekter ved å redusere levedyktighet og spredning av tre PC-cellelinjer på en tids- og doseavhengig måte, hvorved 22RV-1-cellelinjen viste en høyere følsomhet til behandling enn de andre to cellelinjer (PC3 og DU145). En konsentrasjon på 30 ug /ml av BLE ekstrakt var vellykket i å oppnå IC50, mens en konsentrasjon på 60 ug /ml induserte en 70% inhibering proliferasjon og celledød ble oppnådd ved 100 ug /ml.
