Abstract
Bakgrunn
Til tross for fremgang i adjuvant kjemoterapi i de siste tiårene, bukspyttkjertel og tykktarm kreft forbli vanligste dødsårsakene i verden. Bakterielle toksiner, som spesifikt binder til celleoverflate-eksponerte glykosfingolipider, er en potensiell ny terapi. Vi bestemte uttrykk for globotriaosylceramid (Gb3Cer /CD77), den Shiga toksin-reseptoren, i menneskelige bukspyttkjertel og tykktarm adenokarsinomer.
metodikk /hovedfunnene
Tissue lipid ekstrakter av matchet par av kreft og tilstøtende normalt vev fra 21 bukspyttkjertel og 16 tykktarmskreftpasienter ble undersøkt med tynnsjiktskromatografi overlagsanalysen kombinert med en ny massespektrometri tilnærming. Gb3Cer /CD77 ble lokalisert ved immunfluorescens mikroskopi av frysesnitt fra ondartede og tilsvarende sunne vevsprøver. 62% av bukspyttkjertelen og 81% av kolon adenokarsinomer viste økt Gb3Cer /CD77 uttrykk, mens 38% og 19% av ondartet bukspyttkjertel og tykktarm vev, henholdsvis, gjorde det ikke, noe som indikerer en sammenslutning av denne markøren med neoplastisk transformasjon. Dessuten ble Gb3Cer /CD77 assosiert med dårlig differensiering (G 2) i bukspyttkjertelkreft (P = 0,039). Massespektrometrisk analyse dokumentert forbedret uttrykk for Gb3Cer /CD77 med lange (C24) og kortkjedede fettsyrer (C16) i ondartet vev og pekte på tilstedeværelsen av hydroksylerte fettsyrer lipoforms, som er foreslått til å være viktig for reseptoren målgruppe. De kunne påvises i 86% av pankreas og omtrent 19% av kolon adenokarsinomer. Immunohistologi av vev frysesnitt angitt tumor-sammenslutning av disse reseptorene.
Konklusjon /Betydning
Forbedret uttrykk for Gb3Cer /CD77 i de fleste bukspyttkjertel og tykktarm adenokarsinomer ber vurdering av Shiga toksin, sin B-subenheten eller B-subenhet-derivater som nye terapeutiske strategier for behandling av disse utfordrende malignitet
Citation. Distler U, Souady J, Hülsewig M, Drmic-Hofman jeg, Haier J, Friedrich AW, et al. (2009) shigatoksin Receptor Gb3Cer /CD77: Tumor-foreningen og lovende terapeutisk mål i bukspyttkjertelen og tykktarmskreft. PLoS ONE 4 (8): e6813. doi: 10,1371 /journal.pone.0006813
Redaktør: Georg hacker, Technical University München, Tyskland
mottatt: 30 mars 2009; Godkjent: 22 juni 2009; Publisert: 28 august 2009
Copyright: © 2009 Distler et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien har blitt finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft (URL: www.dfg.de) gir FR2569 /1-1 og MU845 /4-1, den Graduiertenkolleg GRK1409 /1 (URL: http: //zmbe.uni-muenster.de/GRK1409 /) og Deutsche Krebshilfe (URL: www.krebshilfe.de) gi DKH 106742. de bevilgende myndighet hadde noen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerer. interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel og tykktarm kreft er den fjerde og nest hyppigste årsakene til kreft dødelighet i den vestlige verden, henholdsvis regnskap for anslått. 84,250 dødsfall i 2008 i USA alene [1]. Med en median overlevelse periode på ca 6 måneder og 5-års overlevelse mindre enn 5% bukspyttkjertelkreft blant de mest dødelige av de vanligste svulster. Prognosen for pasienter som lider av tykktarmskreft med fjernmetastaser ved diagnosetidspunktet er nesten like dårlig som for kreft i bukspyttkjertelen [2]. Bare om lag 10-15% av kreft i bukspyttkjertelen pasienter er kandidater for potensielt kurativ kirurgi [3], [4], som understreker det presserende behovet for å utvikle nye strategier for å behandle pasienter med disse unresectable svulster. Målrettet behandling, for eksempel basert på bakterier og plantegiftstoffer eller monoklonale antistoffer, som gjenkjenner celleoverflate glykosfingolipider (GSLs), som er overuttrykt i bukspyttkjertelen og /eller tykktarmskreft, kan vise seg å være lovende metoder for tilleggsbehandling etter operasjonen [5] -. [9]
GSLs, bestående av en hydrofil oligosakkaridkjede og en hydrofob ceramid membrananker [10], er uttrykt som integrerte bestanddeler av lipid flåter i den ytre paknings av plasmamembranen [11]. Foruten sitt engasjement i cellevekst regulering og celle adhesjon [12], celleoverflaten eksponerte oligosakkaridkjedene av GSLs «tjene» som festesteder for bakterier [13] og utnyttes av ulike giftstoffer, inkludert Shiga toksiner (Stxs), for overflatebinding , intracellulær trafficking, og signal hendelser [14]. Stxs (også betegnet verotoxins), som er produsert fra patogene
Escherichia coli-stammer
[15] – [19], tilhører den AB
5 familien av bakterielle toksiner. De består av en enzymatisk aktiv A-underenhet som hemmer proteinsyntese ved å modifisere verts rRNA og et ikke-toksisk homopentameric B-subenhet [20], [21]. B-pentamer bindes til sin fortrinnsrett GSL reseptor globotriaosylceramid (Gb3Cer /CD77) og utløser intern av AB
5-Gb3Cer kompleks av reseptor endocytose
via
clathrin-belagt vesikler [22] eller ved endocytic ruter som ikke involverer clathrin belagt groper [23]. Toksinet-reseptorkomplekset undergår retrograd transport gjennom Golgi-nettverket til det endoplasmatiske retikulum. Etter retro-translokasjon inn i cytosol [24], et molekyl av proteolytisk prosessert A
1-underenhet kan hemme proteinsyntese og drepe en celle.
Aberrant ekspresjon av GSLs forekommer i nesten alle mennesker og dyr -kreft [12], [25] og mange tumorassosierte antigener er nå kjent for å være GSLs. Økt ekspresjon av Stx-reseptoren Gb3Cer /CD77 er blitt rapportert om forskjellige faste tumorer så som eggstokk [26] og brystkreft [27] eller ondartet meningeom [28]. Nylig har forbedret ekspresjon av Gb3Cer /CD77 blitt beskrevet som å korrelere med utviklingen av metastase i tykktarmskreft [9], [29]. Gb3Cer /CD77 muliggjør også tumor-spesifikke plasmamembranen lokalisering av proteiner (e. G. Hsp70) [30]. Som celleoverflatemolekyler, tumor-assosiert GSLs er tilgjengelig for antistoffer eller GSL-bindende toksiner (dvs. STX), noe som gjør dem kandidat mål for onkologiske applikasjoner [31]. Følgelig er Stx-ligand Gb3Cer /CD77 for tiden under etterforskning som et potensielt mål kandidat for giftbaserte legemiddel [28], [29], [32], [33].
I denne studien analyserte vi bukspyttkjertelen og tykktarmskreft vev for ekspresjon av Gb3Cer /CD77, ved hjelp av tynnsjiktkromatografi (TLC) av GSL-ekstrakter fra vev og immunhistokjemi farging av vev frysesnitt. Forbedret uttrykk for STX-reseptorer ble observert hos de fleste bukspyttkjertel og tykktarm kreft vev, henholdsvis, noe som indikerer en sammenheng med neoplastisk transformasjon. Videre strukturelle modifikasjoner av de lipid ankere for tumorassosierte Gb3Cer /CD77 arter ble påvist i cancervev fra begge tumor typer som anvender en ny massespektrometri tilnærming kombinert med TLC immundeteksjon [8], [34]. Dermed forbedret uttrykk og lipid endringer av Gb3Cer /CD77 i Kreftsvulster gjengi dette målet en lovende kandidat for Stx og /eller STX-konstruksjoner i onkologiske anvendelser av både bukspyttkjertel og tykktarm maligniteter.
Materialer og Metoder
Etikk erklæringen
The Local Etisk komité i Medical Council of Westfalen-Lippe og det medisinske fakultet ved Universitetssykehuset Münster (Münster, Tyskland) godkjent den aktuelle studien (referansenummeret 1IXHai). Alle pasientene ble informert og samtykket skriftlig.
Kirurgiske prøver
Studien ble utført ved hjelp av prøver av bukspyttkjertelen (n = 21) og tykktarm (n = 16) adenokarsinomer fra pasienter som hadde gjennomgått kirurgi for deres primære svulster [5]. Tumorhistologi ble bestemt i henhold til kriteriene i UICC [35]. De clinicopathologic kjennetegn ved kohort av pasienter med karsinom er beskrevet i Utfyllende Tabeller S1 og S2. Tumorstykkene ble hurtigfrosset i flytende nitrogen umiddelbart etter kirurgiske inngrep og lagret ved -80 ° C inntil analyse. Tilsvarende kontrollprøver ble hentet fra samme pasient på samme organ nettstedet uten makroskopisk tumor engasjement som ble bekreftet av histologisk undersøkelse.
Utarbeidelse av Lipid Utdrag fra kirurgiske prøver
vev ble homogenisert og ekstrahert to ganger med 2 ml kloroform /metanol (1/2, v /v), 2 ml kloroform /metanol (1/1, v /v), og 2 ml kloroform /metanol (2/1, v /v). De kombinerte supernatantene til hvert vevsekstrakt (12 ml) ble tørket ved rotasjonsfordamping og fosfolipider ble forsåpet ved inkubering i 4 ml vandig 1 N NaOH i 1 time ved 37 ° C. Etter nøytralisering med 400 ul av 10 N HCl, ble prøvene dialysert mot avionisert vann og tørket ved roterende fordampning. Ekstraktene ble justert til definerte volumer av kloroform /metanol (2/1, v /v), tilsvarende 0,1 mg fuktig vekt pr mL.
Rensing av Stx1
Stx1 ble renset fra
E. coli
C600 (H19J) som bærer
stx
1
genet fra
E. coli
O26: H11 belastning H19 [36]. I korthet ble bakterier ble oppløst ved sonikering og ekstrahert med polymyxin B (3000 U /ml) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Tyskland). Etter sentrifugering ble supernatanten inneholdende urene Stx1 konsentrert ved ultrafiltrering og underkastet kromatografi på hydroksylapatitt kolonne fulgt av kromatofokusering [37]. kolonnefraksjonene som inneholdt Stx1 ble slått sammen, dialysert og aliquoter ble lagret ved -70 ° C inntil bruk. Renheten av Stx1 preparatet ble overvåket ved SDS-PAGE, og den strukturelle integriteten av toksinet ble kontrollert ved peptidkartlegging ved anvendelse av massespektroskopi [21]. Biologisk aktivitet ble bestemt ved Vero celle cytotoksisitet [38].
Anti-Gb3Cer /CD77 og Anti-Stx1 Antistoffer
Klargjøring og spesifisitet av polyklonale kylling anti-Gb3Cer /CD77 antistoff som gjenkjenner den Galα1 -4Galβ1-4Glc-rest av Gb3Cer /CD77 arter har blitt beskrevet [39], [40]. Stx1 ble påvist med mus IgG1 monoklonalt anti-Stx1 antistoff 109/4-E9b (Sifin, Berlin, Tyskland).
Høy ytelse tynnsjiktskromatografi (TLC) og Reference GSLs
En blanding av nøytrale GSLs fra humane erytrocytter, bestående av monohexosylceramide, lactosylceramide, Gb3Cer /CD77, og globotetraosylceramide (Gb4Cer), ble anvendt som referanse [40] for TLC antistoff og Stx1 overleggs analyser. Nomenklaturen av GSLs følger IUPAC-IUBM anbefalinger 1997 [41]. Referanse GSLs og vev lipid ekstrakter ble påført på glass-støttet forbelagt kiselgel 60 med høy ytelse tynnsjiktskromatografi (TLC) plater (ingen 1.05633.0001;. Merck, Darmstadt, Tyskland) med en automatisk applikator (Linomat IV, CAMAG, Muttenz, Sveits) og separert i kloroform /metanol /vann (120/70/17, hver av vol., med 2 mM CaCl
2). Referanse GSLs ble farget med orcinol.
TLC Overlay analysen
Gb3Cer /CD77 ble påvist ved hjelp av overleggs polyklonale kylling antistoff eller Stx1 som beskrevet [40], [42]. Primær anti-Gb3Cer /CD77 og videregående alkalisk fosfatase-merket antistoff (Dianova, Hamburg, Tyskland) ble brukt i 1:2000 fortynninger. Bundne sekundære antistoff ble visualisert ved fargefremkalling med 0,05% (vekt /volum) 5-brom-4-klor-3-p-toluidin indolylphosphate salt (BCIP, ingen 6368,3;. Roth, Karlsruhe, Tyskland). De immun Kromatogrammene ble vasket med glycin-buffer og lagret ved -20 ° C. Blå immunopositive Gb3Cer /CD77-band ble kvantifisert med en CD60 scanner (Desaga, Heidelberg, programvare ProQuant
R, versjon 1.06.000). Gb3Cer /CD77 mengder ble bestemt semikvantitativt som relative uttrykk sammenlignet med referanse GSLs. De sekundære densitometriske data (se «Statistical Analysis» nedenfor) ble brukt for å definere 4 kategorier av svulst uttrykk i forhold til normalt vev ved formell cut-punkt-analyse: høy overekspresjon (kategori I, 4000 x), (kategori II moderat overekspresjon, 700 x 4000), lik uttrykk (kategori III, -700 x 700), og senket uttrykk (kategori IV, x -700) for bukspyttkjertelen karsinom og høy overekspresjon (kategori i, 2000 x), moderat overekspresjon (kategori II, 200 x 2000), lik uttrykk (kategori III, -200 x 200), og senket uttrykk (kategori IV, x -200) for tykktarmskreft, henholdsvis
Immunohistochemistry.
immunocytokjemisk farging ble gjennomført som beskrevet [8]. Kort sagt ble frysesnitt (4 um) inkubert med anti-Gb3Cer /CD77-antistoff (1:15) og et anti-CD31-antistoff (1:200) (mus lgG1, klon MEM-05, Immunotools, Friesoythe, Tyskland). Antistoffer som binder til Gb3Cer /CD77 og CD31 ble detektert med dichlorotriazinylamino fluorescein (DTAF) -merket anti-kylling-IgY-antistoff (Dianova) og Alexa Fluor 568-konjugert anti-muse-IgG-antistoff (Invitrogen, USA, CA), fortynnet 1: 40 og 1:250, respektivt. For negative kontroller, ble immunhistokjemi utført ved hjelp av kylling preimmunserumet og irrelevant mus IgG1 antistoff (Immunotools). Nukleær DNA av cellene ble farget med 4 «, 6-diamidine-2-fenylindol-dihydroklorid (DAPI, Sigma-Aldrich, USA). Fluorokromkonjugerte merkede antistoffer og DAPI-farget kjerner ble evaluert under en fluorescens mikroskop (Axioskop, Zeiss, Jena, Tyskland), opprinnelig forstørrelse × 40 (objektiv lense Plan-Neofluar, numerisk apertur 0,75), etter publiserte protokoller [43]. For å bekrefte den hydrofobe karakter av målet for anti-Gb3Cer /CD77-antistoffer, ble lipidene ekstrahert med metanol og kloroform /metanol (1/1, v /v) fra de monterte delene før farging.
Infrarød Matrix-assistert Laser desorpsjon /ionisering Orthogonal Time-of-Flight (IR-MALDI-o-TOF) massespektrometri
spesifikasjonene for IR-MALDI-o-TOF massespektrometer (MDS SCIEX, Concord, Ontario , Canada) og direkte TLC-IR-MALDI-MS-analyse fra immunopositive band av Stx1 TLC overlegg analysen har blitt beskrevet av Distler et al. [34]. GSLs ble analysert i den positive ion modus ved hjelp av glyserol som matriks.
Statistical Analysis
Primær densitometriske data av immunostained Gb3Cer /CD77 band og sekundære densitometriske data, hentet fra differanseverdier av tilpassede par beregnet av trekke normal fra relaterte tumorvev verdier, ble kompilert med programvarepakken SPSS, versjon 14.0.2 (SPSS Inc., Chicago, IL) for parametrisk statistisk analyse. test Skiltet ble brukt for settet av primære densitometriske data for å undersøke betydningen av forholdet mellom Gb3Cer /CD77 uttrykk og neoplastisk transformasjon. Median testen ble utført for grunnskolen og videregående densitometriske data for å teste om Gb3Cer /CD77-uttrykk var signifikant forskjellig mellom de svulstene som omfatter ulike clinicopathologic kategorier. Korrelasjonskoeffisientene ble beregnet for rangert verdier av den primære densitometriske data fra normale og tumorvev, henholdsvis, og de rangerte differanseverdier. Kendall τ ble brukt til å vurdere graden av sammenheng mellom Gb3Cer /CD77-uttrykk og histopatologisk gradering. Alle testene ble to tailed og αwas satt til 0,05.
Resultater
Vi undersøkt vev fra 21 bukspyttkjertelen og 16 kolon adenokarsinom pasienter for uttrykk av Stx-reseptor Gb3Cer /CD77 (for struktur se figur 1 ). For dette formål råolje lipidekstrakter og frysesnitt fra postoperativ tilpasset par av maligne
versus
hosliggende upåvirket vev fra de samme pasienter ble analysert ved hjelp av TLC overlegg teknikk og immunfluorescens-mikroskopi. For å få ytterligere konstruksjonsdetaljer av tumorassosierte modifikasjoner av Gb3Cer /CD77 arter, ble en ny massespektrometri metode som anvendes som kombinerer TLC immundeteksjon med IR-MALDI-o-TOF-MS [8], [34]. Den våte vekt av de undersøkte kreft og friskt vev og de tilsvarende patologi dataene er listet i tabellene Supplerende S1 og S2.
Alikvoter fra urene lipidekstrakter ekvivalent med 2 mg vev våtvekt av normal (N) og tumorvev (T) ble samtidig, separert ved hjelp av TLC. Nøytrale GSLs fra humane erytrocytter tjente som positiv referanse i overlay-analyse (R, 10,8 mikrogram) og orcinol flekken (O, 16,0 mikrogram). Sammendraget av Gb3Cer /CD77-uttrykk i kreftvevet begge svulst enheter er gitt i tabell 1, og histopatologiske data fra bukspyttkjertel og tykktarm karsinom er oppsummert i Utfyllende Tabeller S1 og S2, henholdsvis. Representative eksempler på bukspyttkjertelen (A) og tarmkreft (B) av tumor kategori I til IV er vist. Ingen av de undersøkte colon carcinoma ble funnet med lik ekspresjon av Gb3Cer /CD77 i tilstøtende normalt vev (B). Dermed kategori III vært ledig i kohort av pasienter. C, strukturen av Stx1 reseptor Gb3Cer (D18: 1, C16: 0). Ceramid (Cer) lipid anker fortrinnsvis vises i friske mennesker vev med C24 eller C16 fettsyre, men konstant sfingosin (D18: 1).
TLC immundeteksjon av Tumor-Associated Gb3Cer /CD77 i Pancreas og Colon kreft
Identiske prøver av råolje lipid ekstrakter av matchet par fra neoplastiske og tilsvarende upåvirket vev ble utsatt samtidig til TLC, etterfulgt av TLC overlegg påvisning av Gb3Cer /CD77 hjelp Stx1 og anti-Gb3Cer /CD77 antistoff. Positive bånd ble rangert i henhold til de forskjellige uttrykk for Gb3Cer /CD77; rang 1 angir den høyeste intensitet (tabell 1). Basert på densitometry, ble svulster gruppert i fire kategorier: alt fra høy (I), og moderat (II) overekspresjon, lik (III), og senket uttrykk (IV)
bukspyttkjertel kreft
Figur 1A viser fire enkelt representant Stx1 TLC overlay flekker av svulsten og ekstrakter relaterte sunt vev, som hver representerer en av de fire kategoriene av bukspyttkjertel kreft. I alt 61,9% av de undersøkte pankreatiske karsinomer viste moderat til høy overekspresjon av Gb3Cer /CD77, mens 14,3% oppviste like og 23,8% redusert Gb3Cer /CD77-ekspresjonsnivåer (se tabell 1). Globotetraosylceramide (Gb4Cer), kjent som «lav affinitet» ligand av Stx1, var umulig å oppdage i pankreastumorer og tilstøtende normalt vev ved hjelp Stx1 som deteksjon verktøy. TLC immunostains anvender polyklonale anti-Gb3Cer /CD77 antistoff var lik i resultatene til de som oppnås med Stx1 TLC overlay-analyser som viser litt høyere følsomhet i sporing av Gb3Cer /CD77-arter (se Utfyllende Figur S1 A).
Colon kreft.
Figur 1B viser tre enkelt representant Stx1 TLC overlay flekker av colonic kreft matchet par, som hver representerer en av de tre kategoriene verifisert i colonic kreft. Gb3Cer /CD77 var moderat til svært overuttrykt i 81,3% av maligne
versus
sunn kolon vev. Ingen av tykktarmskreft utstilt lik uttrykk som resulterer i ledige kategori III. Mindre Gb3Cer /CD77 ble påvist i 18,8% av tumorvevet (se tabell 1). Som i bukspyttkjertelen vev, Gb4Cer var umulig å oppdage i colontumorer og tilstøtende normalt vev ved hjelp Stx1 som deteksjon verktøy. De parallelle TLC immunostains ansette den polyklonale anti-Gb3Cer /CD77 antistoff er vist i Supplerende Figur S1B.
Immunhistokjemisk påvisning av tumorassosiert Gb3Cer /CD77 i bukspyttkjertelen og Colon Cancer
Binding av anti- Gb3Cer /CD77 antistoff til frosne deler av bukspyttkjertelen og tykktarmskreft vev og til tilsvarende friskt vev av de samme pasientene ble overvåket histochemically. Snittene ble co-immunostained med et antistoff mot endotelceller markør CD31, og cellekjerner ble visualisert med DAPI fluorokrom.
For eksempel omfattende antistoff binding til bukspyttkjertelen tumorceller (T) ble oppdaget for pasient 18 (tumor kategori i) som vist i figur 2A. I motsetning til dette ble liten eller ingen Gb3Cer /CD77 som finnes i normal pankreas vev (N). Sporadiske endotelceller i blodkar, er kjent for å bære Gb3Cer /CD77 [21], [39], [43], viste også positiv farging i bukspyttkjertelen ondartet vev.
Deler av normal (N) og tumorvev (T) av kreft i bukspyttkjertelen pasient 18 (A) og av tykktarmskreftpasient 13 (B) ble immunofarget med anti-Gb3Cer /CD77-antistoff og coimmunostained med et antistoff mot endotel-cellemarkør CD31. Cellekjerner ble påvist med DAPI. Skala barer tilsvarer 20 mikrometer. Representative eksempler på tumorer i kategori I er vist (se tabell 1). De histopatologiske data i bukspyttkjertel og tykktarm kreft er oppsummert i Utfyllende Tabeller S1 og S2, henholdsvis.
Immunohistokjemiske sammenligninger demonstrere høy Gb3Cer /CD77 uttrykk nivåer i colontumorer (T) som eksemplifisert for pasient 13, figur 2B. I motsetning til dette tilstøtende normalt vev (N) fra den samme pasient manglet Gb3Cer /CD77. Angiogenese synes å være avansert i noen undersøkte tykktarm kreft som dokumentert av CD31 og Gb3Cer /CD77 positive endotelceller i tumormassen.
Kontroll seksjoner inkubert med mus IgG1 isotype kontroller så vel som med kylling preimmunserum ikke flekken . Etter GSL utvinning av vev, Gb3Cer /CD77 var ikke lenger påvises med antistoffet (data ikke vist).
Structural Karakterisering av Tumor-Associated Gb3Cer /CD77 i bukspyttkjertelen og Colon Cancer
Stx1 positive band av TLC-separert lipid ekstrakter ble direkte analysert på TLC-plater med TLC-IR-MALDI-MS som beskrevet [34]. Massespektra ble kjøpt i positiv ion modus og ble oppdaget som enkeltvis belastet monosodiated alle Gb3Cer /CD77 arter molekylære ioner.
bukspyttkjertel kreft.
Kombinert Stx1 deteksjon og TLC-IR-MALDI-MS demonstrere individuelle sammensetningsendringer av overuttrykt Gb3Cer /CD77 arter i neoplastisk sammenlignet med upåvirket pankreatisk vev (f.eks pasient 19 (tumor kategori i), figur 3). Å analysere det øvre av de Stx1 positive trippel bånd av tumoren (T, venstre panel, innfelt), mest tallrike [M
3 * + Na]
+ molekylære ioner peke på nærværet av Gb3Cer (D18: 1 /D18: 0, C24: 0) med mettet d18: 0 sphinganine foruten den mer vanlige enumettede d18: 1 sfingosin (sphingenine). Det samme gjelder for den mindreårige [M
2 * + Na]
+ og [M
1 * + Na]
+ ioner, som refererer til de strukturene Gb3Cer (D18: 1 /D18 : 0, C23: 0) og Gb3Cer (D18: 1 /D18: 0, C22: 0), respektivt. I motsetning til dette, kan bare lav ekspresjon av Gb3Cer /CD77 påvises i den øvre Stx1 positive bånd av normal pankreas vev som vist i figur 3 (N, venstre panel). Den høye overflod [M
4 + Na]
+ ioner av lavere Stx1 positive band av svulsten (T, midtre panelet) indikerer sterk overekspresjon av Gb3Cer (D18: 1, C16: 0) i svulstvev sammen til svært lav overflod ioner i den tilsvarende friskt vev (N, midtre panelet). Men den mest fremtredende strukturelle endringer ble funnet i den laveste Stx1 positive band av kreftvev ved å oppdage [M
5 * + Na]
+ ioner (T, panel til høyre), som var umulig å oppdage i normalt vev ( N, panel til høyre). Sammenlignet med Gb3Cer (D18: 1, C16: 0) (T, midtre panel), skiftet i 16 atommasseenhet angir hydroksylering av ceramid gruppe som fører til den foreslåtte strukturen i Gb3Cer (D18: 1, H16: 0) bærer en hydroksylert C16: 0 fettsyre. I tillegg ioner ved
m /z
1064,65 indikere nærværet av Gb3Cer (D18: 0, H16: 0). Dette slående ceramid endring skjedde i 85,7% av bukspyttkjertelen svulster så langt undersøkt. Et sammendrag av de foreslåtte strukturene Gb3Cer /CD77 arter er gitt i Utfyllende tabell S3.
Lipid ekstrakter tilsvarende 2 mg våtvekt av normal (N) og svulstvev (T) av pasient 19 (tumor kategori jeg, se tabell 1 og analytiker Tabell S1) ble samtidig adskilt med TLC etterfulgt av overlay-analyse ved hjelp Stx1. De Stx1 positiv Gb3Cer /CD77 band, som er merket med pilspisser i innfellinger, ble analysert ved TLC-IR-MALDI-MS. Den fremherskende [M
3 * + Na]
+ molekylære ioner av det øvre bånd av tumorvevet (T, venstre panel) samsvarer med Gb3Cer (D18: 1 /D18: 0, C24: 0) og den mindre ioner kan være tilordnet Gb3Cer (D18: 1 /D18: 0, C23: 0) og Gb3Cer (D18: 1 /D18: 0, C22: 0), respektivt. I det øvre bånd av normalt vev (N, venstre panel) mye lavere intensiteter av disse molekylære ioner ble observert. Den høye rikelig [M
4 + Na]
+ ioner av det nedre bånd i den tumor (T, midtre panel) representerer Gb3Cer (D18: 1, C16: 0), som er synlig kun i spormengder i normalt vev (N, midtre panelet). Analyse av de laveste band av svulsten (T, panel til høyre) viste [M
5 * + Na]
+ ioner, som er veiledende for hydroksylerte Gb3Cer (D18: 1 /D18: 0, H16: 0) . Dette Gb3Cer /CD77 variant var umulig å oppdage i normalt vev (N, panel til høyre).
m /z
verdier av molekylære ioner og foreslåtte strukturer Gb3Cer /CD77-varianter av ondartede og tilstøtende normalt vev, samt referanser fra humane erytrocytter er oppført i Tilleggs tabell S3.
tykktarm kreft.
Stx1 deteksjon kombinert med TLC-IR-MALDI-MS tillatt oss å profilere de enkelte strukturene overuttrykt Gb3Cer /CD77 arter som exemplarily vist for pasient 16 i figur 4 (T, venstre panel) . rikelig høy [M
3 + Na]
+ ioner peke på Gb3Cer (D18: 1, C24: 1 /C24: 0) som de mest sannsynlige Gb3Cer /CD77 varianter i den øvre Stx1 positive band, ledsaget av mindre uttalt [M
2 + Na]
+ og [M
1 + Na]
+ -ioner, som tilsvarer Gb3Cer (D18: 1, C23: 0) og Gb3Cer (D18: 1, C22: 0), respektivt. De samme ioner, men med mye lavere intensiteter ble oppnådd fra den øvre Stx1 positive bånd av normalt vev (N, venstre panel). I det nedre bånd av tumoren (T, midtre panel), fremtredende [M
4 + Na]
+ -ioner kan være tilordnet Gb3Cer (D18: 1, C16: 0) struktur, som også er påvisbar i normalt vev, men med mindre ion intensitet (N, midtre panelet). I det laveste båndet [M
5 * + Na]
+ -ioner indikere nærværet av de Gb3Cer (D18: 1, H16: 0) variant med hydroksylerte C16: 0 fettsyre, som ikke ble funnet i normalt vev (N, panel til høyre). Denne bemerkelsesverdige ceramid modifikasjon ble funnet i omtrent 19% av colon tumor TLC immunostains hittil undersøkt. Et sammendrag av de foreslåtte strukturene Gb3Cer /CD77 arter er gitt i Utfyllende tabell S3.
Lipid ekstrakter tilsvarende 2 mg våtvekt av normal (N) og svulstvev (T) av pasient 16 (tumor kategori II, se tabell 1 og analytiker Tabell S2) ble samtidig adskilt med TLC etterfulgt av overlay-analyse ved hjelp Stx1. De Stx1 positive Gb3Cer band, som er merket med pilspisser i innfellinger, ble analysert ved TLC-IR-MALDI-MS. Den fremherskende [M
3 + Na]
+ molekylære ioner av det øvre bånd av tumorvevet (T, venstre panel) samsvarer med Gb3Cer (D18: 1, C24: 1 /C24: 0) og den mindre rikelig [M
2 + Na]
+ og [M
1 + Na]
+ ioner til Gb3Cer (D18: 1, C23: 0) og Gb3Cer (D18: 1, C22: 0 ), respektivt. I det øvre bånd av normalt vev (N, venstre panel) mye lavere intensiteter av tilsvarende molekylioner ble observert. Den sterke [M
4 + Na]
+ ioner av det nedre bånd i den tumor (T, midtre panel) representerer Gb3Cer (D18: 1, C16: 0), som er synlig bare i små mengder i normal vev (N, midtre panelet). Analyse av de laveste band av svulsten (T, panel til høyre) viste [M
5 * + Na]
+ ioner, som er veiledende for hydroksylerte Gb3Cer (D18: 1, H16: 0). Dette Gb3Cer /CD77 variant var umulig å oppdage i normalt vev (N, panel til høyre).
m /z
verdier av molekylære ioner og foreslåtte strukturer Gb3Cer /CD77-varianter av ondartede og tilstøtende normalt vev, samt referanser fra humane erytrocytter er oppført i Tilleggs tabell S3.
Statistisk analyse
Boksplott plott~~POS=HEADCOMP av de primære densitometriske data TLC overlay-analyse bestemt Gb3Cer /CD77 nivåer i bukspyttkjertelen (n = 21 pasienter) og tykktarm (n = 16 pasienter) vev er inkludert (figur 5A og henholdsvis B,). Overekspresjon av Gb3Cer /CD77 registrert i 81,3% av tykktarmskreft i forhold til tilstøtende friskt vev var signifikant (p = 0,021), mens økt uttrykk av Gb3Cer /CD77 i 61,9% av maligne pankreas vev var ikke signifikant (p = 0,189). I både bukspyttkjertelen og kreft i tykktarmen, gjorde tilstedeværelsen av Stx-oppdagede Gb3Cer /CD77 band ikke relateres til noen clinicopathological parametere (for patologiske data se Utfyllende Tabeller S1 og S2). Men for pankreastumorer, differanseverdiene av Gb3Cer /CD77 uttrykk korrelerer med graden av tumor differensiering (P = 0,039, τ = 0,396) indikerer høyere nivåer av Gb3Cer /CD77 på mindre differensierte maligniteter. Denne sammenhengen mellom dårlig differensiering av svulster hos pasienter med Gb3Cer /CD77 overekspresjon i ondartet bukspyttkjertelen vev er avbildet i boksplottene i figur 5C. I konklusjonen, er det uttrykk for Gb3Cer /CD77 større i mindre differensiert ondartet vev som tyder på Stx reseptoren som en potensiell markør for dårlig differensiering av bukspyttkjertelsvulster.
Boksene er avgrenset ovenfor og nedenfor ved 25% og 75 % persentiler. Linjene i boksene og de små firkantene angir median og gjennomsnittsverdiene og de to × minimum og maksimum verdier, henholdsvis. A, men ikke signifikant (p = 0,189, n = 21), en forbedret ekspresjon av Gb3Cer /CD77 kunne observeres i pankreatiske tumorer sammenliknet med normalt vev. B, er ekspresjonen av Gb3Cer /CD77 markert økning i tumor kolon vev sammenlignet med den i de tilstøtende normale vev som viser en sammenheng mellom Gb3Cer /CD77 ekspresjon og neoplastisk transformasjon (*, p = 0,021, n = 16). C, korrelasjon mellom Gb3Cer /CD77 ekspresjon og pankreatisk tumor differensiering (n = 20 pasienter, fordi en svulst ikke kan bli tildelt; se tabell 1). Svulster ble delt inn i to grupper etter histopathologic gradering: grade≤2 (n = 14 pasienter) og klasse 2 (n = 6 pasienter). Rank korrelasjonsanalyse av forskjell verdier poeng til en statistisk signifikant høyere Gb3Cer /CD77 uttrykk i bukspyttkjertelen svulster gradert som . 2 (*, P = 0,039, τ = 0,396)
Diskusjoner
Ved gruppering i lipid flåte membranmikroområder [11], [44], oligosakkaridkjedene av GSLs utviser sterke bindende aktiviteter mot sine ligander [45]. Derfor tumor-assosiert GSLs, dvs. GSLs viser forhøyet uttrykk i kreft sammenlignet med normalt vev, er perfekt for svulst diagnose og målrettet kreft terapier [31], [46], [47]. Derfor har antistoffer, lektiner eller giftstoffer med GSL bindende særegen skapt stor interesse i onkologi.
