Abstract
Vi viste tidligere at L-arginin (Arg) akkumuleres i tykk- og endetarmskreft vev. Hensikten med denne studien var å undersøke mekanismen som Arg akkumulerer og bestemme dens biologiske betydning. Konsentrasjonen av Arg og Citrullin- (Cit) i sera og tumorvev fra kolorektal kreft (CRC) pasienter ble analysert ved væskekromatografi (HPLC). Ekspresjon av Arg transportører ble analysert ved kvantitativ revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (QRT-PCR) og immunhistokjemisk analyse av vev microarray. Vi har også transfektert colon cancercellelinje HCT-116 med siRNA som er spesifikke for Arg transporter CAT-1 og måles induksjonen av apoptose ved strømningscytometri og celleproliferasjon ved MTT-assay. I samsvar med våre tidligere resultater, serum Arg og Cit konsentrasjoner i pasienter med kolorektal kreft var betydelig lavere enn i normale frivillige, mens Arg og Cit konsentrasjoner i kolorektal kreft vev var betydelig høyere enn i matchet tilstøtende normale kolon vev. Kvantitativ RT-PCR viste at
CAT-1
genet ble svært overuttrykt i 70,5% av kolorektal prøvene kreft vev i forhold til tilstøtende normale kolon vev i alle 122 pasienter med kolorektal kreft. Immunhistokjemisk analyse av vev microarray bekreftet at uttrykket av CAT-en var høyere i alle 25 kolorektal kreft vev testet. CAT-1 siRNA betydelig indusert apoptose av HCT-116 celler og senere hemmet cellevekst med 20-50%. Våre funn tyder på at akkumulering av L-Arg og Cit og cellevekst i kolorektal kreft vev er assosiert med overuttrykk av Arg transporter genet CAT-1. Våre resultater kan være nyttig for utviklingen av molekylære diagnostiske verktøy og målrettet behandling for kolorektal kreft
Citation. Lu Y, Wang W, Wang J Yang C, Mao H, Fu X, et al. (2013) Overuttrykte Arginine Transporter CAT-1 er assosiert med akkumulering av L-arginin og cellevekst i humane tykktarmskreft Tissue. PLoS ONE 8 (9): e73866. doi: 10,1371 /journal.pone.0073866
Redaktør: Joao P.B. Viola, National Cancer Institute (INCA), Brasil
mottatt: 20 januar 2013; Godkjent: 31 juli 2013; Publisert: 06.09.2013
Copyright: © 2013 Lu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (81172157) for å Bingguan Chen. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en av de viktigste årsakene til kreft-relaterte dødsfall i USA og Kina til tross for forbedringer i behandling i løpet av de siste årene [1], [2]. Behandlingstilbud for CRC inkluderer kirurgi, cellegift, strålebehandling og målrettet terapi, blant kirurgi er fortsatt den mest effektive. Men selv med omfattende behandling prognosen er fortsatt dårlig for pasienter med Dukes stadium D sykdom, med en samlet 5-års overlevelse på 6,6% -11,9%. Med en bedre forståelse av det molekylære patologi av kreft, nyutviklet målrettet terapi kombinert med 5-FU og oksaliplatinbasert kjemoterapi har vist forbedret resultatet med metastatisk CRC (mCRC) pasienter. Men bare ca 20% av mCRC tilfeller svare på dagens målrettede terapialternativer [3].
Foreløpig godkjent målrettede terapeutiske reagenser for bruk i mCRC inkluderer Bevacizumab (Avastin ™, Genentech /Roche, CA, USA), en monoklonalt antistoff rettet mot vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og cetuximab (Erbitux ™, Imclone Systems, NJ, USA) eller panitumumab (Vectibix ™, Amgen, CA, USA), monoklonale antistoffer rettet mot epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR). De tyrosinkinaseinhibitorer (TKI), slik som erlotinib og gefitinib, er en annen klasse av reagenser rettet mot EGFR. Bevacizumab er vanligvis brukes i kombinasjon med standard kjemoterapi (for eksempel 5-FU) som førstelinjebehandling for pasienter med mCRC og bedrer total overlevelse av disse pasientene med ca 5 måneder. Imidlertid har bivirkninger som høyt blodtrykk, anoreksi, proteinuri, og gastrointestinal perforasjon begrenset sin søknad i noen tilfeller. EGFR er direkte involvert i celledeling og metastatisk progresjon gjennom både RAS /RAF /MAPK og fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) signalveier. Effekten av anti-EGFR-terapi avhenger av hvorvidt tumoren har en KRAS mutasjon; anti-EGFR terapi er ikke effektivt for pasienter med en mutasjon i kodon 12 eller 13 av KRAS. Derfor er en stor innsats i gang for å studere biomarkører for CRC og utvikle nye behandlinger for å øke 5-års overlevelse og forbedre den generelle livskvaliteten for pasienter med denne sykdommen [1].
Flere studier har vist forhøyede nivåer av polyaminer og endrede nivåer av hastighetsbegrensende enzymer involvert i både biosyntese og katabolisme i tykktarmskreft og flere andre kreftformer. Det er dokumentert at tumorvekst absolutt krever polyamines for kreftcelle spredning [4], derfor polyamine veien er anerkjent som en rasjonell mål for chemoprevention og kjemoterapeutika [4], [5], [6]. Polyaminer fremstilles ved innvirkning av ornitindekarboksylase (ODC) på ornitin som er produsert av katabolismen av L-arginin (Arg) av arginases som blir overuttrykt i kreftceller [4], [7], [8]. I samsvar med dette biosyntesebanen har flere bevislinjer viste at Arg er nødvendig for kreftutvikling og progresjon [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Begge
in vitro
og
in vivo
studier har vist at Arg er nødvendig for kreftcellevekst, spesielt når endogen Arg syntese er blokkert på grunn av mangelfull argininosuksinatsyntetase (ASS) ekspresjon [10], [11], [12], [13]. For tumor vedlikehold kreftceller som overuttrykker enzymet endotelisk nitrogenoksid syntetase (eNOS), som forbruker store mengder Arg [15], [16]. På grunn av sterkt akselerert Arg metabolisme hos kreftceller, er Arg deprivasjon behandling blitt utviklet for å behandle kreft som er ASS negativ, slik som hepatisk karsinom, nyrecellekreft og prostatakreft [10], [11], [12], [13 ].
Når Arg er catabolized av NOS, co-produkt av NO vei, Cit, kan resirkuleres ved ASS og argininosuccinate lyase (ASL) for å syntetisere Arg endogent gjennom citrulline-NO eller arginin-citrulline pathway [17], [18], [19]. Selv om syntesen av Arg fra Cit skjer på et lavt nivå i mange celler, kan intracellulær syntese Arg markant øke visse fysiologiske eller patologiske forhold som påvirker homeostase av sirkulerende eller intracellulær Arg og Cit. Derfor er virkningen av Arg deprivasjon behandling av kreft, avhenger av hvorvidt det endogene syntesen veien er mangelfull. Tidlige studier viste at menneske lunge- og tykktarmskreft var nesten alltid positivt for ASS [20]. Videre er forstyrrelse av L-Arg biotilgjengelighet forbundet med mange sykdommer, innbefattet hjertesvikt, immunsvikt og cancer progresjon [9], [21], [22], [23].
I studiet av cancer immunology, tumor-infiltrerende lymfocytter, makrofager og dendrittiske celler som er blitt funnet å være funksjonelt mangelfull i kreftvev på grunn av lavt Arg tilgjengelighet i svulsten mikromiljøet [18], [21], [24]. Basert på disse eksperimentelle resultater noen grupper initiert Arg tilskudd behandling for kreftpasienter [25]. Men det er uenighet om hvilken rolle Arg tilskudd eller Arg deprivasjon i kreftbehandling, i stor grad fordi det er ingen direkte data på nøyaktig biotilgjengeligheten av Arg i svulsten mikromiljøet, spesielt i barnekonvensjonen. For å avklare dette spørsmålet, har vi utviklet en metode for å bestemme Arg nivået i blodet og CRC vev [26], [27]. I våre innledende studier ble det observert lave konsentrasjoner av Arg og dets metabolitt Cit i sera av CRC pasienter og høyere konsentrasjoner av Arg og Cit i kreftvevet. Her har vi fastslått ytterligere tilgjengeligheten av Arg i svulsten mikromiljøet og undersøkt mekanismen bak den økte intracellulære Arg nivå ved å analysere uttrykk for Arg transportører og endogene Arg syntese enzymer ASS og ASL i CRC vev. Våre resultater indikerer at Arg metabolismen er akselerert i CRC og identifisere Arg transporter SLC7A1 som en potensiell molekylære mål for CRC terapi.
Metoder
Prøver og HPLC
Serum, tumor vev, og tilstøtende normal tykktarm vev ble samtidig oppnådd fra kirurgiske prøver av CRC-pasienter. Totalt 122 sammenkoblede tumorvev og tilstøtende prøver normal kolon vev ble samlet inn fra 122 CRC pasienter (79 menn og 43 kvinner) med en gjennomsnittsalder på 60 ± 11 år (som strekker seg fra 37 til 79 år) fra Kirurgisk avdeling ved Shanghai Changzheng Hospital. Pasientene inkludert 27 med sigmoid fleksing kreft, fem med tykktarms synkende kreft, 46 med endetarmskreft, 16 med tykktarms stigende kreft, og 28 med tykktarmstverrgående tykktarm kreft. Alle pasientene ble diagnostisert som patologisk adenocarcinoma (tabell 1). Studien ble godkjent av Institutional Review Board of Tongji University School of Medicine, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle personer. Vevsprøver for å bestemme ekspresjon av Arg transportører ble lagret ved -80 ° C inntil analyse. Blant 122 parede prøver vi oppsamlet 30 sammenkoblet vevsprøver og serumprøver separat for HPLC for ytterligere å bestemme konsentrasjonen av Arg og Cit. Vi klarte ikke å teste alle personer på grunn av begrenset prøve tilgjengelighet. Sera fra 28 friske frivillige som fikk årlig helsesjekk og hadde ingen tegn på sykdom ble oppsamlet som en kontroll. De demografiske karakteristikker av 28 friske frivillige og 30 pasienter med kolorektal kreft er vist i tabell 2.
nivåene av L-Arg og L-Cit i serum og vev ble bestemt ved RP-HPLC ved hjelp av ultrafiolett deteksjon som vi rapporterte nylig [24], [25]. Den tumor og normalt vev ble nøyaktig veid, og 0,1 g vev ble homogenisert i 0,5 ml trikloreddiksyre (0,1 g /ml) i et isbad. Homogenatene ble overført til Eppendorf-sentrifugerør og analysert på lignende måte som serumprøver. Den analytiske-innholdet ble beregnet ved bruk av standardkurven eller regressiv ligning. Nivåene av L-Arg og L-Cit i sera ble uttrykt som pmol /L og nivåene av L-Arg og L-Cit i vev ble uttrykt som ug /g.
Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (QRT-PCR
)
RNA ble isolert fra kolorektal vev ved hjelp TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, California). CDNA ble umiddelbart revers transkribert fra RNA isolert med Superscript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA). Kvantitativ RT-PCR ble utført ved hjelp av SYBR Grønn PCR kit (Qiagen, Valencia, CA). Primerne benyttet for hver arginin transport-genet er angitt i tabell S1. GAPDH ble anvendt som en intern kontroll for sammenligning av dataene. Kvantitativ PCR ble utført ved hjelp av Applied Biosystems 7900HT (ABI, Foster City, CA), og sammenlignings Ct metoden ble brukt for å vurdere relative endringer i mRNA nivåer mellom to prøver.
Tissue microarray
parafin-innleiret vev microarray (CO951, US Biomaks, Rockville, MD) ble anvendt for immunhistokjemi analyse som tidligere beskrevet [28]. Tissue matrise ble behandlet med varme-induserte antigen hentes ved hjelp av 10 mM natriumcitratbuffer, pH 6,0. Matrisen ble deretter farget med CAT-1 antistoff (Abcam, Cambridge, MA) og visualisert ved hjelp av en DAB farging kit.
Cell Culture
Den menneskelige tykktarmskreft cellelinje HCT 116 ble kjøpt fra The Cell Bank of Chinese Academy of Sciences og dyrket i en fuktet, 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C. Dyrkningsmediet som ble anvendt var McCoys 5A medium (Sigma, St. Louis, MO, USA) inneholdende 10% volum /volum varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS).
Transfeksjon av Lie interfererende RNA (siRNA)
ikke-målretting siRNA (Sint) og siCAT-en (Santa Cruz, Dallas, TX) ble brukt i en konsentrasjon på 10 nM og transfektert inn i HCT 116 celler ved hjelp av Lipo 2000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, California) etter produsentens bruksanvisning. Etter 24 timer ble cellene sådd ut på kamret lysbilder eller 24-brønners plater og fikk vokse til en annen 24-48 timer forut for RNA isolering eller starten på eksperimentene. Knockdown av genuttrykk ble bekreftet av q-PCR.
flowcytometrisystemer og Cell Proliferation analyse
Antall apoptotiske celler ble bestemt ved hjelp av Anti-annexin V mAb (BD, Franklin Lakes, NJ) og analysert ved flowcytometri, som beskrevet i litteraturen [29]. Celleproliferasjon ble bestemt ved MTT assay kit (R D Systems, Minneapolis, MN). Som beskrevet av produsenten
Statistical Analysis
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS 14.0 programvare. Konsentrasjonene av Arg og Cit er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (gjennomsnitt ± SD). Forskjeller i gjennomsnittsverdiene mellom grupper ble vurdert ved hjelp av t-test. En
P
-verdi mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
serumnivåer av Arg og Cit var lavere i pasienter med kolorektal kreft enn i normale individer
For å utvide våre tidligere funn vi målt serum Arg og Cit i ytterligere 30 CRC pasienter og bekreftet at serum Arg og Cit konsentrasjonene var signifikant lavere hos pasienter med CRC enn i normale individer (Tabell 3). Serum Cit-konsentrasjonen var 39,22 ± 13,33 umol /L i CRC-pasienter, sammenlignet med 86,27 ± 23,54 umol /L i normale kontroller, og den tilsvarende serumnivå av Arg ble 84,83 ± 26,18 umol /L og 117,72 ± 40,19 umol /L, henholdsvis . Disse resultatene er sammenfallende med de av våre forstudie.
Opphopning av Arg og Cit i kreftvev av CRC Pasienter
For å utdype våre tidligere funn av økt tilgjengelighet av Arg og Cit i CRC vev undersøkte vi årsaken til den reduserte konsentrasjon av Arg og Cit i sera hos pasienter CRC. Basert på kravet om Arg i kreftcelle spredning vi forventet et høyere forbruk av Arg i CRC vev. Derfor har vi målt og Arg Cit nivåer i CRC vev og fant en dramatisk opphopning av Arg og Cit (figur 1). Begge Arg og Cit konsentrasjonene var to ganger høyere i svulstvev enn i normal kolon vev fra samme pasient. Disse resultatene var reproduserbare i 30 pasienter med CRC. Den Arg nivå i kolorektal kreft vev var 45,26 ± 17,59 pg /g sammenlignet med 27,34 ± 11,59 pg /g i normal tykktarm vev (
P
0,005), mens det Cit nivå i CRC vev var 11,01 ± 4,16 ug /g sammenlignet med 5,60 ± 2,61 pg /g i normal tykktarm vev (
P
0.01, tabell 4 og figur 2). Disse resultater indikerer at biotilgjengeligheten av Arg og Cit er forhøyet i colon cancer vev, noe som kan bidra til de lavere nivåer av både Arg Cit og i sera hos pasienter CRC, som tidligere rapportert [26].
øvre panel (a) viser resultatet fra paret tilstøtende normalt sigmoid bøyning vev i en pasient med sigmoid kolon kreft. Det nedre panel (b) viser resultatet fra sigmoid bøyning kreftvev i den samme pasient. Den enkelte markerte topper (1) og (2) representerer henholdsvis L-citrulline og L-arginin.
Konsentrasjoner av både Arg og Cit var signifikant høyere i kolorektal kreft vev sammenlignet med sammenkoblede tilstøtende normale kolon vev (
P
0,05 og
P
0,01 henholdsvis). De detaljerte konsentrasjoner og statistiske analyser er vist i tabell 4.
Overuttrykte av CAT-1 i CRC vev ved QRT-PCR analyse
Oppbyggingen av Arg og Cit i CRC vev stimulert en gransking av identiteten til den aktuelle transportøren og muligheten for at det kan regulere kreft progresjon. De kationiske aminosyrer transportører (CATS), en underfamilie av det oppløste bære familien 7 (SLC7A), er de viktigste transportører som er ansvarlige for Arg tilstrømningen. Det er fire bekreftede transportproteiner for kationiske aminosyrer, CAT-1 (SLC7A1), CAT-2A (SLC7A2A), CAT-2B (SLC7A2B), og CAT-3 (SLC7A3). Funksjonen av menneskelig SLC7A3 og SLC7A4 er ukjent, mens hatter 4F2hc /y + LAT1 og 4F2hc /y + LAT2 (SLC3A2 /SLC7A7 og SLC7A6) aksepterer L-type kationiske og nøytrale aminosyrer. Vi målte ekspresjon av gener som koder for disse arginin transportører i CRC og sammenkoblet tilstøtende normale cancervev fra 122 pasienter med CRC ved hjelp av QRT-PCR.
Som vist i figur 3, når mer enn tre ganger over-ekspresjon var angitt som cut-off verdi,
CAT-1
genekspresjon ble forhøyet i CRC vev i 86 av 122 pasienter (70,5%), i hvem uttrykket nivået av CAT-1 i CRC vev var 3.6- til 181 ganger høyere enn hos normale kolon vev, mens uttrykk for SLC7A2A og SLC7A2B ble forhøyet i bare 6/122 og 12/122 (4,9 og 9,8%) pasienter hhv. Vi observerte også at SLC7A4 uttrykk ble forhøyet i 8/122 (6,6%) pasienter. Ekspresjon av SLC3A2, SLC7A6, og SLC7A7 ble forhøyet i 8, 14 og 12 av de 122 pasienter (henholdsvis 6,6%, 11,5% og 9,8%) (figur 3). Våre resultater indikerer at overekspresjon av CAT-1 kan være en viktig bidragsyter til Arg opphopning i CRC vev.
uttrykk for CAT mRNA i kolorektal kreft vev ble målt ved QRT-PCR, og overekspresjon ble definert som minst 3 ganger høyere enn ekspresjon som i normal tykktarm vev. Figuren viser andelen av prøver med overekspresjon ( 3 ganger) av enkelt arginin transporter gener among122 CRC vevsprøver.
CAT-1
genet ble overuttrykt i 86 av 122 (70,5%) CRC vev.
Økt CAT-1 Protein Expression i CRC Vev
For å bekrefte overekspresjon av CAT-1 i CRC vev vi videre bestemt CAT-1 protein nivå ved immunhistokjemi farging av 25 tykktarmskreft prøver i en vev microarray (figur 4). Uttrykket av CAT-1 protein var svak i normal tilstøtende tykktarmen, men forhøyet i tykktarm adenokarsinomer. CAT-1 uttrykk nivå korrelert med differensiering graderinger av svulster; Vi fant moderat økte nivåer av CAT-1 i godt differensiert colon adenocarcinoma (n = 8), og omfattende oppregulert CAT-1 i dårlig differensiert prøver (n = 17). Resultatene bekreftet en økning i CAT-1 protein nivå i CRC vev, i samsvar med QRT-PCR funn.
CRC vevet microarray (TMA) ble farget med CAT-1 antistoff og visualisert ved hjelp av en DAB farging kit . Tettheten av CAT-1 uttrykk i normal tykktarm, godt differensiert CRC, og dårlig differensierte CRC prøver fra TMA ble sammenlignet. Bildene ble tatt på 40 x forstørrelse.
CAT-1 RNAi hemmet veksten av CRC Cells
Basert på resultatene av Arg akkumulering og høyere CAT-1 uttrykk i CRC vev vi videre antatt at CAT-1 uttrykk kan relatere til kreftcelle spredning og påfølgende kreft progresjon. Vi utførte derfor en
in vitro
analyse for å studere effekten av CAT-en undertrykkelse av RNAi i tykktarm kreft celler. Som vist i figurene 5A og B, CAT-1 siRNA hell slås ned (80% reduksjon bestemt ved QRT-PCR) ekspresjon av CAT-1 i HCT 116 tykktarmskreftceller, i overensstemmelse med resultatene i brystkreftceller [30]. Transfeksjon med CAT-1 siRNA redusert svulst celle levedyktighet, fremmet apoptose (figur 5C-E), og derfor hemmet cellevekst
in vitro
med 20-50% (Fig. 5F). Våre resultater tyder på at det Arg metabolismen reaksjonsveien kan være et potensielt mål for molekyl CRC terapi.
koloncancer cellelinje HCT-116 ble dyrket
in vitro
i 6-brønners plater og ble transfektert med individuelle sirnas, etterfulgt av analysering av CAT-1-ekspresjon ved QRT-PCR (A, B), apoptose 72 timer etter transfeksjon siRNA ved strømningscytometri (C-E), og cellevekst ved MTT-assay (F). CAT-1 siRNA hell slått ned ca 80% av CAT-1 uttrykk (B). Sammenlignet med ingen behandling (C) og å kontrollere siRNA (D), CAT-1 siRNA indusert apoptose med opp til 16,37% (E). CAT-1 siRNA (trekant) betydelig redusert cellelevedyktighet HCT116 tykktarmskreftceller, sammenlignet med ingen behandling og kontroll siRNA transfeksjon (F). Resultatene var reproduserbare for tre uavhengige eksperimenter. ** Indikerer
P
. 0,01
Diskusjoner
I en videreføring av vår tidligere studie [26], [27], vi videre undersøkt serum nivåer av Arg og Cit i CRC pasienter og deres biotilgjengelighet i CRC vev. Vi har konsekvent vist en redusert serumnivå av Arg og Cit i CRC-pasienter og akkumulering av både Arg Cit og i CRC vev. Våre resultater tyder på at lavere biotilgjengelighet av tumor infiltrerende lymfocytter og kreftrelaterte immunceller ikke kan være relatert til Arg konsentrasjon i mikromiljøet kreft, men snarere kan være relatert til tumor cellenes metabolske egenskaper og deres evne til å ta opp Arg. Samtidig høye intracellulære nivåer av Arg og Cit kan skyldes akselerasjon av intracellulære synteseveier fordi Arg og Cit kan være gjensidig metaboliseres av intracellulær ASS /ASL og NOS. Nyere studier har vist at tumor endotel-celler uttrykker høye nivåer av NOS, som fremmer lymfatisk metastase og angiogenese [15], [16], [31]. Således kunne den forhøyede Cit-konsentrasjonen i kreftvev pasienter i studien skyldes akselerert Arg metabolisme av NOS, selv om transportøren i kreftvevet og dets spesifikke aktivitet for Cit uklare.
intracellulær syntese Arg fra Cit i Arg-Cit veien krever to enzymer, ASS og ASL. Flere grupper har rapportert om en mangel på endogen Arg syntese i melanom, hepatisk karsinom, nyrecellekreft og prostatakreft som følge av mangelfull ASS [10], [11], [12], [13], [20]. Noen andre humane kreftformer, inkludert sarkomer, invasiv brystkreft, og nyrecellekarsinom, har vist seg å være ASS-mangelfull i noen studier, men menneskelige lunge og tykktarm carcinoma var nesten alltid positive for ASS [20]. Vi har konsekvent vist øket ekspresjon av ASS og ASL i CRC vev sammenlignet med normal tykktarm vev ved immunhistokjemi, noe som tyder på at den endogene syntesen av Arg i CRC-celler kan være intakt, og til og med bedre, i stedet for mangelfull (figur S1 og S2). Den forbedrede Ekspresjonsnivået av ASS og ASL i CRC kan være delvis ansvarlig for den høye Arg nivåene observert i kreftvev.
Det er kjent at den intracellulære konsentrasjonen av Arg er i stor grad påvirket av aktiviteten av Arg transportører i hvilken de kationiske aminosyre transport (katter) er de viktigste transportører for Arg tilstrømningen [32], [33], [34]. Oppbyggingen av Arg i CRC celler kan være forårsaket av økt tilstrømning fra ekstracellulære interstitiell bassenger gjennom Arg transporter. I en tidlig
in vitro
studien, øket L-Arg transport gjennom Na (+) – uavhengig y + system ble observert i CRC-celler, mens i nærvær av epidermal vekstfaktor (EGF) og transformerende vekstfaktor alfa (TGFa) stimulering L-arginin-opptaket kan skje via Na (+) – avhengige transport [14]. Derfor screenet vi uttrykket for alle kationisk aminosyre transporterer i CRC vev ved hjelp av QRT-PCR og avslørte at CAT-1 ble uttrykt ved et høyere nivå i CRC vev enn i normalt vev kolon. En annen studie viste at endringer i CAT-1 mRNA nivåer kanskje ikke nødvendigvis påvirke CAT-1 protein nivåer [
