Abstract
Mål
Oral plateepitelkarsinom (OSCC) er en utbredt kreft, spesielt i utviklingsland. Antracykliner og deres antrakinonderivater, såsom doksorubicin, utviser en cellevekst-inhiberende virkning og er blitt anvendt som anti-cancer medikamenter for mange år. Imidlertid er den kardiotoksisitet av antracyklin antibiotika et stort problem i deres kliniske anvendelse. NSC745885 er en ny forbindelse syntetisert fra 1,2-diaminoantrakinon, som deretter reagerer med tionylklorid og trietylamin. Denne studien forsøkte å undersøke anti-kreft i munnhulen potensial og sikkerhet NSC745885.
Metoder
Vi undersøkte anti-kreft potensialet NSC745885 i muntlige squamous carcinoma cellelinjer og i en
in vivo
oral cancer xenograft mus modell. Uttrykket av apoptotiske beslektede gener ble evaluert av real-time RT-PCR og vestlige bloting, og
in vivo
vurdering av apoptotisk markør ble målt ved immunhistokjemisk farging. Den anti-tumor effektivitet og sikkerhet mellom doksorubicin og NSC745885 ble også sammenlignet.
Resultatene
Våre resultater viste at NSC745885 viser anti-oral cancer aktivitet ved induksjon av apoptose i kreftceller og i tumor bærende mus, og denne behandlingen induserte ikke markert toksisitet hos eksperimentelle mus. Denne forbindelsen viser også en tilsvarende anti-tumor effektivitet og høyere sikkerhet i eksperimentell mus sammenlignet med doksorubicin.
Konklusjoner
Dataene fra denne undersøkelsen gir bevis for NSC745885 som en potensiell ny terapeutisk legemiddel for behandling av humant OSCC
Citation. Chen YW, Huang HS, Shieh YS, Ma KH, Huang SH, Hueng DY, et al. (2014) en ny forbindelse NSC745885 Utøver en anti-tumor effekt på tungen kreft SAS celler in vitro og in vivo. PLoS ONE 9 (8): e104703. doi: 10,1371 /journal.pone.0104703
Redaktør: Arianna L. Kim, Columbia University Medical Center, USA
mottatt: 20 januar 2014; Godkjent: 16 juli 2014; Publisert: 15 august 2014
Copyright: © 2014 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av forskningsmidler fra National Science Council, Taiwan, ROC (NSC101-2320-B-016-016 til G.-J. Lin og NSC102-2314-B-016-018-My3 til Y.-W. Chen), Tri-service General Hospital, Republikken Kina (Grant Nei . TSGH-C102-019, TSGH-C100-034 og TSGH- C101-009-S06) og delvis av CY Foundation for Advancement of Education, Science and Medicine. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blant muntlig plateepitelkarsinom (OSCCs), den største majoriteten av malignitet er hode og nakke plateepitelkarsinom (HNSCCs). OSCC er den sjette vanligste kreftsykdommen i verden [1], og den tredje vanligste kreftformen i utviklingsland [2] – [4]. Tradisjonell terapi for OSCC omfatter kirurgi, strålebehandling og kjemoterapi. Men det remedial effekten av slike behandlinger på sluttstadiet munnhulekreft er jevnt dårlig. I tillegg, selv etter vellykket tumor reseksjon, kan omtrent 20% av pasientene har tilbakefall av tumorer ved andre området [5]. Derfor, utvikle nye terapeutiske strategier for ondartede muntlig svulster er et presserende problem.
antracykliner og deres antrakinonderivater utstillingen celleveksthemmende effekter og har blitt brukt som anti-kreft narkotika for mer enn 30 år [6]. Daunorubicin og doxorubicin, to antracyklin antibotics, blir ofte anvendt for behandling av akutt myeloid leukemi, så vel som diverse faste tumorer [7]. Tidligere studier har rapportert at disse stoffene indusere apoptose i tumorceller [8], [9]. Den cytostatiske og cytotoksiske virkninger av disse stoffene har blitt observert gjennom inhibering av topoisomerase II og senere, initiering av DNA-skade [10]. Oksidativ skade har vært betraktet som en viktig mekanisme i anti-tumor aktivitet av antracyklin [11]. Antracyklin antibiotika også vise evne til å redusere telomeraseaktivitet og hTERT uttrykk. Doxorubicin behandling induserer senescens i brysttumorcellelinje MCF-7 celle ved økt aktivitet av p53, og reduserer aktiviteten av telomerase-aktivitet i denne kreftcellen [12]. En tidligere studie rapporterte at telomeraseaktivitet og hTERT mRNA-ekspresjon ble hemmet av doksorubicin behandling i moder gastrisk carcinom cellelinjer, men ikke i doxorubicin-resistente cellelinjer [13]. Resultatene av disse studier har antydet en effekt av antracykliner i hemming av telomerase-aktivitet, og denne virkning bidrar til anti-tumoraktiviteten av disse stoffene.
Selv om antracyklin-antibiotika har vært anvendt som anti-cancer medikamenter for mange år, hever deres kardiotoksisitet et klinisk behandling bekymring [14]. Funksjonene i antracyklinindusert kardiomyopati i biopsier av behandlede pasienter inkluderer myofibrils tap, sarcoplasmic retikulum utvidelse, cytoplasma vacuolization, et økt antall lysosomer, og hevelse i mitokondriene i cardiomyocytes [15]. Tidligere studier har vist at utviklingen av kardiomyopati i doksorubicin behandling er forbundet med den administrerte dosen [16]. Denne bivirkningen skjer vanligvis i løpet av 1 år; Det kan imidlertid også forekomme flere år senere under legemiddeladministrering. Videre kan antracykliner også føre til sjeldne (mindre enn 1%) akutt hjertetoksisitet (vanligvis forekommende i løpet av en uke) [17]. Derfor er utviklingen av et nytt medikament utøve en effektiv antitumoreffekt, men oppviser en liten bivirkning, slik som kardiotoksisitet, er fortsatt søkes kreftterapi.
NSC745885 er en ny forbindelse som er utviklet i 2009. Denne forbindelsen ble syntetisert fra 1,2-diaminoantrakinon, som deretter reagerer med tionylklorid og trietylamin [18]. En tidligere studie fant at NSC745885 viser en anti-kreft effekt når 60 cellelinje primære skjermen av National Cancer Institute (NCI) ble brukt. Resultatene indikerte at leukemi, melanom, og eggstokk-kreft-linjer var svært følsom for NSC745885. Ikke småcellet lungekreft, tykktarmskreft, neuroblastom, prostatakreft og brystkreft cellelinjer er også følsomme for denne forbindelsen. Videre er denne tidligere studie rapporterte også at NSC745885 er effektiv i å undertrykke cellevekst i forskjellige kreftcellelinjer, som er delvis oppnådd ved hemmende evne i telomerase-aktivitet på disse cellene [18]. Men
in vitro
anti-kreft potensial og
in vivo
aktivitet av denne nye forbindelsen i muntlig kreft har ikke blitt utforsket.
I denne studien har vi undersøkt anti-kreft potensialet av NSC745885 i orale squamous carcinom cellelinjer og i en
in vivo
oral cancer xenograft musemodell. Videre evaluerte vi også giftigheten av NSC745885 i andre organer hos behandlede mus. Våre resultater viser at denne nye forbindelsen indusert apoptose av muntlige kreftceller enten i
in vitro
cellekultur eller i
in vivo
xenograft tumor musemodell. I tillegg fant vi også at
in vivo
behandling av NSC745885 fremkalte ingen cytotoksisitet i milt, lunger, lever eller hjerte av forsøksdyr. Funnet av vår studie antydet at NSC745885 kan brukes som et effektivt medikament for oral behandling av kreft, og denne behandling kan oppvise en høyere grad av sikkerhet enn tradisjonelle antracyklin antibiotika gjør.
Materialer og metoder
Cells og kjemikalier
SAS ble hentet fra en dårlig differensiert menneskelig plateepitelkarsinom [19]. Denne cellelinjen ble gitt av Dr. Jeng-Fan Lo ved Institutt for oral biologi, Institutt for klinisk odontologi, National Yang Ming University, Taiwan [20]. OECM-en er hentet fra gingival epidermoid carcinoma av en taiwansk pasient. SCC4 og SCC25 ble hentet fra tunge plateepitel kreftceller. Alle cellelinjer ble holdt i et RPMI 1640-medium supplert med 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 25 mM HEPES og 1% penicillin /streptomycin. MRC-5-celler er en normal human fetal lunge fibroblast cellelinje (ATCC No: CCL-171) holdes i en Minimum Essential Medium (MEM) supplert med 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 25 mM HEPES, og 1% penicillin /streptomycin. NSC745885 [18] ble gitt av Dr. Hsu-Shan Huang ved Institutt for farmasi, National Defense Medical Center, Taiwan.
Vekst hemningsmetoden
Celler i logaritmisk vekstfase ble dyrket på en tetthet på 5000 celler /brønn i 96-brønners plater. Cellene ble eksponert for forskjellige konsentrasjoner av NSC745885 for 24, 48 eller 72 timer. A 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse (Sigma, St. Louis, MO, USA) ble anvendt for å evaluere effekten av NSC745885 på cellevekst, slik som beskrevet tidligere. IC
50 verdi resulterte i 50% inhibering av cellevekst, som ble grafisk beregnes som en sammenligning med kontrollvekst.
Annexin V-farging
Cellene ble vasket med PBS og resuspendert i 1 X bindingsbuffer (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA). Resuspenderte celler ble farget med FITC-konjugert Annexin V (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) og andelen av Annexin V-positive celler ble analysert ved flowcytometri.
Kvantitativ Real-Time PCR
Total RNA ble isolert ved anvendelse av Trizol-metoden (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) og homogenisering av kreftcellene i Trizol lysebuffer, etterfulgt av kloroformekstraksjon (Life Technologies). For cDNA-syntese, ble 5 ug av total-RNA reverstranskribert ved 50 ° C i 60 minutter ved hjelp av 200 enheter av Superscript III revers transkriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Primerpar for caspase-3 (følelse 5′-CTG GAC TGT GGC ATT GAG AC-3 «; anti 5′-ACA AAG CGA CTG GAT GAA CC-3′), XIAP (følelse 5»-GAC AGT ATG CAA GAT GAG TCA AGT CA-3 «, antisense 5′-GCA AAG CTT CTC CTC TTG CAG-3′), og GAPDH (forstand 5»-GGA AGG TGA AGG TCG GAG TCA-3 «, antisense 5»-GTC ATT GAT GGC AAC AAT ATC CAC T-3 «) ble anvendt for genamplifikasjon. Den SYBR Grønn /ROX qPCR Master Mix kit (Fermentas, Glen Burnie, Maryland, USA) ble brukt for alle reaksjoner med en real-time polymerase chain reaction (PCR). I korthet ble PCR utført som følger: en syklus ved 50 ° C i 2 minutter, en syklus på 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser på 15 sekunder hver ved 95 ° C, og ett minutt ved 60 ° C. Data ble samlet inn i tre eksemplarer og normalisert med GAPDH uttrykket.
Protein Extraction og Western blot analyse
Protein ble hentet fra en dyrket celle (SAS) lysert i en cellelyse som inneholder proteasehemmere (50 mmol /l Tris (pH 7,5), 30 mmol /l MgSO
4, 8 mmol /l EDTA, 2 mmol /l DTT og 2% Triton X-100). Cellelysatene ble klaret ved sentrifugering ved 13 000 rpm ved 4 ° C i 15 minutter. Protein konsentrasjoner av cellelysatene ble målt ved hjelp av en BCA assay (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Western blot-analyse ble utført ved anvendelse av 50 ug proteinekstrakter fra kontroll kreftceller, og cellene behandles med NSC745885 ble lastet og separert ved anvendelse av 8% natriumdodecylsulfat polyakrylamid gelelektroforese. Etter elektroforese ble proteinene elektrooverført til en polyvinyldifluoride (PVDF) membran (Millipore, Billerica, MA, USA), som deretter ble blokkert med en blokkerende oppløsning inneholdende 5% ikke-fett tørrmelk i PBS pluss 0,2% Tween 20 (PBST) i 1 time ved romtemperatur. Etter blokkerings var fullført, ble membranen vasket 3 ganger med PBST. PVDF membran ble utslettet med følgende primære antistoffer i PBS: anti-XIAP; caspase-3 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA); og anti-aktin (Sigma, St. Louis, MO, USA). Etter 2 timer ved romtemperatur, ble membranen igjen vasket i PBST. PVDF-membranen ble deretter inkubert med peroksidase-bundet anti-mus eller anti-kanin-IgG-antistoff i 1 time, utviklet ved hjelp av en forbedret kjemiluminescens deteksjon kit (Millipore, Billerica, MA, USA), og analysert med en las-3000 avbildningssystem ( Fujifilm, Tokyo, Japan).
Xenotransplantat Tumor Mouse Model
Åtte uker gamle NOD /SCID (NOD.CB17
Prkdc
SCID /J, National Laboratory Animal Center, Taiwan) mus ble opprettholdt i mikroisolatorer under konkrete patogen-frie forhold og matet steril mat og klor sterilt vann. Atten mus ble delt i 2 grupper, og hver gruppe av mus ble subkutant injisert med 3 x 10
6 SAS. Ni mus i hver gruppe ble ytterligere behandlet med NSC745885 eller doksorubicin (2,0 mg /kg kroppsvekt /d /i.p..), Og 9 mus i hver gruppe ble injisert daglig med et kjøretøy kontroll. NSC745885 ble først injisert i hver gruppe av mus på dag tre, før noen svulst ble palpated og kontinuerlig administrert til dag 10 i SAS-bærende mus. Størrelsen av de transplanterte tumorer ble målt hver tredje dag ved hjelp av gauged calipers, og tumorvolumet ble beregnet ved anvendelse av følgende formel: volum (V) = 1/2 x (lengde x bredde
2). Ved slutten av behandlingen, ble musene avlivet, og svulstene ble fjernet, veid, og fotografert.
Etikk uttalelse
Alle dyreforsøk ble gjennomført i samsvar med institusjonens retningslinjer og ble godkjent av NDMC institusjonelle Animal Care og bruk komité. Alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelsene til forsøksdyr. (Godkjenningsnummer: IACUC-11-044)
immunhistokjemisk farging
Immunhistokjemisk farging ble gjennomført ved bruk av avidin-biotin-metoden beskrives som følger. Vevssnitt ble avvokset i xylen og rehydrert i alkohol. Antigen gjenfinning ble utført ved inkubasjon i 0,01 mol /l citratbuffer (pH 6,0) ved 95 ° C i 40 minutter i et vannbad. Den endogene peroksidase ble blokkert med 0,3% hydrogenperoksid i 30 minutter. Snittene ble deretter inkubert med 5% normalt hesteserum i PBS i 30 minutter ved romtemperatur for å blokkere en ikke-spesifikk reaksjon. Etter vasking med TBS og 0,1% Tween 20, ble objektglassene inkubert over natten ved 4 ° C med anti-human caspase-3, og et XIAP antistoff (DAKO, Osaka, Japan). Etter å ha blitt skyllet i TBS og 0,1% Tween 20, ble vevssnittene ble inkubert i 40 minutter ved romtemperatur med biotinylert anti-muse-IgG etterfulgt av et avidin-biotin-peroksidasekompleks (Vecstatin Elite ABC kit, Vector Laboratories, Inc., Burlingame , CA) i 40 minutter. Deretter ble vevssnittene farget med 0,003% 3,3-diaminobenzide tetrahydroklorid og 0,005% hydrogenperoksyd i 0,05 mol /l Tris-HCl (pH 7,2), motfarget med Mayer s hematoksylin, dehydrert, og montert.
Evaluering av immunhistokjemisk farging
en immunhistokjemisk fremgangsmåte uten tilsetning av det primære antistoff ble anvendt som en negativ kontroll i hvert enkelt tilfelle. Intensiteten av kaspase-3 og XIAP immunoreaktivitet av tumorcellene ble bedømt i 3 grupper, og standardisert i henhold til fargingsnivå som en positiv intern kontroll på en skala fra 0 (ingen farging), 1 (svak farging), 2 (moderat farging), og 3 (sterkeste intensitet). Fordelingen av kaspase-3 og XIAP Merkingen ble også målt som i henhold til prosentandelen av positivt fargede tumorceller (fra 0 til 100) i det totale tumorvolumet i hver seksjon. For å evaluere fordelingen områder av caspase-3 og XIAP uttrykk enklere og mer effektivt, ble 50% ansett cutoff punktet. For å sammenligne kontrollen og NSC745885-behandlede gruppe, andelen av kaspase-3 og XIAP-positive celler i hver intensitet ble multiplisert med den tilsvarende intensitet (fra 0 til 3) for å oppnå en immunfarging stillingen i området fra 0 til 300.
Statistical Analysis
Statistiske Package for Social Sciences (SPSS versjon 10.0 for Microsoft Windows, Chicago, IL, USA) ble brukt til å fullføre analysen av de innsamlede data. En
t
-test og enveis variansanalyse (ANOVA) med Scheffe post-hoc test ble benyttet for å bestemme hvorvidt noen signifikante sammenhenger eksisterte blant de kvantitative resultatene. Verdier av
P
0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
veksthemmende virkning av NSC745885 på munnhulekreft cellelinjer
For å undersøke påvirkning av NSC745885 behandling på muntlig plateepitelkarsinom, vi behandlet SAS oral kreftceller med forskjellige konsentrasjoner av NSC745885 i 24 timer og observerte deres morfologiske endringer ved hjelp av et fasekontrastmikroskop. Behandlingen av NSC745885 ved konsentrasjoner på 3 uM til 5 uM signifikant redusert tettheten av dyrkede celler sammenlignet med ubehandlede celler (fig. 1A). For å evaluere den veksthemmende virkning av NSC745885, ble SAS-celler utført med forskjellige doser av NSC745885, og antall overlevende celler ble målt ved ulike tidspunkt og sammenlignet med de ubehandlede celler med MTT-analyse. Tallene for overlevende SAS celler ble betydelig redusert som følge av NSC745885 behandling i tids- og doseavhengig oppførsel (Fig. 1B-1D). IC
50 av NSC745885 var 0,85 mikrometer på SAS-celler etter 72 timers behandling (Fig. 1D). Resultatene indikerte at NSC745885 viste en vekst hemmende eller død fremmende effekt på SAS-celler. For å oppdage apoptotiske SAS celler, utførte vi annexin V flekker å evaluere proporsjonene annexin V positiv under ulike doser av NSC745885 behandling på 24 timer. Prosentandelene av annexin V-positive celler ble øket på en doseavhengig måte (fig. 2A-2E). Det er betydelige forskjeller når behandling dosering var høyere enn 0,5 mikrometer (Fig. 2F). Dette resultatet indikerer at NSC745885 behandling indusert tidlig apoptose i SAS celle.
(A) Morfologiske endringer i SAS-celler. Celler ble behandlet med den angitte dosering av NSC745885 i 24 timer. Doser høyere enn 3 μΜ forårsaket celledød i SAS celler. Overlevelsen av NSC745885 behandlede SAS-celler ble bestemt ved MTT-analyse på ulike tider og doseringer. (B) Ved 24 timer etter behandling, overlevelsen av SAS-celler viste en signifikant forskjell ved doser høyere enn 1 um. (C) Etter 48 timer, behandlings ved 1 uM eller høyere enn den dosering av NSC745885 oppviste en signifikant anti-cancer effekt. (D) Etter 72 timer med behandling, IC50 av NSC745885 var 0,85 mikrometer i SAS celler. Survival andel (%) indikerte den relative verdien sammenlignet med kjøretøy kontrollgrupper i SAS (n = 3; *, P 0,05, **, P 0,01; ***, P 0,001;. Ns, ikke-signifikant).
SAS celler ble behandlet med (A til E) indikerte doser NSC745885 i 24 timer. Høstede celler ble farget med FITC-konjugert annexin V og analysert ved strømningscytometri. (F) Prosent annexin V positive celler under NSC745885 behandling ble sammenlignet med kjøretøykontroller (0 mm) (n = 3; **, P 0,01; ***, P 0,001; ns, ikke-signifikant.).
Videre undersøkte vi også veksthemmende virkning i andre orale kreftcellelinjer, inkludert OECM-en, SCC25, og SCC4. Vi fant at NSC745885 oppviste også en sterk veksthemmende virkning på OECM-1-celler ved doser på 1 uM eller høyere ved enten 24 eller 48 timer etter medikamentbehandling (Fig. 3A og 3B). Denne forbindelsen utviste en enda høyere hemmende effekt hos SCC4 celler (Fig. 3C og 3D). I motsetning til dette, er det betydelige forskjeller bare ved 4 um på SCC25 celler ved enten 24 eller 48 timer (fig. 3E og 3F). For å undersøke innflytelsen av NSC745885 i normale vev, evaluerte vi også den cytotoksiske virkning av dette stoffet i MRC-5-celler (en normal human føtal lunge fibroblast-cellelinje) [21]. Våre resultater funnet at bare høye konsentrasjoner av NSC745885 (4 uM) i betydelig grad påvirke veksten av MRC-5-celler (Fig. 3G og 3H), som indikerer at NSC745885 viser en spesifisitet for kreftceller.
Orale kreftceller ( OECM-1, SCC4, og SCC25) og normal lunge fibroblast MRC-5 celle ble behandlet med NSC745885 i 24 eller 48 timer med indikerte konsentrasjoner. Levedyktigheten til disse cellelinjer ble bestemt ved MTT assay.The Resultatene indikerte at lave mikromolare konsentrasjoner av NSC745885 indusert (A) SAS celledød, men påvirket ikke veksten av (G og H) MRC-5-celler (n = 3; * P 0,05, **, P 0,01; ***, P 0,001; ns, ikke-signifikant)
NSC745885 Behandling induserer apoptose av SAS Cells
.. for å undersøke effekten av NSC745885 på induksjon av apoptose i SAS-celler, ble cellene behandlet med forskjellige doser av NSC745885 i 24 timer, og mRNA ekspresjonsnivå av caspase-3 ble målt ved anvendelse av sanntids RT-PCR. Vår resultat indikerte at ekspresjonen av caspase-3 ble betydelig øket med NSC745885 behandling på en doseavhengig måte (fig. 4A). Proteinnivåer av kaspase-3 og kaspase-3 spaltet i SAS-celler ble også bestemt ved hjelp av western blot. Det var signifikante økninger i kaspase-3 og kaspase-3 spaltet ved behandling med høyere konsentrasjoner enn 1 um (Fig. 4B). De relative protein nivåer mellom ulike doser ble sammenliknet med en tetthet meter, viser konsistente resultater med direkte observasjon i western blot (fig. 4C og 4D). Disse data indikerte at NSC745885 behandling induserte apoptose av SAS cellene.
(A) Den relative RNA-ekspresjon nivå av caspase-3 i SAS celle behandlet med angitte doseringer av NSC745885 i 24 timer ble evaluert ved anvendelse av sanntids RT-PCR. Ekspresjonen av caspase-3 betydelig øket med NSC745885 behandling i et dose-avhengig måte. (B) Den caspase-3 og spaltes caspase-3-proteinnivåer i SAS cellen behandlet med NSC745885 i 48 timer ble kvantifisert ved hjelp av western blot. (C) Resultatene av western blot i caspase-3 ble undersøkt i 3 uavhengige eksperimenter og normalisert med β-aktin (*, P 0,05, ** P 0,01; ***, p 0,001; ns., ikke-signifikant). Proteininnholdet av caspase-3 var høyest i 1,5 μΜ av NSC745885 behandling. (D) Resultatene av western blot i kløyvet caspase-3 ble undersøkt i 3 uavhengige eksperimenter (*, P 0,05;. Ns, ikke-signifikant).
NSC745885 Reduserer RNA og protein Ekspresjon av XIAP i SAS celler
X-bundet hemmer av apoptose protein (XIAP) har blitt identifisert som et anti-apoptotisk protein i pattedyrceller [22]. Det spiller en viktig rolle ved inhibering av apoptose i både død reseptor-mediert og mitokondrier-medierte baner [23], [24]. En fersk studie videre vist at XIAP er en prediktor for kjemoterapi respons og prognose for avanserte hode og hals kreftpasienter [25]. Derfor har vi også undersøke effekten av NSC745885 på XIAP gen og protein ekspresjon i orale kreftceller, behandlet vi SAS kreftceller med forskjellige konsentrasjoner (0 uM, 0,5 uM, 1,0 uM, 1,5 uM og 2,0 uM) i 24 timer , og deretter bestemmes deres endring i genekspresjon ved hjelp av Q-PCR. Sammenlignet med kontrollceller, ekspresjon XIAP genet betydelig redusert med NSC745885 behandling på en doseavhengig måte (fig. 5A). Vi behandlet også SAS kreftceller med forskjellige konsentrasjoner (0 pM, 0,5 pM, 1,0 pM, 1,5 pM og 2,0 pM) i 48 timer, og deretter bestemmes deres proteinekspresjon endringer ved hjelp av western blot. En betydelig reduksjon i XIAP ble observert etter behandling med høyere konsentrasjoner enn 1 uM (fig. 5B). De relative protein nivåer mellom ulike doser ble også sammenlignet ved hjelp av en tetthet meter, viser konsistente resultater med direkte observasjon i western blot (Fig. 5C). Resultatene indikerte at NSC745885 viste en apoptose fremmende effekt på SAS-cellene.
Den relative RNA uttrykk nivå XIAP i SAS celler behandlet med angitte doser av NSC745885 ble evaluert etter 24 timer ved hjelp av real-time RT- PCR. Ekspresjonen av XIAP betydelig redusert med NSC745885 behandling på en doseavhengig måte. (B) Ekspresjon av XIAP i SAS-celler behandlet med NSC745885 ble kvantifisert ved hjelp av western blot ved 48 timer etter behandling. (C) Western blot resultatene ble evaluert i 3 uavhengige eksperimenter og normalisert med β-aktin (*, P 0,05, ** P 0,01; ***, p 0,001). Proteininnholdet av XIAP redusert på en doseavhengig måte.
NSC745885 hemmer SAS cellevekst
in vivo
For å evaluere anti-tumor potensialet i NSC745885 på kreft i munnhulen
in vivo
, gjennomførte vi denne behandlingen i en xenograft tumor-bærende mus modell. SAS celler ble inokulert i NOD /SCID-mus og NSC745885 ble injisert på dag 3 i hver gruppe mus, før noen svulst ble palperes, og administreres hver dag frem til dag 10 i bærende mus. Tumorstørrelsen ble redusert i de behandlede mus sammenlignet med de tumorbærende kontrollmus som ble behandlet med bærer alene (figur 6A.). SAS xenografter redusert vekten med 23 ± 10,39% med NSC745885 behandling (Fig. 6B). Kroppsvektene til kontroll og NSC745885-behandlede mus ble også vurdert på dag 1 og 10 etter legemiddeladministrering. Ingen signifikante forskjeller ble funnet i kroppsvekt av kontroll eller NSC745885-behandlede mus (Fig. 6C). Disse resultatene indikerte at NSC745885 behandling med 2 mg /kg utviste en anti-oral cancer effekt, og denne behandlingen ikke fører til markert toksisitet hos eksperimentelle mus.
(A) kreftcelle implanterte NOD /SCID-mus ble administrert med NSC745885 (2 mg /kg /d). Innpodet svulster ble isolert på dag 10 etter legemiddeladministrasjon. NSC745885 behandling signifikant redusert tumorstørrelse sammenlignet med bærerkontroll. (B) Den gjennomsnittlige tumorvekt ble sammenlignet mellom den NSC745885-behandlede og PBS-behandlede tumorbærende mus på dag 10 (n = 9; *, P 0,01). (C) Kroppsvekten av den eksperimentelle mus var ikke signifikant reduksjon med NSC745885 behandling sammenlignet med PBS behandlede kontroller.
NSC745885 indusere apoptose i xenopodet tumorceller
For å observere direkte apoptotiske virkning av NSC745885 på tumorceller
in vivo
, utførte vi immunhistokjemisk farging for å vurdere statusen til apoptotiske protein caspase-3 i xenotransplantater. Etter 10 dager etter transplantasjon, ble xenotransplantater fjernet, målt etter størrelse, og undersøkt med HE og immunhistokjemisk farging. Svulster fra NSC745885-behandlede mus oppviste vevsskade i tumordelen (fig. 7A) og en markert høyere telling av apoptotiske celler (caspase-3-positive celler) sammenlignet med kontrolltumorer (fig. 7B). Vi vurderte også uttrykk for XIAP i xenografter. Resultatet viste at NSC745885-behandlede mus oppviste en markert lavere telling av anti-apoptotiske celler (XIAP positiv celle) sammenlignet med kontrolltumorer (Fig. 7C). Ekspresjonsproduktene score av caspase-3-positive celler var 1,21 ± 0,04 og 2,87 ± 0,03 i kontrollgruppen og NSC745885-behandlede gruppe, henholdsvis (fig. 7D). Ekspresjonsproduktene poengsummene for de XIAP positive celler var 2,24 ± 0,03 og 1,16 ± 0,02 i kontrollgruppen og NSC745885-behandlede gruppe, respektivt (figur 7E.). Følgelig våre resultater viste at NSC745885 reduserer spredning av SAS-kreftceller, og som virker anti-tumor effekt
in vivo
gjennom induksjon av apoptose.
(A) De histologiske forandringer i tumor grafts ble vurdert ved hjelp av HE farging. Sammenligning av PBS kontroll med NSC745885-behandlede grupper viste en markert tumor nekrose i NSC745885-behandlede gruppen. (B) Ekspresjonsnivået av caspase-3 i isolerte tumor implantatene ble evaluert ved hjelp av immunhistokjemisk farging. (C) Ekspresjonsnivået av XIAP i isolerte tumor implantatene ble også evaluert ved hjelp av immuno-histokjemisk farging. Ekspresjonselementene skår for caspase-3 (D) og XIAP (E) ble kvantifisert, og viser en økning i ekspresjon av caspase-3 med NSC745885 behandling (P 0,05). I motsetning uttrykk for XIAP i tumor grafts redusert med denne behandlingen (P 0,05).
Effekter av NSC745885 på kroppsvekt hos mus
For å avgjøre om NSC745885 behandling årsaker vekttap, overvåket vi endring av kroppsvekt i den eksperimentelle mus. En signifikant cytotoksisk effekt av NSC745885 ble åpenbart med den daglige administrasjonen av NOD /SCID i en dose på 40 mg /kg /d (fig. 8A). Kroppsvekten til musene behandlet med den høyere dose var signifikant redusert, og alle musene døde innen dag 14. I denne studien, har vi funnet at den maksimale tolererte dosen av NSC745885 i mus som var 40 mg /kg /dag. For å bestemme hvorvidt NSC745885 behandling laget cytotoksisitet i organer av de eksperimentelle mus, ble milt, lunger, lever, hjerte og høstet fra PBS-behandlede og NSC745885-behandlede mus på dag 14 og ble vurdert ved hjelp av en histologisk analyse. Ingen åpenbare forskjeller fantes i de organene i PBS-behandlede eller NSC745885-behandlede mus (fig. 8B-8E). Dette resultat indikerte at den daglige behandling av NSC745885 ved 2,0 mg /kg /dag i.p. fremkalte ikke markerte bivirkninger hos musene.
(A) NOD /SCID-mus ble behandlet med PBS eller indikerte daglige doser av NSC745885, og kroppsvekten hos disse musene ble målt. Påvirkningen av NSC745885 behandling på organer i eksperimentell mus ble vurdert ved hjelp av en histologisk analyse og HE flekker på dag 14. Ingen åpenbare forskjeller fantes i (B) milt, (C) lunge, (D) lever, eller (E) hjertet av PBS-behandlede og NSC745885-behandlede mus.
Sammenligninger av sikkerhet og anti-tumor Effektivitet mellom NSC745885 og doxorubicin
å sammenligne sikkerheten NSC745885 med doxorubicin, vi behandlede NOD /SCID-mus med disse to forbindelser ved 2 mg /kg /ip i 10 dager. Overlevelse og kroppsvekt av forsøks mus ble overvåket daglig. Våre resultater viste at 50% av doxorubicin-behandlede mus var døde på dag 11 (Fig. 9A). I motsetning til dette, ble alle NSC745885-behandlede mus overlevende på dag 11 (Fig. 9A). Det er vesentlig redusert i kroppsvekter på doxorubicin-behandlede mus sammenlignet med NSC745885-behandlede grupper (Fig. 9B). Disse resultatene indikerte at NSC745885 utviste en høyere sikkerhet enn doxorubicin. Videre har vi også sammenlignet med anti-tumoreffektiviteten mellom disse to stoffene ved å måle tumorvektene i xenograft-bærende tumormodell. NOD /SCID-mus ble inokulert med SAS-celler og behandlet med 2 mg /kg /dag i.p. av doksorubicin eller NSC745885 fra dag 3 til dag 10 etter celle inokulasjon. Svulster ble høstet på dag 11 (fig. 9C, n = 9) og tumorvekt ble målt. Det er ingen signifikant forskjell mellom doxorubicin-behandlede og NSC745885 behandlede gruppene (Fig. 9D, n = 9), noe som indikerer en sammenlignbar anti-tumor effektivitet mellom disse to stoffene.
Den kreftcelle implantert NOD /SCID-mus
