Abstract
sialidase fjerner sialsyre fra sialoglycoconjugates og spiller viktige roller i mange fysiologiske og patologiske prosesser. Forskjellige humane kreftformer uttrykke et unormalt høyt nivå av plasmamembranen-assosierte sialidase isoform.Visualization av sialidase aktivitet i levende pattedyrvev vil være nyttig ikke bare for forståelsen av sialidase funksjoner, men også for kreftdiagnostikk. Men siden enzymaktivitet hos pattedyr sialidase er bemerkelsesverdig svak sammenliknet med den for bakterielle og virale sialidases, har det vært vanskelig å detektere sialidase aktivitet i pattedyr-vev. Vi har syntetisert en ny benzothiazolylphenol basert sialinsyre-derivat (BTP-Neu5Ac) som et fluorescerende sialidase substrat. BTP-Neu5Ac kan visual sialidase aktiviteter følsomt og selektivt i akutte rottehjerneskiver. Kreftceller implantert orthotopically i muse kolon og menneskelig tykktarm kreft (stadier T3-T4) ble også klart påvist med BTP-Neu5Ac. Resultatene tyder på at BTP-Neu5Ac er nyttig for histokjemisk avbildning av sialidase aktiviteter
Citation. Minami A, Otsubo T, tieno D, Ikeda K, Kanazawa H, Shimizu K, et al. (2014) Visualisering av sialidase Aktiviteten i pattedyrvev og Cancer Detection med en Novel Fluorescent sialidase underlaget. PLoS ONE 9 (1): e81941. doi: 10,1371 /journal.pone.0081941
Redaktør: Alberto G. Passi, Universitetet i Insubria, Italia
mottatt: 25. juli 2013; Godkjent: 17 oktober 2013; Publisert: 10 januar 2014
Copyright: © 2014 Minami et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Grant-i-Aid for Unge Forskere (B) (KAKENHI;. no 24790080), The Sasakawa Scientific Research Grant fra Japan Science Society og The Naito Foundation tilskudd til fremme av konkrete forskningsprosjekter. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
sialidase (EC 3.2.1.18) fjerner sialsyre fra sialoglycoconjugates, for eksempel glykoproteiner og glykolipider. Pattedyr sialidase er kjent for å ha 4 isoformer (NEU1, NEU2, NEU3 og NEU4) og spiller mange roller i cellefunksjoner inkludert differensiering, vekst, apoptose og migrasjon og i overlevelse og spredning av kreftceller [1], [2]. Visualisere detaljert fordeling av sialidase aktivitet i pattedyr vev kan hjelpe oss til å forstå de fysiologiske og patologiske roller sialidase. I tillegg, siden ekspresjonsnivået av NEU3, et plasmamembran-assosiert sialidase, blir merkbart øket i forskjellige humane cancerformer så som kolon-, nyre-, prostata og eggstokk-kreft [1], [2], [3], deteksjon av membran sialidase aktiviteter i levedyktige kreftvevet vil også være nyttig for kreftdiagnose og sanntids overvåkning av kreft i løpet av en kirurgisk operasjon.
X-Neu5Ac (5-brom-4-klorindol-3-yl-α-DN-acetylneuraminsyre syre) er en mye brukt kunstig sialidase substrat for cytokjemiske og histokjemisk avbildning av sialidase aktivitet. Forbindelse X (5-brom-4-klor-3-hydroksyindol) frigjøres fra X-Neu5Ac med sialidase og oksideres til en vann-uløselig synlig indigo blå. For å forbedre spesifisiteten av flekker, er indigogenic substrater ofte brukt sammen med en ekvimolar blanding av K
3 [Fe (CN)
6] og K
4 [Fe (CN)
6] som en oksidasjonskatalysator. Imidlertid er følsomheten ikke er tilstrekkelig til å observere den detaljerte fordeling av sialidase aktivitet i pattedyrvev [4]. Enzymaktivitet hos pattedyr sialidase er bemerkelsesverdig lav sammenlignet med den av bakterier og virus [5], [6]. For å øke følsomheten av X-Neu5Ac, en sensibilisator for eksempel Fast Red Violet LB (FRV LB) som en kopler for å danne et azo-fargestoff brukes sammen med X-Neu5Ac [6], [7], [8]. Imidlertid, siden en to-trinns reaksjon er nødvendig for farving med den FRV LB, ikke-spesifikk farging forårsaket av sensibilisator er uunngåelig, og gjør det vanskelig å bruke, særlig i kliniske felt. I denne studien har vi utviklet nye fluorescerende sialidase underlag, benzothiazolylphenol baserte Sialinsyren derivater (BTP-Neu5Ac), til svært sensitiv og spesifikk visualisering av sialidase aktivitet i levende pattedyr vev av en enkelt-trinns reaksjon.
i denne studien fant vi at BTP-Neu5Ac kan visual sialidase aktiviteter følsomt og selektivt i akutte rottehjerneskiver. BTP-Neu5Ac kan også tydelig oppdage kreftceller implantert orthotopically i muse kolon og menneskelige tykktarm kreft.
Materialer og metoder
Syntetiske prosedyrer
Syntesen av forbindelser er beskrevet i detalj i File S1
Material
følgende produkter ble kjøpt fra leverandørene angitt:.. sialidase fra
Arthrobacter ureafaciens plakater (Ausa, uttrykt rekombinant i
Escherichia coli
, Calbiochem, San Diego, CA, USA), X-Neu5Ac (Peptide Institute, Osaka, Japan), halotan (Takeda Pharmaceutical Company, Osaka, Japan), Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan), penicillin og streptomycin (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA), fetal bovine serum (FBS, AusGeneX, Molendinar, QLD, Australia), fysoerytrin (PE) konjugert geit anti-kanin IgG (Santa Cruz Biotechnology, Dallas , TX, USA) og kanin anti-CD71 (transferrin reseptor) polyklonale antistoff (analysen Biotechnology, Sunnyvale, CA, USA). Reagenser som brukes for å lage bufferløsninger ble kjøpt fra Wako Pure Chemical Industries.
forsøksdyr
Rotter og mus ble kjøpt fra Japan SLC (Hamamatsu, Japan). De ble plassert under standard laboratorieforhold (23 ± 1 ° C, 55 ± 5% fuktighet) og hadde tilgang til vann fra springen og kosthold
ad libitum
. Lysene ble automatisk slått på 08:00 og slått av kl 20:00. Alle forsøkene ble utført i samsvar med den japanske Farmakologisk Society guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, og protokollene ble forhåndsgodkjent av Animal Etisk komité Universitetet i Shizuoka.
Spectrum analyse
Fluoriserende spektra av 5 mM BTP2, BTP3 og BTP4 i kunstig cerebrospinalvæske (ACSF, pH 7,3, 200 ul) inneholdende 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,5 mM CaCl
2, 1.3 mM MgCl
2 , 1,0 mM NaH
2PO
4, 26,2 mM NaHCO
3 og 11 mM D-glukose ble målt med en mikroplateleser, Infinite M200 (Tecan, Männedorf, Schweiz). Eksitasjon spektra ble kjøpt med emisjonsbølgelengder på 518 nm for BTP2, 526 nm for BTP3 og 542 nm for BTP4. Utslipps spektra ble kjøpt med eksitasjonsbølgelengdene på 370 nm for BTP2, 372 nm for BTP3 og 374 nm for BTP4. Fluorescens utsikt over 5 mM BTP2, BTP3 og BTP4 i ACSF og BTP2, BTP3 og BTP4 på et filterpapir ble fotografert etter eksitasjon UV-lys på 365 nm (Vilber Lourmat, Marne-la-Vallée, Frankrike) med et digitalt kamera, CX1 ( . Ricoh, Tokyo, Japan)
Kvantitativ analyse av sialidase aktivitet
AUSA (10
0-10
5,7 uU ml
1: en enhet ble definert som den mengde enzym som katalyserte frigjøringen av 1 pmol sialinsyre i 1 min.) ble inkubert i 100 pl 100 mM natriumfosfatbuffer (pH 7,3) inneholdende 10 uM BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac, BTP4-Neu5Ac eller resorufin -Neu5Ac (Res-Neu5Ac) ved 37 ° C i 60 minutter i en 96-brønners sorte mikroplate (Corning, Corning, NY, USA). Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetning av 150 ul av natriumkarbonat (500 mM, pH 10,7) til hver brønn. Intensiteten av fluorescens ble målt med en mikroplateleser (ex /em: 370 nm /518 nm for BTP2, 372 nm /526 nm for BTP3, 374 nm /542 nm for BTP4 og 570 nm /585 nm for resorufin).
Påvisning av sialidase aktivitet på en PVDF-membran
AUSA (10
-1-10
4 uU) ble blottet på en polyvinylidin difluorid (PVDF) membran ved anvendelse av en 96-brønns dotblotter (sirkel vel størrelse: 28,3 mm
2, Sanplatec, Osaka, Japan). Hver brønn ble vasket med 100 mM natriumfosfatbuffer (pH 7,3), og deretter 50 pl av 10 pM BTP4-Neu5Ac eller X-Neu5Ac i natriumfosfatbuffer ble tilsatt. Etter inkubering ved 37 ° C i 6 timer, ble reaksjonsoppløsningene fjernet, og deretter blir PVDF-membranene ble observert med et digitalt kamera under UV-lys (365 nm) for BTP4-Neu5Ac eller med et stereomikroskop SZX7 (Olympus, Tokyo, Japan) i henhold til synlig lys for X-Neu5Ac.
Imaging av sialidase aktivitet i hjerneskiver
Wistar-rotter (hann, 7-10 uker gamle, n = 3) ble bedøvet med halotan og halshugget. Hjernen fra hver rotte ble raskt høstet og nedsenket i iskald ACSF for å undertrykke overdreven nevronal eksitasjon og skader. ACSF anvendt i dette eksperiment ble kontinuerlig gjennomboblet med 95% O
2 og 5% CO
2. Koronale hjernesnitt (400 mikrometer i tykkelse) ble fremstilt ved anvendelse av en LinearSlicer PRO-7 (Dosaka EM, Kyoto, Japan) i iskald ACSF. Akutte hjerneskiver ble opprettholdt i ACSF ved romtemperatur i minst 60 min og deretter inkubert med 400 ul ACSF som inneholdt 1 mM BTP2-Neu5Ac (n = 3), BTP3-Neu5Ac (n = 4) eller BTP4-Neu5Ac (n = 4 ) ved 27 ° C i 1 time. Inkubasjon kamre ble kontinuerlig boblet med 95% O
2 og 5% CO
2 under farging. Skivene ble vasket tre ganger med ACSF og overført til Iwaki 3,5 mm glass-basert retter (Asahi Glass, Tokyo, Japan) som er fylt med ACSF. Fluorescens ble observert ved hjelp av en IX71 fluorescens mikroskop (eksitasjon filter /utslipp filter: BP330-385 /BA420 eller BP330-385 /BA510IF, Olympus). Bakgrunnsnivået av fluorescens for sialidase aktivitet avbildning ble bestemt ved inkubering av hjerneskiver i ACSF uten et substrat. I alle observasjoner med fluorescens mikroskop, ble gevinst på en DP70 Digital Microscope kamera (Olympus) satt ikke å detektere bakgrunn fluorescens.
For hele området avbildning av hjernen skive, ble bildene tatt sekvensielt og hver brikke ble flislagt ved hjelp av Photoshop CS4 (Adobe Systems, San Jose, CA, USA). Ved behov, ble samme behandling utført i det følgende eksperiment.
Cytotoksisitet
MDCK-celler ble utsatt for et serumfritt medium (SFM) inneholdende 10 eller 100 mM BTP-Neu5Ac eller BTP. Utgitt LDH ble målt ved hjelp av en kombinert enzymatisk analyse (CytoTox-OneTM, Promega, WI, USA).
Mus kolon tumormodellen
Murine Colon 26 NL-17 carcinoma celler ble dyrket i DMEM supplert med 10% FBS, 100 enheter ml
-1 penicillin og 100 ug ml
-1 streptomycin ved 37 ° C i nærvær av 5% CO
2 i en fuktig atmosfære. Tykktarmskreftceller ble implantert orthotopically følge en protokoll basert på metoden beskrevet av Takahashi
et al. Product: [9] BALB /cCrSlc mus (hann, 6 uker gamle) ble fastet i 12 timer og deretter bedøvd med kloralhydrat (400 mg kg
-1 kroppsvekt). For å indusere kolitt, ble musene injisert intrarektalt med 200 ul 0,1 M HCl til en kolon området 1,5 cm fjernt fra anus via anus. Etter 10 min ble musene injisert intrarektalt med 200 pl av 0.1 M KOH for nøytralisering, etterfulgt av injeksjon med 400 ul PBS. Etter 9 timer ble musene bedøvet igjen og injisert intrarektalt med 200 ul Colon26 NL-17-celler (8 x 10
6 celler) suspendert med serumfritt DMEM på samme måte. Anus ble straks spent fast med en liten Klemme i 2 timer. At en (n = 3) eller to uker (n = 3) etter orthotopic implantasjon av tykktarmskreft, ble kolon høstet etter intrakardiell perfusjon med PBS for å fjerne blod fra hele kroppen.
Menneskelig tykktarmskreft prøver
To kirurgiske prøver ble innhentet fra human kolon adenokarsinom (UICC T klassifisering T3 og T4) og farget med BTP4-Neu5Ac innen 2 timer etter operasjonen. Studien ble godkjent av etikkomiteen i Shizuoka General Hospital (Protokoll 13-03-59) og Universitetet i Shizuoka (Protocol 25-2), og er i tråd med menneskerettighetserklæringen, Helsinki, ga 2002. Alle pasienter skriftlig informert samtykke.
Påvisning av tykktarmskreft med BTP4-Neu5Ac
mus og menneske tykktarm kreft vev ble inkubert i PBS som inneholder 100-200 mM BTP4-Neu5Ac ved 37 ° C i 60 min. Etter vasking med PBS, ble fluorescens observert med et fluorescens-mikroskop (eksitasjon filter /emisjonsfilter: BP330-385 /BA420) eller IVIS Imaging System (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). Bakgrunnsnivå av fluorescens ble bestemt ved å bruke vanlige kolon ruges i PBS uten BTP4-Neu5Ac.
histopatologiske flekker
Mus og menneskelige kolon som hadde blitt brukt for sialidase aktivitet avbildning ble fiksert med 4% paraformaldehyde . Etter å ha blitt integrert med parafin, ble vevet skåret i 4-7 mikrometer tykke seksjoner og farget ved å bruke kanin anti-CD71-antistoff som det primære antistoff, PE-konjugert geit-anti-kanin-IgG-antistoff som det sekundære antistoff og 4 «, 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI, Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan).
reproduserbarhet
Alle stainings ble gjentatt minst to ganger og reproduserbarhet ble bekreftet.
Resultater og diskusjon
design av nye sialidase substrat for histokjemisk avbildning
for å visualisere sialidase aktivitet på vev, bør aglykon av sialidase substratet være en vann-uløselig flekker fargestoff som skal festes til vevet . Siden fluoroforen av 4-metylumbelliferyl-α-D-
N
-acetylneuraminic syre (4MU-Neu5Ac), en vanlig brukt kunstig sialidase substrat for kvantifisering av enzymaktivitet, er vannoppløselige, er ikke 4MU-Neu5Ac egnet for histokjemisk avbildning av sialidase aktivitet. Benzothiazolylphenol (BTP), en vann-uløselig fluorofor, viser intens fluorescens i fast tilstand [10]. BTP-baserte fluorescerende prober er blitt brukt for noen biologiske og kjemiske indikatorer [11], [12], [13]. Når BTP-derivater, BTP2 [14], BTP3 [15] og BTP4 [15], ble satt i en kunstig cerebrospinalvæske (ACSF, pH 7,3), de ble utfelt på bunnen av testrørene (figur 1 A).
A, Fluorescens utsikt over BTP2, BTP3 og BTP4 i ACSF (øverst) og på filterpapir i henhold til 365 nm UV-lys (lavere) er vist. B-D, eksitasjon (blå prikker og linjer) og utslipps (røde prikker og linjer) spektra av BTP2 (B), ble BTP3 (C) og BTP4 (D) målt i ACSF (pH 7,3). Blå og røde tallene representerer bølgelengden (nm) på topp fluorescens intensitet. Forkortelser:. RF, relativ fluorescens intensitet
BTP2, BTP3 og BTP4 har ulike utslipp og eksitasjon spektra (figur 1 B-D). Siden fluorescerende fargestoffer som har ulike eksitasjon og emisjonsspektrene har en fordel over utvalg av filter sett til å ta fluorescens bilder, brukte vi disse tre BTP derivater som aglycone av sialidase underlaget.
Hydrolyse av BTP-Neu5Ac med sialidase fra
Arthrobacter ureafaciens
Vi syntetiserte BTP-baserte sialinsyre-derivater (BTP-Neu5Ac), BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac og BTP4-Neu5Ac, i henhold til det syntetiske skjema vist i figur 2 . Disse sialinsyre-derivatene var vannoppløselige og viste liten fluorescens. Når BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac og BTP4-Neu5Ac ble inkubert i ACSF inneholder 10
0-10
5,7 uU ml
-1 sialidase fra
Arthrobacter ureafaciens plakater (AUSA) ved 37 ° C i 60 minutter (pH 7,3), fluorescerende intensitet ble øket proporsjonalt med konsentrasjonen av AUSA og nådde et platå ved høye konsentrasjoner (figur 3 A-C). Ekstinksjonskoeffisienter (M
-1 cm
-1) av BTP2, BTP3 og BTP4 i kloroform var 14 970, 12 440 og 14 350 kroner. Resultatene indikerte at BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac og BTP4-Neu5Ac er nyttige for kvantitativ analyse av sialidase aktiviteter
Betingelser:. (A) Amber IR-120 (H
+), tørr MeOH, over natten, 92% utbytte. (B) AcCl-AcOH, overnatting, Quant. (C) BTP2~4, NaH, THF-DMF, romtemperatur, over natten. (D) NaOMe, tørr MeOH, 6 timer, romtemperatur, deretter NaOH aq., MeOH, værelsestemperatur i 2 dager.
A-D, Relative fluorescensintensiteter proporsjonalt økte med økende mengder av AUSA i 10 uM BTP2-Neu5Ac (A), BTP3-Neu5Ac (B) og BTP4-Neu5Ac (C), men ikke i 10 um Res-Neu5Ac (D). Hver bar og linjen representerer gjennomsnitt ± SEM (N = 3). Fluorescensstyrkene til hver svart strek ble satt til 10
5. Res: 10 mikrometer Resorufin. E, AUSA blottet på PVDF membraner ble farget med 10 mm BTP4-Neu5Ac eller X-Neu5Ac. PVDF-membranene ble observert under UV-lys for BTP4-Neu5Ac eller synlig lys for X-Neu5Ac. Den blå fargen skyldes farging av AUSA med 100 uM X-Neu5Ac er vist på høyre side av den stiplede linjen.
Resorufin er en vann-uløselig fluorofor med en molekylstørrelse som tilsvarer den for BTP- Neu5Ac. Resorufin-baserte glykosidase substrater har vært benyttet for cytokjemiske farging og måling av enzymaktivitet [16]. I tilfelle av sialinsyre-derivater med resorufin (Res-Neu5Ac), ble fluorescerende intensiteter ikke vesentlig endret av AUSA (en-veis ANOVA, figur 3 D). BTP-Neu5Ac ville være mer egnet enn Res-Neu5Ac til å passe reaksjonen lomme i sialidase.
AUSA blottet på en PVDF-membran med forskjellige konsentrasjoner ble farget med 10 uM BTP4-Neu5Ac. Som et resultat av observasjon under UV-lys, kan fluorescerende intensiteter endres i et bredt dynamisk område (figur 3 E, øverst). Sensitiviteten av BTP4-Neu5Ac var bemerkelsesverdig høyere enn for X-Neu5Ac (figur 3 E, nederst).
Visualisering av sialidase aktivitet i rotte akutte hjerneskiver
For å visualisere sialidase aktivitet i rottehjerne, akutte hjerneskiver ble inkubert med ACSF (pH 7,3) inneholdende 1 mM BTP2-Neu5Ac, 1 mM BTP3-Neu5Ac eller 1 mM BTP4-Neu5Ac ved 27 ° C i 60 min. Inkubasjon kamre ble kontinuerlig boblet med 95% O
2 og 5% CO
2 i løpet av flekker å holde stykket tilstand sunt. Etter vasking med ACSF, hvit substans viste intens fluorescens i skivene farget med BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac og BTP4-Neu5Ac (figur 4 A-C). Dette resultatet var i overensstemmelse med resultatene fra de tidligere studier som viser at hvit substans i hjernen hos pattedyr fremviser intens sialidase aktivitet ved anvendelse av 4MU-Neu5Ac eller X-Neu5Ac med FRV LB [8], [17].
A-C , sialidase aktivitet ble fotografert i akutte koronale skiver av voksen rottehjerner med BTP2-Neu5Ac (A), BTP3-Neu5Ac (B) og BTP4-Neu5Ac (C) ved pH 7,3. Forkortelser: cc, corpus callosum; ec, ytre kapsel; fi, fimbria; hip, hippocampus; ic, intern kapsel. D, hjerneskiver ble farget med ulike konsentrasjoner (1-1000 gm) av BTP4-Neu5Ac. E, sialidase aktivitet ble fotografert med 10 uM BTP4-Neu5Ac eller 10 uM BTP4-Neu5Ac inneholdende 1 mM DANA, en sialidase inhibitor. Emisjonsfiltre som sender over 420 og 510 nm ble anvendt i A-D og E, respektivt. Skala barer i hvert panel representerer 2 mm.
Siden BTP4 er begeistret mer effektivt med eksitasjon band pass filter (330-385 nm) av en fluorescens mikroskop enn BTP2 eller BTP3, bildebehandling med BTP4-Neu5Ac viste den mest intense fluorescens i disse BTP-Neu5Ac serie. Vi har også analysert sensitivitet og spesifisitet BTP4-Neu5Ac mot sialidase. I tilfelle av sialidase aktivitet avbildning med X-Neu5Ac og FRV LB, en høy konsentrasjon av X-Neu5Ac, vanligvis 1 mM, er nødvendig for å forbedre sensitivitet og spesifisitet overfor pattedyr sialidase aktivitet [7], [8]. På den annen side kan BTP4-Neu5Ac detektere sialidase aktivitet med lave substratkonsentrasjoner til og med mindre enn 10 uM (figur 4 D). Når 2,3-dehydro-2-deoksy-N-acetylneuraminsyre (DANA, 1 mM), en sialidase inhibitor, ble anvendt i løpet av farging med BTP4-Neu5Ac, ble fluorescensen bemerkelsesverdig svekket i det hele hjernen området (figur 4 E). BTP-Neu5Ac er spesielt hydrolysert med sialidase, noe som resulterer i en bemerkelsesverdig økning i fluorescensintensitet.
Siden BTP-Neu5Ac, et hydrofilt substrat, som er fylt i det ekstracellulære rom ble hydrolysert med pattedyr sialidase av levende vev under fysiologiske betingelser ekstracellulære , ville sialidase spalte BTP-Neu5Ac hovedsakelig på celleoverflaten. Plasmamembranen sialidase NEU3 hydrolysert gangliosid effektivt og lav molekylvekt substrater som 4MU-Neu5Ac svakt [18], [19]. Selv om den optimale pH-verdi er 3,8 NEU3, hydrolyserer NEU3 gangliosid ved enda nøytral pH-verdi [19], [20]. Det lysosomale sialidase NEU1 ble også rapportert å være tilstede på plasmamembraner og for å hydrolysere 4MU-Neu5Ac effektivt [21], [22], [23]. I tillegg har den cytosoliske sialidase NEU2 en membranbundet form og hydrolyserer 4MU-Neu5Ac [24]. Derfor ikke bare NEU3 men også andre sialidase isoenzymer ville være involvert i sialidase aktivitet oppdages med BTP-Neu5Ac.
Cvtotoksisitetsmålinq av BTP-Neu5Ac og BTP
For cytotoksisitet måling, MDCK celler ble utsatt for BTP-Neu5Ac eller BTP til 6 (data ikke vist) eller 16 (figur 5) hr. Som et resultat av måling av mengden av laktat-dehydrogenase (LDH) frigjøring fra celler med skadet membran, ingen signifikant cytotoksisitet ble påvist for BTP-Neu5Ac og BTP (en-veis ANOVA).
MDCK-celler ble utsatt for et serumfritt medium (SFM) inneholdende 10 eller 100 mM BTP-Neu5Ac (A) eller BTP (B) i 16 timer og frigjort LDH ble målt. LDH utgivelsen er vist som i forhold til full LDH frigjøring (100%) ved behandling med lysebuffer.
Påvisning av kreftceller i mus kolon vev
Nylig har teknologi for kreft bildebehandling kommet bemerkelsesverdig. For eksempel Oku
mfl.
Utviklet en ny positronemitter merkede liposomer for positronemisjonstomografi (PET) til bildet en liten hjernekreft invasivt i sanntid [25]. Urano
et al.
Utviklet en kreft-måls monoklonalt antistoff konjugert med pH-aktiverbare fluorescens prober for
in vivo
tumordeteksjon [26]. En svært sensitive og spesifikke fluorescerende kreft probe har fordeler for å oppdage små kreft fordi den minste størrelsen på en svulst oppdages ved hjelp av fluorescens endoskopi (ca. ~ 1 mm) er mye mindre enn det ved PET, computertomografi (CT) og magnetisk resonanstomografi ( MRI) (ca. 5-20 mm) [27], [28]. Tidligere påvisning av kreft og etter hurtig herding av dem effektivt forhindrer ikke bare ondartet endring av cancer, men også distal metastase og sterkt løfter forbedring av prognose.
Siden tykktarmskreft er rapportert å oppvise intens enzymaktivitet av en plasmamembran assosiert sialidase [29], prøvde vi å oppdage tykktarmskreft med BTP4-Neu5Ac i levende kolon vev. Mus ble implantert med orthotopically Colon26 NL-17-celler, som er svært metastatiske kreftceller isolert fra en mus kolon adenokarsinom 26. Etter 1 eller 2 uker, ble tykktarm vev høstet og inkubert i fosfatbufret saltløsning (PBS) inneholdende 100 uM BTP4- Neu5Ac. Intens fluorescens ble observert i tykktarmen implantert med Colon26 NL-17-celler, men ikke i inflammatoriske eller normale kolon (Figur 6 A-C, fig S1). Mens normal kolon vev viste svak fluorescens, fluorescens av tykktarmskreft var mye sterkere enn normalt vev (figur 6 D-F). Regionene som viser intens fluorescens i tykktarmen implantert med Colon26 NL-17-celler ble bekreftet å ha kreft ved immunhistokjemisk farging (figur 6 G). Derfor kan tykktarm kreft skilles lett fra normalt vev ved hjelp av BTP-Neu5Ac.
A, En uke etter orthotopic kolon implantasjon av Colon26 NL-17 celler, levde kolon vev farget med BTP4-Neu5Ac. Arrowhead indikerer kreft regionen. B og C, Inflammatory (B) eller normal (C) kolon ble også farget med BTP4-Neu5Ac. Venstre, midtre og høyre panel i panel A-C viser lyse felt, fusjonert og fluoriserende utsikt, henholdsvis. D og E, Forstørret bilde av kreft (D) og normal (E) region farget med BTP4-Neu5Ac. F, Bakgrunnsfluorescens nivå av plater D og E er vist. G, Immunhistokjemisk farging (rød fluorescens) ved å bruke kanin anti-CD71-antistoff og PE-konjugert geit-anti-kanin-IgG-antistoff og nukleær farging med DAPI (blå fluorescens) ble utført for å påvise tykktarmskreft i tverrsnittene av mus kolon vev som var brukes for sialidase aktivitet bildebehandling i paneler A og D. pilene viser regionene viser intens fluorescens av BTP i panel A og D. Scale bar i panel C representerer 2,5 mm og er vanlig i paneler A og B. Scale bar i panel F representerer 0,5 mm og er vanlig i paneler D og E. Scale bar i panelet G representerer 0,2 mm.
sialidase aktiviteter uttrykt i Colon26 NL-17 ble rapportert å være svakest blant colon adenokarsinom 26 underlinjer som NL- 4, NL-17, NL-22 og NL-44 [30]. Siden selv Colon 26 NL-17 adenokarsinom implantert orthotopically i mus kolon ble påvist med BTP-Neu5Ac klart, ville BTP4-Neu5Ac være følsom nok for kreft sonde.
Påvisning av kreft i menneskelige kolon vev
det er blitt rapportert at ekspresjonsnivået av Neu3 mRNA in human colon cancer er 3-100 ganger høyere enn i normalt vev [29]. Derfor prøvde også vi å oppdage menneskelige tykktarmskreft med BTP4-Neu5Ac. Etter inkubasjon av humane tarmkreft levende vev, kategorisert som T3 ved T klassifiseringen av Union for International Cancer Control (UICC), i PBS inneholdende 200 pM BTP4-Neu5Ac, ble intens fluorescens observert i de tumor områder, men ikke i den normale regionene (Figur 7 A-G). Regionene som viser intens fluorescens og ikke-fluorescens ble bekreftet å være kreft og normale vev, henholdsvis, ved hjelp av hematoxylin-eosin-farging (figur 7 H og I). Kreft kategorisert som T4 ble også påvist med BTP4-Neu5Ac i menneskelige kolon vev (data ikke vist). Selv om ytterligere evaluering av toksisitet er nødvendig, vil det være mulig å benytte BTP4-Neu5Ac for diagnose av kreft, ikke bare i patologisk undersøkelse, men også ikke-invasiv diagnose.
A, A human koloncancer prøven (region omsluttet med en hvit linje ) ble oppnådd fra kirurgisk kreftvev (UICC T klassifisering: T3). B-D, Kolon vev ble farget med BTP4-Neu5Ac. B, C og D viser fotografisk, fusjonert og fluoriserende bilder, henholdsvis. E-G, Forstørrede fluorescens bilder av normal (E) og kreft (F og G) regioner ble kjøpt med et fluorescerende mikroskop. H og I, et langsgående stykke av colon vev ble fremstilt ved den stiplede linje i panel B. Ikke-fluorescens og fluorescens regioner i panel C ble farget med hematoksylin-eosin og er vist i paneler H og I, respektivt. Skala barer i panel B, E og H representerer 10 mm (vanlig i panelene B-D), 500 nm (vanlig i paneler E-G) og 250 um (vanlig i paneler H og I), henholdsvis.
Konklusjoner
Vi har utviklet nye fluorescerende sialidase underlag for histokjemisk farging av sialidase aktiviteter i pattedyrsvev. Siden sialidase spiller viktige roller i mange biologiske funksjoner inkludert lysosomal katabolisme, immunforsvar og nevrale funksjoner [2], [31], er BTP-Neu5Ac et kraftig verktøy for detaljert undersøkelse av sialidase funksjoner. Siden Cytotoksisiteten for BTP-Neu5Ac og BTP var upåviselig, BTP-Neu5Ac kan brukes til biologisk analyse av sialidase i det levende vev, f.eks time-lapse imaging. Til slutt ble tykktarm kreft oppdages med BTP4-Neu5Ac i en levende vev, noe som tyder på at BTP-Neu5Ac vil også være nyttig for kreft sonder.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Påvisning av tykktarmskreft med BTP4-Neu5Ac i to uker etter implantasjon av kreftceller. To uker etter orthotopical implantasjon av Colon26 NL-17 celler, ble mus kolon farget med BTP4-Neu5Ac. Inflammatoriske eller normale kolon ble også farget med BTP4-Neu5Ac. Venstre og høyre panel viser fluorescerende bilder og lyse felt bilder fusjonert med fluorescerende bilder, henholdsvis. Scale bar representerer 5,0 mm
doi:. 10,1371 /journal.pone.0081941.s001 plakater (TIF)
File S1.
Syntetiske prosedyrer og
1 H spektra av nye forbindelser
doi:. 10,1371 /journal.pone.0081941.s002 product: (PDF)
