Abstract
Vanligvis de fleste av eggstokkreft kan ikke oppdaget før i stor skala og fjernmetastasering skjer, som er den viktigste årsaken til høy dødelighet i eggstokkreft. Derfor er det presserende å oppdage metastaserelaterte biomarkører for påvisning av kreft i eggstokkene i sin okkult metastase stadium. Endret glykosylering er en universell funksjon av kreft og visse typer av sukkerstrukturer er kjente markører for tumorprogresjon. Dermed denne studien hadde som mål å avdekke konkrete endringer av
N
-glycans i secretome av metastatisk kreft i eggstokkene. Vi benyttet en kvantitativ glycomics tilnærming basert på metabolsk stabile isotoper merking for å sammenligne differensial
N
-glycosylation av secretome mellom en eggstokkreft cellelinje SKOV3 og sin høye metastatisk derivat SKOV3-ip. Forbløffende nok blant totalt 17
N
-glycans identifisert,
N
-glycans med halverer GlcNAc ble alle signifikant redusert i SKOV3-ip i forhold til SKOV3. Denne endring i halverende GlcNAc-glykoformer, så vel som den tilsvarende forbindelse med metastatisk kreft i eggstokkene oppførsel ble ytterligere bekreftet ved det glycotransferase nivå med flere teknikker, inkludert sanntids-PCR, western blotting, transwell assay lectin blotting og immunhistokjemi analyse. Denne studien viste metastaserelaterte
N
-glycan endringer i eggstokkreft secretome
in vitro
for første gang, noe som er en verdifull kilde for biomarkører i tillegg. Videre
N
-glycans med halverer GlcNAc belyse påvisning av eggstokkreft i tidlig peritoneal metastaser stadium som kan følgelig bedre prognosen for eggstokkreft pasienter
Citation. Zhang X, Wang Y, Y Qian Wu X, Z Zhang, Liu X, et al. (2014) Funn av Specific metastaser-Related
N
-Glycan Endringer i ovarialcancer Basert på kvantitative glycomics. PLoS ONE 9 (2): e87978. doi: 10,1371 /journal.pone.0087978
Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA
mottatt: 02.09.2013; Godkjent: 02.01.2014; Publisert: 06.02.2014
Copyright: © 2014 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Basic Research Program of China (973 Program) (2012CB8221004, 2013CB910503), National High-tech R D Program (863 Program) (2012AA020203) og National naturvitenskap fond (31100586, 31010103906, 30930025, 31170766, 81272879, 81302258), Shanghai Ledende akademisk disiplin Project (B117), og Shanghai grunnforskning vekt prosjekt (11JC1401502). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ovarialcancer er den mest dødelige gynekologisk kreft på verdensbasis [1], [2]. Ifølge en fersk rapport fra American Cancer Society, om lag 22,240 nye tilfeller vil bli diagnostisert med eggstokkreft i 2013, mens nesten 14 030 vil gi etter for denne sykdommen [3]. For tiden, bekken ultrasonografi og serum CA125 test tjene som hoveddeteksjons rutiner [4], [5], [6], [7], som er effektive i noen tilfeller. Men flertallet av eggstokkreft kan likevel ikke bli diagnostisert før svulsten har kommet til et avansert stadium, presentere med store eller fjernmetastaser. I klinikken er den vanligste metastatisk mønster av eggstokkreft anerkjent som peritoneal implantasjon [8]. På grunn av det faktum at tidlig peritoneal metastase nettsider vanligvis er for små til å bli oppdaget makroskopisk [4], [9], fem-års overlevelse lider alltid dette dårlig terminal diagnose og vitner en dramatisk nedgang når store peritoneal metastasering skjer, fra omtrent 90% i trinn i til 2-80% i trinn II-IV [4], [10], [11]. Derfor er det nødvendig å oppdage metastase-relaterte biomarkør som kunne hjelpe til påvisning av kreft i eggstokkene så tidlig som mulig i stedet for til den store spredningen av tumor utenfor eggstokkene.
Glykosylering er en av de mest utbredte stolpe -translational modifikasjoner som produserer ulike typer glykaner som ofte er knyttet til proteiner. Glykaner delta i store patofysiologi hendelser i løpet av tumorprogresjon [12], [13], [14]. Endret glykosylering er en universell funksjon av malignitet, og noen av disse endringer bidrar til metastatiske prosesser [12], [15]. For eksempel, økt aktivitet eller uttrykk for
N
-acetylglucosaminyltransferase V (MGAT5) og β-1, 6 GlcNAc-forgrenet
N
-glycans er funnet i svært metastatiske svulster, som tykktarms , lever- og brystkreft [16], [17], [18], [19], [20]. I tillegg har den endring i sialylering blitt rapportert å bidra til metastase i disse tumorceller så vel [21], [22], [23], [24], [25], [26], [27]. Videre har andre avvikende glykosyleringsmønstre inkludert kjerne-fukose, Halvere GlcNAc
N
-glycans har vært kjent for å være assosiert med metastase av mange ondartede celler [28], [29], [30], [31], [32]. Følgelig kreft-assosiert aberrasjoner i sukkerstrukturer tilveiebringe en overbevisende begrunnelse for ny biomarkører oppdagelse [33].
I tilfellet med eggstokkreft, har avvikende glykosylering blitt beskrevet i flere studier, hovedsakelig blant annet økt silylaiton og fucosylation av
O
-koblet glykaner, høyere nivåer av dobbeltantenneformede
N
-bundne glykaner, forhøyet kjerne fucosylation og halverer
N
-koblet glykosylering [34]. Foreløpig har rollen som glykosylering modifikasjon spille i eggstokkreft metastaser også blitt antydet i flere studier. For eksempel, mesothelin-MUC16 bindende som forenkler peritoneal metastasering av eggstokkreft har vist
N
-glycan avhengig [35]. Cellen evne til adhesjon til hyaluronan i ovarie carcinom cellelinjer kan bli endret ved å fjerne karbohydratenhetene fra celleoverflatene [36]. Disse undersøkelser antydet involvering av glykaner i de metastaseprosesser, mens s
N
-glycan forandringer assosiert med metastase i ovariekreft forble uklart, slik som de på celleoverflaten og celle utskilt glykoproteiner. Gitt at spesifikke sukker struktur endringer i kreftcelle secretome kan være potensielle biomarkører for ikke-invasiv diagnostisering [37], i denne studien, har vi fokusert på å avsløre den metastaseassosierte
N
-glycosylation endring i glykoproteiner som skilles ut av eggstokkene kreftceller.
Kvantitative glycomics basert på massespektrometri (MS) har vist seg å være en lovende og kraftig verktøy for å identifisere globale endringer av glykaner mellom ulike biologiske prøver [38], [39], [40], som inkluderer label gratis strategier og stabile isotop merking strategier. Den førstnevnte er mye enklere, mens den sistnevnte er en mer robust. En kvantitativ glycomics metode basert på metabolsk inkorporering av stabile isotopen etiketter (Isotop Påvisning av Aminosugars med Glutamin, IDAWG) har blitt rapportert nylig [41]. I denne metoden, kan differensielt merkede celler blandes sammen tidlig i arbeidsflyten, hvilken minimalisere eventuelle skjevheter innføres i løpet av den type behandling og gir en pålitelig metode for kvantifisering [39], [42]. I vår studie, forskjellig fra kvantitativ glycomics analyse av celleoverflate glykoproteiner bruker IDAWG rapportert tidligere, ble kvantitative glycomics metode basert på metabolsk inkorporering av stabile isotopen etiketter ansatt forskjells
N
-glycosylation analyse av secretome mellom to eggstokkreft celle linjer, SKOV3 og sin høye metastatisk derivat SKOV3-ip. Deretter metastaseassosierte
N
-glycan endringer i eggstokkreft oppdaget av denne glycomics metoden ble ytterligere validert på glycotransferase nivå med ulike molekylærbiologiske teknikker, inkludert real-time PCR, western blotting, lektin blotting, transwell analysen og immunhistokjemi analyse. Den totale arbeidsflyten i vår studie ble vist i Figur 1. Så vidt vi vet er dette første forsøk på å avsløre globale bildet av metastaserelaterte
N
-glycan endringer i eggstokkreft celle secretome. Videre blant disse endringene, reduksjon i bisecting GlcNAc modifikasjon og dens tilsvarende glycotransferase (mannosyl (beta-1,4 -) – Glykoprotein Beta-1,4-N-Acetylglucosaminyltransferase, MGAT3) ekspresjon ble påvist å være relatert til høyere metastatisk potensial. Denne studien gitt innsikt i oppdagelsen av metastaseassosierte biomarkør, som kan hjelpe til å oppdage tidlig peritoneal metastasering av eggstokkreft, og til slutt forbedre diagnosen eggstokkreft.
Materialer og Metoder
celle~~POS=TRUNC og Metabolsk stabile isotoper Merking
Serous eggstokkreft cellelinje SKOV3 og sin høye metastatisk derivat SKOV3-ip ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC). Disse to ovarie cancer cellelinjer ble dyrket i RPMI1640 celle media (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen). 293T cellelinje ble hentet fra Institute of Cell Biology Academia Sinica (Shanghai, Kina). 293T-celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) inneholdende 10% føtalt bovint serum. Alle celler ble dyrket med 1% penicillin /streptomycin ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 inkubator. For stabile isotop merking av forsøkene ble cellene dyrket i minst seks doblinger i RPMI1640 medium med 10% føtalt bovint serum, inneholdende 20 mM L-glutamin (enten
14N eller amid-
15 N-Gln) for å oppnå fullstendig inkorporering av merket
N
-glycans [41]. Amid-
15N-GLN (98% renhet) ble kjøpt fra Cambridge Resources, Inc. (Andover, MA, USA).
Overstående Acquisition
Seks millioner merkede celler ble sådd i 55 cm
2 cellekulturskåler og holdt over natten for cellebinding i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum, 20 mM L-glutamin (enten
14N eller amid-
15 N-Gln). Etter 12 timer ble kulturmediet fjernet, og cellene ble vasket 3 ganger med fosfat-bufret saltvann. Og deretter 10 ml av serumfritt, fenolrødt-fritt RPMI 1640 medium med 20 mM L-glutamin (enten
14N eller amid-
15N) ble tilsatt til hver skål. Etter inkubering i 48 timer ble det kondisjonerte mediet oppsamlet og filtrert gjennom et 0,22 um Durapore PVDF-membran (Millipore, Billerica, MA, USA). Før, under og etter serum sult, levedyktigheten av kreftceller ble vurdert ved hjelp av trypanblått-eksklusjon fargestoff assay. Proteinkonsentrasjonene av kondisjonert medium ble bestemt ved bruk av en BCA proteinanalysesett (Pierce, Rockford, IL). Det kondisjonerte medium med lik mengde protein oppnådd fra SKOV3 og SKOV3-ip ble blandet. Deretter ble blandingen konsentrert ved Amicon ultra-15, 3000 molekylvekt cut off (MWCO) sentrifugal- filterenheter (Millipore, Billerica, MA, USA) med overdreven fjerning av salt for kvantitative glycomics. Alle prøver ble lagret ved -80 ° C inntil videre bruk.
Frigi og rensing av N-glykaner fra utskilt Proteome
N
-koblet sukker utgivelsen og rensing var utført som tidligere beskrevet med mindre modifikasjoner [43]. Aliquoter av blandede proteinløsning (100 pl) ble fortynnet med like stort volum av denaturerende buffer bestående av 200 mM NH
4HCO
3 (Sigma-Aldrich, Tyskland) inneholdende 20 mM mdithiothreitol (Sigma-Aldrich, Tyskland). Prøvene ble varmet opp i 10 min i 95 ° C vannbad. Etter at de denaturerte prøvene avkjølt til romtemperatur, ble 1 pl av PNGase F (New England Biolabs, Inc., USA) tilsatt til hver prøve, etterfulgt av inkubering over natten ved 37 ° C. Deretter ble deglykosylert proteinene utfelt ved tilsetning av 600 ul av kjølt etanol lagret ved -80 ° C i 2 timer. Etter sentrifugering ved 14 000 x g, i 30 minutter ved 4 ° C, supernatanten ble oppsamlet og tørket ved vakuumsentrifugering. De frigitte glykaner ble ytterligere renset og avsaltet ved hjelp av en porøs Graphic Carbon Solid-Phase Extraction (PGC-SPE). For dette formål ble de PGC microcolumns pakket med porøst grafisk karbon-pulver og fremstilt ved hjelp av GELoader tips som beskrevet for [44]. De microcolumns ble forbehandlet med 6 kolonnevolumer av 0,1% (v /v) trifluoreddiksyre (TFA) i 80% acetonitril (ACN) /H
2O (v /v) og ekvilibrert med samme volum vann. Etterpå ble prøvene tilført til kolonnene gjentatte ganger til 5 ganger for å oppnå fullstendig glykaner adsorpsjon. Deretter ble microcolumns vasket med omtrent 10 kolonnevolumer av vann for å fjerne salter og buffer. Glykaner ble eluert med 25% (v /v) ACN inneholdende 0,05% (volum /volum) TFA. Hver prøve ble så delt i to like porsjoner og lyofilisert i en frysetørker vakuum (Martin Christ GmbH, Osterode, Tyskland). En lik porsjon av hver prøve ble lagret ved -80 ° C inntil videre analyse. En annen lik porsjon av hver prøve ble permethylated.
Permethylation av
N
-glycans
N
-glycans ble permethylated ved hjelp av en tidligere utgitt prosedyre med mindre endringer [45]. I korthet, ble tørket
N
-glycans ble suspendert i 200 ul dimetylsulfoksid (DMSO), og omtrent 20 mg NaOH-pulver ble tilsatt. Etter at oppslemmingen ble blandet kraftig, 100 ul CH
3I ble tilsatt, og etter inkubasjon ble utført i et ultralydbad i 30 min. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 1 ml vann, og det overskytende CH
3I ble fjernet under en strøm av nitrogen. Deretter ble 1 ml kloroform ble tilsatt under sterk blanding. Etter faseseparasjon ble den vandige fasen kastes, mens den nedre kloroformfasen ble vasket 10 ganger med 1 ml H
2O og tørket ned under en strøm av nitrogen i en hette for matriks-assistert laserdesorpsjon /ionisering massespektrometri (MALDI MS) analyse.
MALDI MS analyse
MALDI massespektrometrisk analyse ble utført på AXIMA Resonance MALDI QIT TOF MS (Shimadzu Corp., Kyoto, Japan) med en 337 nm nitrogen laser. Alle prøvene ble analysert på en 20-kV akselerasjonsspenning i den positive ion og reflectron modus. CID ble utført ved en kollisjonsenergi på 4 keV ved hjelp av argon som kollisjonsgass. Instrumentet ble eksternt kalibrert ved TOFMix ™ (LaserBio Labs, Frankrike) som inneholder åtte peptider kalibrering standard. Før MS-analyse, ble unpermethylated glykaner rekonstituert i en 5 ul alikvot av 0,1% (volum /volum, vol /vol) TFA i 50% ACN /H
2O (v /v) og permethylated glykaner ble rekonstituert i en 5 ul alikvot av 50% metanol. Hver prøve (1 ul) ble flekket på en MALDI mål og fikk tørke i luft ved omgivelsestemperatur. Etterpå 1 mL av 2,5-dihydroksybenzosyre matrise (DHB, Sigma-Aldrich, Tyskland) ved en konsentrasjon på 12,5 mg ml
-1 i 50% ACN i vann (v /v) inneholdende 0,1% TFA ble tilsatt på prøven laget og tørket under omgivelsesbetingelser. Hver prøve ble oppdaget i tre eksemplarer. To laser skudd ble satt til å generere en profil og 200 profiler ble samlet fra ulike steder av laserbestråling i én fil for hver prøve spot. For sammenligning av
N
-glycans fra secretomes av de to eggstokkreft celler, en 01:01 blanding av
14N- og
15N-merket prøvene ble først innhentet gjennom å blande lik starter proteiner beløp. Og blandingen ble analysert (tre paralleller) for å bestemme relative endringer i Forekomsten av
N
-glycans mellom eggstokk-kreft cellelinje SKOV3 og dens høye metastatisk derivat SKOV3-ip. Alle de foreslåtte strukturene av identifiserte glykaner ble tolket manuelt basert på deres
m /z
verdier i henhold til serveral tidligere publiserte litteraturen [46], [47], GlycoWorkbench [48], Glycan Mass Spectral Database [49] som samt GlycoBase (versjon 2, https://glycobase.nibrt.ie/glycobase.html).
Kvantitativ real-time PCR for mRNA uttrykk analyse
Totalt RNA ble ekstrahert fra eggstokkreft cellelinjer med TRIzol ™ reagens (Invitrogen) og 2 mikrogram av total RNA ble revers transkribert ved å bruke RT Master Mix sett (Takara) i henhold til produsentens instruksjon. Real-time PCR ble utført på ABI 7500 Fast Real-time PCR system (Applied Biosystems). PCR veksling besto av en enkelt inkuberingstrinn ved 95 ° C i 30 sekunder, etterfulgt av 40 sykluser med 5 s ved 95 ° C og 34 s ved 60 ° C. Alle PCR-reaksjoner ble utført med SYBR-grønn Premiks Sanntids-PCR Kit (Takara) i henhold til produsentens protokoll. Primere sekvenser som brukes i PCR-analysen var som følger: human MGAT3 forover (5′-CAGGGCACAGGATTGAAGAGTT-3 «) og human MGAT3 bakover (5′-AGCTTGGTTTCCCTTCATATTGAG-3»); menneskelig MGAT5 fremover (5’GACCTGCAGTTCCTTCTTCG-3 «) og menneskelig MGAT5 revers (5’CCATGGCAGAAGTCCTGTTT-3′); human glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GADPH) forover (5»-CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3 «) og human GAPDH bakover (5′-TGAGCGATGTGGCTCGGCT-3»). Menneskelig GADPH mRNA serveres som en endogen kontroll for normalisering. Real-time PCR-analyse ble utført i tre eksemplarer.
Plasmider og Gene Overuttrykte
SKOV3-ip og SKOV3 celler ble transfektert ved hjelp av X-tremeGENE HP DNATransfection Reagens (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland ) med pcDNA3.1-MGAT3 eller pcDNA3.1-MGAT5 plasmider, henholdsvis (gitt av en forsker i vårt laboratorium), i henhold til produsentens instruksjoner. Og pcDNA3.1 vektor ble anvendt som negativ kontroll. Ved 48 timer etter transfeksjon ble overekspresjon av MGAT3 og MGAT5 bekreftet av western blot analyse.
Små interfering RNA og knockdown av MGAT3
SKOV3 celler ble transfektert med MGAT3 bestemt siRNA Transfeksjon Reagens Complex, (Santa Cruz Biotech, Inc., sc-44469), som ble fremstilt i henhold til produsentens protokoll. Egge siRNA ble anvendt som den negative kontroll. Ved 48 timer etter transfeksjon, ble cellelysater fremstilt for western blot-analyse for å bestemme gen knockdown effekt.
Western Blot og Lektin blot analyse
For å oppnå en fullcelle-proteiner, ble cellene oppsamlet , vasket med fosfatbufferoppløsning (PBS), og deretter lysert i SDS-lysebuffer [50]. Totalt proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved BCA assay (Pierce, Rockford, IL). Like mengder av totalt protein lysatene fra hver cellelinje ble separert ved 10% natriumdodecylsulfat polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) og deretter overført til PVDF-membraner (Roche Applied Science). jeg. Western blot-analyse: Etter blokkering med 5% skummet melk i Tris-bufret saltvann inneholdende 0,1% Tween 20 (TBST) i 2 timer ved romtemperatur ble membranene inkubert over natten ved 4 ° C med muse-monoklonalt antistoff mot MGAT3 (1/1000 fortynnet, sigma) eller MGAT5 (1/1000 fortynnet, sigma) og deretter et sekundært antistoff ved romtemperatur i 1 time. Etter vasking ble membranene påvist ved forsterket kjemiluminescens (ECL) assay kit. ii. Lektiner blot analyse: Etter blokking med 5% BSA i TBST ble membranene inkubert over natten ved 4 ° C med biotinylert
hagebønne erythroagglutinin product: (E-PHA) (1/5000 utvannet, Vector Labs) eller
hagebønne leucoagglutinin product: (L-PHA) (1/5000 utvannet, Vector Labs). Deretter ble membranene vasket fire ganger med TBST, fulgt av inkubasjon med pepperrot-peroksidase streptavidin (Vector Labs) i 30 minutter ved romtemperatur. Deretter ble membranene vasket fire ganger med TBST og oppdaget av ECL testsettet.
Transwell migrasjon analysen
For å evaluere den vandrende evne, cellemigrasjon ble utført ved hjelp av 24-brønners format Transwell kamre ( 8 um pore-filter, Corning, Canton, New York). Kort sagt ble SKOV3-celler transfektert med MGAT3 spesifikk siRNA eller MGAT5 plasmid, og SKOV3-ip-celler ble transfektert med plasmid MGAT3 i 36 timer, henholdsvis. Deretter ble cellene trypsinert, oppsamlet, telles, og deretter suspendert i serumfritt medium RPMI1640. 2 x 10
4 celler i 100 ul serumfritt RPMI 1640 medium ble flettet til hver pakning av det øvre kammer. I mellomtiden ble 600 ul av RPMI 1640 medium inneholdende 10% FBS tilsatt til hver nedre kammer. Deretter ble cellene inkubert i 12 timer ved 37 ° C. Etter fjerning av cellene på den øvre membranoverflate ble celler på den nedre overflate av membranen fiksert og farget med 0,1% krystallfiolett i 30 min ved romtemperatur. Deretter ble celler som hadde passert gjennom filteret til den nedre kammer talt mikroskopisk i 6 tilfeldige områder per filter. Antallet celler som krysset membranen avslørte den vandrende evne av de testede celler.
Immunohistochemistry Analyse
Hele 24 eggstokkreft vev ble fiksert i 4% formalin og innstøpt i parafin. Vevssnitt ble først utsatt for hematoksylin og eosin (H peak påvisningsmetoden: terskel-25% Tyngdepunktet; terskel offset: 0.500 mV.
m /z
verdier og intensiteter ble eksportert som ASCII-filer og peak intensiteter ble skalert med den høyeste toppen som 100%. Den relative kvantifisering av oppdagede
N
-glycans var i henhold til protokoller tidligere rapportert [42]. Alle statistiske analyser ble utført ved anvendelse av GraphPad Prism (versjon 5). Alle forsøkene ble utført minst tre ganger. Dataene ble uttrykt som middel ± standard feil av gjennomsnittet (SEM). Student «s
t
-test ble anvendt for å bestemme signifikans av forskjeller mellom to grupper. Wilcoxon Signed Ranks Test ble brukt til å sammenligne immunhistokjemi data fra de to gruppene. En
p
-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant.
Resultater
Kvantitativ /Comparative glycomics Analyse av Overstående mellom SKOV3 og SKOV3-ip Cell
å oppdage metastaserelaterte
N
-glycan endring i eggstokkreft celle secretome, den totale pool av
N
-glycan blanding, utgitt av enzymet Peptide
N
-glycosidase F fra secretome blanding av SKOV3 (amid-
15N-Gin merket) og SKOV3-ip-celler (amid-
14N-Gin merket), ble analysert ved MALDI-QIT-TOF MS ( Figur 2). Totalt 17
N
-glycans ble identifisert, inkludert høy mannose, hybrid, triantennary, tetra-antennary strukturer og halverer GlcNAc glycoforms. Alle de identifiserte
N
-glycans med foreslåtte strukturen ble vist i figur 2 og oppsummert i tabell 1.
N
-bundne glykaner fra en 01:01 blanding av SKOV3 -IP (Gin-14 merket) og SKOV3 (Gin-15 merket) supernatant. Strukturene ble tolket manuelt basert på deres
m /z
verdier ifølge flere tidligere publiserte litteraturen [46], [47], GlycoWorkbench [48] samt Glycan Mass Spectral Database [49]. Gin-14 indikerer amid-
14N-Gin; Gin-15 indikerer amid-
15N-Gin. Grønn sirkel indikerer mannose; gul sirkel indikerer galaktose; blå firkant viser
N
-acetylglucosamine; rød trekant indikerer fucose.
Kvantitativ analyse av
N
-glycans fra secretome blanding av SKOV3 og SKOV3-ip-celler var basert på signalintensitet. Intensitetsforhold (SKOV3-ip /SKOV3) med 0,83 og 1,2 ble satt som terskelen for å estimere ned- eller opp-regulering av
N
-glycan nivåer i SKOV3-ip-celler, i forhold til SKOV3 celler siden den maksimale variasjonskoeffisienten (CV) (n = 9) var under 20% i denne studien [43]. Relativ kvantifisering av all oppdaget
N
-glycans mellom SKOV3-ip og SKOV3 celler ble oppsummert i tabell 1. Resultatene viste at tre av fire høye mannose strukturer var oppregulert i SKOV3-ip celler.
N
-glycans inneholder hybrid, triantennary, og tetra-antennary strukturer med eller uten fucose ble forhøyet i SKOV3-ip celler. Den tilsvarende trend ble observert i tre glykaner med komplekse dobbeltantenneformede strukturer. Blant all endring i
N
-glycans, all den
N
-glycans med halverer GlcNAc ble funnet å være tilsynelatende redusert i de SKOV3-ip-celler, med sine SKOV3-IP /SKOV3 forholdstall spenner 0,73 til 0,12, mens alle β-1,6 GlcNAc-forgrenet
N
-glycans ble forhøyet i SKOV3-ip celler. Blant disse endrede
N
-glycans fokuserte vi på
N
-glycans med halverer GlcNAc, delvis fordi alle av dem sank og de var de mest åpenbart endret
N
-glycans. Videre har en økende mengde bevis som indikerte at de halverer glykaner kan påvirke tumorprogresjon og metastase [52] .De strukturer som inneholder Halvere GlcNAc ble ytterligere bekreftet ved tandem massespektrometri (MS /MS). Representant tandem MS spektra av
m /z
2012,7 [M + Na]
+, og
m /z
2377,8 [M + Na]
+ ble vist i figurene S1A -B.
det er bemerkelsesverdig at sialinsyrer, typisk presentert som terminale monosakkarider i sukkerdelen av mange glykoproteiner, spiller viktige roller i mange fysiologiske og patologiske prosesser. Sialyserte glykaner er labile og lett å bli tapt under direkte massespektrometrisk analyse av underivatized
N
-glycans. Som permethylation kan stabilisere sialsyreresiduer ved å konvertere svært polar OH og COO
– grupper av de forskjellige monosakkarider i upolare [38],
N
-glycans etter permethylation ble også analysert. Resultatene viste at flere
N
-glycans med ulik sialyseringsgrad ble observert sammenligne analyseresultatene uten permethylation. Selv signal fra en
N
-glycan med halverer GlcNAc kan desentraliseres til flere signaler om
N
-glycans med ulik sialyseringsgrad, utviklingen av endring i alle de halverer GlcNAc strukturer var samme uansett permethylated eller ikke (se fig S2). Signalet intensiteten av halverer
N
-glycan uten permethylation (figur S2A,
m /z
2012,6 for eksempel) var høyere enn for permethylated
N
-glycans på
m /z
2489,4,
m /z
2850,3 og
m /z
3211,4 inneholder 0, 1 og 2 sialinsyrer henholdsvis (figur S2B). Det er muligens fordi en del av det opprinnelige Halvere signalintensitet (figur S2A) ble bidratt til de tilsvarende fragmenter av glykaner med samme struktur, skjønt det inneholder ytterligere 1 og 2 sialinsyrer (fig S2B). Videre, ved sukker profiler med permethylation var mer kompleks (dvs. ha flere topper). Derved er det foreslått at det permethylation trinnet sannsynligvis kunne utelates i kvantitativt glycomics analyse av de nøytrale
N
-glycans som er irrelative for sialinsyrer, slik som halverer GlcNAc glykoformpopulasjon i denne studien.
Differensial Expression of MGAT3 i SKOV3-ip og SKOV3 cellelinjer
Som halverer GlcNAc resten ble syntetisert ved spesifikk glycosytransferase (MGAT3), endring i
N
-glycans med halverer GlcNAc kan være korrelert med tilsvarende endring i MGAT3. Derfor, real-time PCR-analyse ble utført for å sammenligne mRNA uttrykk nivåer av MGAT3 mellom SKOV3 og SKOV3-ip cellelinjer. Resultatene viste at MGAT3 ble uttrykt forskjellig mellom de to cellelinjer. MRNA nivået av MGAT3 var signifikant høyere i SKOV3-celler enn det som i SKOV3-ip-celler (61-fold,
p
0,001, figur 3A). Deretter ekspresjonen av MGAT3 i disse to cellelinjer ble videre undersøkt på proteinnivå ved western blot-analyse. Den nedre overflod av MGAT3 ble observert for SKOV3-ip-celler i motsetning til SKOV3-celler (Figur 3B). Derfor, redusert MGAT3 ekspresjon i både mRNA og proteinnivåene i SKOV3-ip-celler var i overensstemmelse med redusert Halvere GluNAc endring i SKOV3-ip cellesupernatant manifestert ved hjelp av kvantitativ analyse glycomics.
(A) mRNA-ekspresjonsnivåer av MGAT3 i SKOV3-ip og SKOV3 cellelinjer. De mRNA nivåer av MGAT3 ble normalisert med GAPDH nivåer. Mener fold endringer ble beregnet med to
-ΔΔCt metode. (B) Et protein uttrykk nivåer av MGAT3 i SKOV3-ip og SKOV3 cellelinjer. Cellelysater ble isolert med 10% SDS-PAGE for western blotting ved hjelp av antistoff mot MGAT3. Menneskelig beta-aktin fungert som en endogen kontroll. 293T cellelinje ble anvendt som positiv kontroll. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Hver analyse ble utført minst tre ganger. En
p
-verdi på mindre enn 0,05 indikerer statistisk signifikans ved hjelp av Student
t
-test.
Effekter av MGAT3 på Migration Mulighet for eggstokkreft celler
dataene ovenfor viste at nivåene av MGAT3 og dens catalysate,
N
-glycans inneholder Halvere GlcNAc, var signifikant lavere i SKOV3-ip celler sammenlignet med det i SKOV3 celler. Siden SKOV3-ip-celler er de svært metastatiske derivater av SKOV3 celler, disse resultatene antydet en mulig rolle MGAT3 og dens catalysate, halverer glykaner, på eggstokkreft cellemotilitet. For å teste dette, ble MGAT3 genet overexpressed i SKOV3-ip celler ved transfeksjon. Western blot analyse viste en betydelig økning i MGAT3 uttrykk etter transfeksjon, sammenlignet med SKOV3-ip-kontroll-celler (figur 4A). Nivået av halverer glykaner ble også forhøyet tilsvarende (figur 4B). For å bekrefte om overekspresjon av MGAT3 påvirke migrasjon evne, ble trans-brønn migrasjon analyser utført. Som vist på figur 4C og 4D, migrasjon evne i MGAT3 transfekterte celler ble signifikant redusert til 52% av det som i kontrollceller. I mellomtiden, knockdown av MGAT3 i SKOV3 celler ble utført av MGAT3 målretting siRNA transfeksjon. Western blot analyse viste effektiv nedtrykking av MGAT3 ekspresjon i SKOV3 etter transfeksjon (figur 5A). Nivået på halverer glykaner ble nedregulert tilsvarende (Figur 5B).
