Abstract
Det er ikke molekylære målrettede måter å behandle småcellet lungekreft (SCLC) lik de som brukes med hell mot ikke- småcellet lungekreft. Denne feilen skyldes vår manglende evne til å identifisere klinisk relevante undergrupper av denne sykdommen. Dermed er en mer systematisk tilnærming til medisiner for SCLC nødvendig. I denne forbindelse, to omfattende studier nylig publisert i
Nature, etter Kreftcellelinje Encyclopedia og Kreft Genome Project, gir et vell av data om stoffet følsomhet og genomiske profiler av mange forskjellige typer kreftceller. I denne studien har vi utvunnet disse to studier for nye terapeutiske midler for SCLC og identifiserte varmesjokkproteiner, cyclin-avhengige kinaser og polo-lignende kinaser (Plk) som attraktive molekylære mål med lite strøm klinisk studie aktivitet i SCLC. Bemerkelsesverdig, våre analyser viste at de fleste SCLC cellelinjer gruppert i én dominerende undergruppe av enten genekspresjon eller CNV analyser, som fører oss til å ta en farmakogenetiske tilnærming for å identifisere subgrupper av narkotika-sensitive SCLC celler. Ved hjelp av PLK-inhibitorer som et eksempel, vi identifisert og validert et gen signatur for medikamentsensitivitet i SCLC-cellelinjer. Dette genet signaturen kan skille subpopulasjoner blant menneske SCLC svulster, noe som tyder på dens potensial klinisk nytte. Til slutt ble circos tomter konstruert for å gi et helhetlig syn på hvordan transkripsjonen, kopiantall og mutasjons elementene påvirker PLK følsomhet i SCLC cellelinjer. Tatt sammen, skisserer denne studien en tilnærming til å forutsi narkotika følsomhet i SCLC til nye målrettede behandlingsformer
Citation. Wildey G, Chen Y, Lent jeg, Stetson L, Pink J, Barnholtz-Sloan JS, et al. (2014) farmakogenetiske tilnærming for å identifisere Drug følsomhet i Small-småcellet lungekreft. PLoS ONE ni (9): e106784. doi: 10,1371 /journal.pone.0106784
Redaktør: Gagan Deep, University of Colorado Denver, USA
mottatt: 28. mai 2014; Godkjent: 31 juli 2014; Publisert: 08.09.2014
Copyright: © 2014 Wildey et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Støttet av tilskudd fra universitetssykehusene Seidman Cancer Center og National Cancer Institute U01 CA062502 (GW, AD), det translasjonell forskning Kjerne Facility (IL , JP) og den Biostatistics Bioinformatikk Kjerne Facility (YC, JSB-S) av saken Comprehensive Cancer Center (National Cancer Institute P30 CA043703), og National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (LS). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Småcellet lungekreft (SCLC) representerer 15% av alle lungekarsinom og er vanligvis diagnostisert når sykdommen har spredning [1], [2]. Dessverre har det vært bare mindre forbedringer i standard vare for SCLC i løpet av de siste tre tiårene [3] – [5]. Det er for tiden ingen molekylære målrettede metoder for å behandle SCLC tilsvarende de som brukes med hell mot ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), slik som erlotinib målretting av mutant EGFR eller crizotinib målretting av EML4-ALK-fusjonsproteiner [6], [7] . Kirurgi er sjelden utført i denne sykdommen (bare 1% av tilfellene), å begrense tilgjengeligheten av tumorvevet for omfattende genomiske analyser. Videre har de to forutgående genomikk studier nylig publisert på SCLC gitt litt terapeutisk innsikt i denne sykdommen, og har i hovedsak analysert den sjeldne formen for SCLC kan opereres, som ikke representerer den klassiske, mye metastatisk SCLC sett i hverdagen klinisk praksis [8] [9].
En annen tilnærming til medisiner for SCLC er nødvendig og kan ligge i gruve tilgjengelige databaser på stoffet følsomhet av SCLC cellelinjer. Det er, som de fleste SCLC-celler er avledet fra metastaser eller pleural effusjon, kan de være representativ for omfattende sykdom SCLC og de tilhørende medikamentsårbarheter. I denne forbindelse, to omfattende narkotika screening studier nylig publisert i
Nature, etter Kreftcellelinje Encyclopedia (CCLE) [10] og Kreft Genome Project (CGP) [11], undersøkte stoffet følsomhet for kreft cellelinjer, inkludert lunge, og forsøkte å knytte disse til genomisk profiler. De genomiske profiler inkludert DNA-mutasjonsstatus, genekspresjon og kopiere nummer variasjon (CNV) data.
I denne studien har vi spesielt hentet ut data om SCLC cellelinjer fra disse to studiene og skissere en bioinformatiske tilnærming for å identifisere nye behandlingsformer for SCLC hjelp polo-lignende kinase (PLK) hemmere som et eksempel.
Resultater
i første omgang forsøkte vi en global oversikt over SCLC narkotika følsomhet i CCLE [10] og CGP [11 ] studier. Det var 53 og 31 SCLC-cellelinjene som ble testet for veksthemming etter 24 og 92 legemidler i disse studiene. Resultatene er vist i figur 1 (CGP) og S1 (CCLE) som boksplott. En tabell over de numeriske data for narkotika effektivitet samt uteliggeren cellelinjer, er også gitt i tabell S1 (CGP) og S2 (CCLE). Dette grafisk analyse mulig for oss å identifisere stoffer som var grovt effektiv mot de fleste SCLC celler. Vi definerte «effektive» rusmidler som de som induserer veksthemming i de fleste celler ved lave doser (median IC
50≤1 mm), representert ved paclitaxel. «Ineffektiv» stoffer, representert ved erlotinib og sunitinib, ga ingen veksthemning i de fleste SCLC-celler (IC
50≥8 um), selv om «uteliggere» kan være til stede. Selektiv narkotika, representert ved rapamycin, demonstrerte en lang boksplott og kan betraktes som effektive for bare en undergruppe av SCLC cellelinjer.
Det er 31 cellelinjer for småcellet lungekreft. De boksplott viser stoffene oppført på x-aksen og de tilsvarende IC
50 verdier (i mikrometer) notert på y-aksen. Den «tak» for narkotika effekt ble satt til 8 mikrometer; Hvis IC
50 av alle testede celler var over denne konsentrasjon en enkelt linje ville se ut ved toppen av diagrammet. Dette representerer en ineffektiv medikament. I motsetning til dette, hvis alle testede celler som var følsomme for et gitt medikament, ville en smal boks og whisker plott vises nederst i diagrammet. Linjen innenfor enkelte bokser representerer median IC
50 verdien av alle testede celler og sirklene representerer «uteligger» celler som IC
50 verdiene ikke faller innenfor 25-75% kvantil av alle IC
50 verdier målt for at narkotika (representert av boksen)
som vist i tabell 1, narkotika klassifisert som «effektiv» for de fleste SCLC celler inkluderer CGP-60474, en CDK-hemmer.; BI-2536 og GW-843682X, begge Plk hemmere; bortezomib, en proteasominhibitor; og elesclomol, en HSP70 inhibitor. I tillegg er flere legemidler rettet mot PI3K-AKT-mTOR sti faller innenfor denne kategorien, inkludert A-443654, temsirolimus og NVP-BEZ235. To legemidler med en median IC
50 like utenfor 1fiM inkluderer AZD-7762, en CHK inhibitor; og JW-7-52-1, en mTOR-hemmer. HSP90 (17-AAG) og HDAC (panobinostat) hemmere kan også representere «effektive» narkotika, selv om deres effekt varierte mellom de to undersøkelsene. «Effektive «narkotika sannsynlig bære den beste translasjonell potensial.
Gene rekke data har blitt brukt mye i kreftforskning å identifisere uttrykket» signaturer «som kan være enten prognostisk eller prediktiv for svulst atferd. Derfor, undersøkte vi om genekspresjon gruppering kunne brukes til å identifisere subgrupper av medikamentsensitive SCLC-cellelinjer, spesielt for medikamenter som viste et bredt effektområde mot SCLC-celler i figur 1. Vi brukte data fra CGP undersøkelsen fordi den inneholdt den største mengden av medikament følsomhets data. Unsupervised konsensus gruppering av genekspresjon data viste at tre klynger av SCLC-celler var optimal (figur 2). Det var 1006 betydelige gener som definerte genuttrykk undergrupper (Kruskal-Wallis test p-verdi. 0,05, oppført i tabell S3 Vi visualisert da effekten av genekspresjon clustering på legemidlets effekt ved hjelp av en mosaikk plott (figur 3). denne tomten vi brukte en fargeskala som deles narkotika følsomhet inn i seks grupper. narkotika, notert på y-aksen, ble gruppert sammen i henhold til målet molekyler. Cells, som er notert på x-aksen, ble gruppert med samme rekkefølge som den som oppnås av unsupervised clustering av deres genuttrykk. Det synes ikke å være noen sammenheng med narkotika følsomhet for genekspresjon clustering, men som narkotika følsomhet syntes å være tilfeldig fordelt over alle cellelinjer for en gitt narkotika. Dette grafisk analyse gjorde markere flere målrettet midler med eksepsjonelt bred virkning mot SCLC-cellelinjer. Disse stoffene er inkludert bortezomib, BI-2536 og GW-843682X, samt HSP inhibitor elesclomol og CDK-inhibitor CGP-60474, om enn med lavere effekt. Disse stoffene er identiske med de som er uthevet i tabell 1.
Unsupervised konsensus clustering ble utført ved hjelp av alle 31 cellelinjer (bare 27 hadde genuttrykk data tilgjengelig, tre av dem er duplikater og gjennomsnittsverdiene ble oppnådd for videre analyse ) og viste at 3 klynger var optimal for dette datasettet. Med denne oppgave, ikke-parametrisk ANOVA en måte (Kruskal-Wallis test p-verdi 0,05) ble utført på disse 3 klynger og 1006 vesentlige gener ble oppnådd. Heatmap ble generert med disse viktige gener.
Drug følsomhet var fargekodet i henhold til forklaringen nederst. Legemidler som er gruppert langs y-aksen i henhold til deres målmolekyl. Cellene er anordnet langs x-aksen identisk med deres genekspresjon clustering identifisert i figur 2.
neste bestemmes om CNV gruppering kunne brukes til å identifisere subgrupper av medikamentsensitive SCLC-cellelinjer. Tre klynger igjen ble identifisert ved hjelp av alle 426 forhørt gener (figur 4); men det synes ikke å være noen sammenheng mellom genuttrykk og CNV clustering. Omorganisering av mosaikk plottet i figur 3 av CNV clustering heller ikke avdekket noen åpenbare sammenhenger (Figur S2). Samlet utgjør disse resultatene viser at narkotika-sensitive SCLC celler ikke klynge i undergrupper av enten genekspresjon eller CNV. Vi har derfor besluttet å bruke en farmakogenetiske tilnærming til karakter undergrupper av SCLC celler.
Unsupervised konsensus clustering ble utført ved hjelp av alle 30 cellelinjer med 426 gen kopiantall, og 3 klynger ble vist å være optimal for dette datasettet. Alle disse 426-gener ble anvendt til å generere heatmap. CNV data ble re-kodet etter følgende regel: 0-fullstendig tap; 1-delvis tap; 2-no endring; 3~7-delvis gevinst; større eller lik 8-komplett gevinst.
Våre analyser identifiserte PLK hemming å ha lovende effekt og lite klinisk studie aktivitet i SCLC. Derfor brukte vi PLK hemming som et eksempel på hvordan du bruker CGP datasett for å utvikle en genomisk profil SCLC narkotika følsomhet. Først forsøkte vi å validere effekten av Plk hemmere i SCLC. I disse validerings eksperimentene benyttet vi SCLC-cellelinjer, så vel som inhibitorer, som var forskjellige fra de som benyttes i de opprinnelige studier for å fremheve effekten av disse nye terapeutiske midler. De SCLC cellelinjer som ble brukt var H1048, H1688, SW1271 og DMS454. Plk hemmere inkludert BI-6727 (volasertib) og ON-01910 (rigosertib). I disse eksperimentene irinotecan fungert som en positiv kontroll mens erlotinib fungert som en negativ kontroll. Resultatene er vist i figur 5. Det er klart at IC
50 verdier for de PLK-inhibitorer i de fleste cellelinjer er mellom 10-100 nM, som støtter vår hypotese at SCLC-celler er stort sett følsomme for PLK-inhibitorer.
Adherente celler ble inkubert med de angitte konsentrasjoner av legemidler for 24 timer. Cellekulturmediet ble erstattet og cellenes levedyktighet ble målt ved hjelp av en DNA-analyse etter 48 timers inkubering. Hver medikament-konsentrasjon ble analysert anvendelse av fem replikater. Resultatene er representative for minst 2 forsøk.
I utgangspunktet vi søkt å identifisere et gen signatur som kan forutsi følsomheten til Plk hemmere i pasient kohorter, som ikke alle SCLC celler demonstrerte lik sensitivitet. Vi sammenlignet genuttrykk data for de fem mest sensitive SCLC celler (H82, H446, H526, COR L88, IST SL1) med at for de fem minst sensitive SCLC cellelinjer (DMS114, H64, DMS79, H2171, IST SL2); som definert i CGP av sine BI-2536 IC
50 verdier. Vi identifiserte en liste over 185 gener som var signifikant forskjellig uttrykt mellom disse to gruppene (oppført i tabell S4). Disse 185 gener ble anvendt til å utføre uten tilsyn gruppering av alle de SCLC-cellelinjer, noe som resulterer i heatmap vist i figur 6. Spesielt, de fem minst (grønn-top-boks), og de fleste (rød-top-boks) sensitive cellelinjer som smyger seg på motsatte sider av heatmap mens alle de andre cellene (gule bokser som indikerer middels følsomhet og grå bokser indikerer ukjent følsomhet) gruppert i midten. Vi neste utførte leave-one-out analyse av PLK gensignaturen med de 26 tilgjengelige cellelinjer. Fra denne analysen vi genererte 26 heatmaps, hvor i hvert Heatmap de følsomme og resistente celler forble klynget sammen, unntatt i tre heatmaps; hvor ett eller to følsomme cellelinjer ble feilklassifisert. Resistente celler alltid gruppert sammen. Derfor tror vi at dette PLK genet signatur er robust i kategorisere sensitive og resistente SCLC cellelinjer.
De fem SCLC cellelinjer som viser den mest (H2171, H64, IST-SL2, DMS-114, DMS-79 ) og minst (IST-SL1, COR-L88, H526, H446, H82) motstand mot PLK inhibitor BI-2536 i CGP studien ble brukt som standard for å identifisere et gen signatur for PLK følsomhet. Alle SCLC-cellelinjer i CGP studien som inneholdt genekspresjonsdata ble deretter utsatt for gruppering uten tilsyn. Heatmap viser resultatet av denne analysen. De fargede boksene på toppen av heatmap indikere CGP BI-2536 følsomhet. Grønn = motstandsdyktig celle, rød = sensitiv celle, gul = celle i middels, men kjent, følsomhet, grå = celle i utestet sensitivitet, men med genuttrykk data.
For å bekrefte at PLK gensignaturen gjør faktisk forutsi følsomheten til PLK-inhibitorer, bestemt vi effekten av PLK inhibitor BI-6727 i en cellelinje H1092, som hadde genuttrykk data, men ingen PLK følsomhet data i CGP studien, representert ved en grå boks i toppen av figur 6. Som kontroller, vi brukte en resistent cellelinje, DMS79 (grønn boks), og to følsomme cellelinjer, H82 og H526 (røde boksene). Disse celler ble valgt fordi de alle vokste i suspensjon og kan bli utsatt for identiske behandlingsprotokoller. Resultatene, vist i figur 7, viste at H82 og H526-celler var følsomme for den PLK inhibitoren BI-6727, mens DMS79 celler ikke var det, i likhet med de resultatene som er rapportert for BI-2536. Videre er det vist at H1092 celler, med ukjent PLK følsomhet, var for det meste resistente mot BI-6727 som DMS79 celler, som forutsagt ved heatmap.
suspensjonsceller ble kontinuerlig inkubert med de angitte konsentrasjoner av legemidler for 72 h, når cellenes levedyktighet ble målt ved hjelp av MTS-analysen. Hver medikament-konsentrasjon ble analysert anvendelse av fem replikater. Resultatene er representative for 2 forsøk.
Det var av interesse å finne ut om PLK gensignaturen var til stede i pasient svulster og kan potensielt brukes til å forutsi tumor følsomhet for Plk hemmere. Den største Studiet av SCLC tumor genekspresjon er det av Rudin et al. [8], som analyserte 30 primære svulster ved RNAseq. Vi har derfor hentet telledata for 185 prober stede i vår PLK signatur (som representerer 173 gener, bare 169 gener ble funnet og brukt fra Rudin settet) og standard normalisert å skape surrogat PLK genuttrykk arrays for disse svulstene. Denne normaliserte data ble deretter underkastet uten tilsyn gruppering for å generere den varmekart er vist i figur 8. Vi har også inkludert i denne analysen H82 SCLC-cellelinje som hadde RNAseq data fra undersøkelsen Rudin og er også godkjent av oss i figur 7 som er følsom overfor den PLK inhibitor BI-6727. Resultatene viser to viktige punkter: For det første, kan undertyper av SCLC svulster identifiseres ved hjelp av PLK genet signatur, og andre, de H82 celle linje gruppert blant en undergruppe av åtte primære svulster. Tatt sammen tyder disse resultater på at PLK-genet signaturen generert ved hjelp av SCLC-cellelinjedata kan være nyttig for å forutsi følsomheten av spesifikke tumorer til PLK-inhibitorer.
RNAseq data fra Rudin et al. [8] ble forvandlet til å telle data. Data for gener som utgjorde PLK genuttrykk signatur ble trukket ut og brukes i unsupervised konsensus clustering av SCLC svulster og H82 cellelinje. Den rød boks på toppen av heatmap indikerer plasseringen av H82 cellelinje, som var en CGP cellelinje validert som PLK sensitive.
Til slutt, vi brukte circos tomter [12], vist kondenseres i figur 9 og full-risset i figur S3, for å visualisere de genomiske forskjellene mellom SCLC-cellelinjer sensitive og resistente til PLK inhibitoren BI-2536. Bemerkelsesverdig, circos tomter demonstrere at alle resistente celler besatt nonsense eller rammeskifte mutasjoner i enten
TP53
eller
RB1
, og noen ganger begge gener, mens alle sensitive celler vises mutasjoner av ukjent protein betydning (intronic og missense), vanligvis i bare en av disse genene. Alle bortsett fra ett av de genmutasjoner var homozygot, noe som indikerer at resistente celler sannsynligvis ikke ha noen funksjonell RB1 eller TP53 protein. Alle sensitive celler vise
MYC plakater (H82, H446),
MYCN
(H526, IST SL1) eller
MYCL plakater (CORL88) forsterkning, mens bare en resistente cellelinje skjermer
MYC
forsterkning (H2171). Det synes også å være liten eller ingen CNV på X-kromosomet i sensitive celler i forhold til resistente celler, som typisk viser noen CNV tap. Gener på kromosom 13 er generelt oppregulert i PLK sensitive celler og nedregulert i PLK-resistente celler, mens gener som befinner seg på kromosom 19 er generelt nedregulert i PLK sensitive celler og oppregulert i PLK-resistente celler. Samlet utgjør disse resultatene tyder på at genuttrykk, CNV og mutasjonsstatus kan alle bidra til følsomheten av SCLC celler til Plk hemming.
Circos plott vises (fra venstre til høyre, i oppført rekkefølge) for de fem mest sensitive (H82, H446, H526, COR-L88, IST-SL1) og mest motstandsdyktige (DMS-114, H64, DMS-79, H2171, IST-SL2) SCLC celler til BI-2536 veksthemming, som definert i CGP studere. Den ytre svart ring betegner kromosomet sted; neste indre ring indikerer uttrykk nivå Plk signatur gener; og den innerste ringen indikerer CNV. CNV data ble re-kodet etter følgende regel: 0 fullstendig tap; En delvis tap; 2 ingen endring; 3~7 delvis gevinst; større enn eller lik 8 fullstendig vinning. I sentrum er det mutasjonsstatus av gener (åpen trekant: intronic SNP, svart sirkel: missense SNP, svart firkant: tull SNP, rød trekant: frame-shift innsetting, grønn trekant: frame-shift sletting). Alle mutasjoner var homozygot med unntak av rammen-shift innsetting.
Diskusjoner
Små-celle lunge kreft er en sykdom i akutt behov for nye narkotika terapi. Dessverre, den begrensede tilgjengeligheten av svulstvev hindrer oppkjøp av komplette genomiske analyser som kreves for identifisering og validering av nye drugable mål i denne kreftformen. Dermed alternative legemiddel strategier må utvikles til vår forståelse av genomikk kjøre SCLC kan begynne å tilnærme at av NSCLC, som drar nytte av omfattende analyser av store årskull av pasient svulster, som for eksempel Kreft Genome Atlas (TCGA).
i denne rapporten har vi tatt en bioinformatiske tilnærming til medisiner for SCLC av data mining to store narkotika screening studier i dyrkede cellelinjer, CCLE [10] og CGP [11]. Som et modellsystem, SCLC-cellelinjer beholde genmutasjon profiler (COSMIC) og kopitall endrer [13], [14] lik human SCLC. Derfor har vi hentet og analysert datasett for SCLC cellelinjer for å identifisere legemiddel sensitiviteter spesifikke for denne sykdommen, da dette ikke var intensjonen av de opprinnelige studiene, som var å samle data på tvers av en rekke cellelinjer for å identifisere genomisk determinanter av narkotika følsomhet. Vi identifiserte polo-lignende kinaser som attraktive molekylære mål med lite strøm erfaring fra kliniske studier i SCLC. Veksthemming av Plk hemmere ble validert i vår studie, adressering bekymringer reist i en fersk rapport om inkonsekvens i narkotika respons data i store narkotika screening studier [15]. Translasjonsforskning potensialet Plk hemmere i behandling av SCLC er støttet av vår demonstrasjon at stoffet følsomhet profil av SCLC cellelinjer gjenspeiler hva som er observert klinisk for metastatisk SCLC svulster [16]. Det vil si, de fleste cellene var ekstremt følsomme for topoisomerase og mikrotubulidynamikk hemmere, kjemoterapeutika som har aktivitet mot cellegift naive SCLC; I motsetning til mange tyrosin kinase inhibitorer var ineffektive.
CGP studium også identifisert stoffet sensitiviteter som hadde en tendens til å klynge på tvers av alle cellelinjer (se vedlegg tabell 1 i referanse 11) og medikamentfølsomhetsprofilen for SCLC-celler, så vist i tabell 1, er svært lik klynge 4 av CGP studien [klynge 4 = GW-843682X (PLK1), BI-2536 (PLK1 /2/3), A-443 654 (akt1 /2/3), epotilon B (mikrotubuli), CGP-60474 (CDK1 /2/5 /7/9), Paclitaxel (mikrotubuli) og MS-275 (HDAC)]. Selv om det er for tiden uklart om disse medikament klyngene indikerer en felles målrettet svei (er) som fører til veksthemming, kan disse klyngene tilveiebringe en praktisk utgangspunkt for å teste kombinatoriske medikamentterapier for synergistisk aktivitet i SCLC. Faktisk viser vår egen foreløpige data synergisme mellom Plk og CDK-hemmere.
Vi har utviklet en svært integrert analyse av PLK følsomhet i SCLC cellelinjer, grafisk avbildet i figur 9 som circos tomter, som inkorporerer genekspresjon, CNV og genmutasjon data. En analyse av denne dybden har aldri tidligere blitt brukt til SCLC, og viser hva som kan oppnås avhøre en enkelt celle avstamning og narkotika klasse i CCLE og CGP datasett. Videre vårt funn at den PLK genet signatur for SCLC-cellelinjer ble dispergert blant SCLC tumorprøve ekspresjonsprofiler (figur 8) viser klart at disse cellene beholde tumor fenotyper. Funksjoner i circos tomter som den doble mutasjon av begge
TP53 Hotell og
RB1
i PLK resistente celler, samt gjensidig uttrykk for Plk signatur gener på kromosom 13 og 19, er lett tydelig og må undersøkes i større kohorter å bestemme deres individuelle bidrag til den samlede PLK inhibitor følsomhet. Til sammen denne typen analyser kan bidra til å identifisere oppstrøms genomisk hendelser som korrelerer med nedstrøms fenotyper som PLK følsomhet.
Det ble nylig rapportert at mutasjoner i
PLK1
genet i seg selv var hovedansvarlig for ervervet resistens mot BI2536 i et kultivert menneske tykktarmskreft cellelinje [17]. Dette er lite sannsynlig å være en motstand mekanisme i SCLC cellelinjer fordi de CCLE lister bare fire cellelinjer med et enkelt
PLK
mutasjon hos alle fire PLK familiemedlemmer (PLK1-4) og 53 SCLC cellelinjer undersøkt. Ingen av disse PLK muterte cellelinjer ble inkludert i studien. Vår PLK gen signatur gjør imidlertid omfatte gener på kromosomene vanligvis slettet (4Q, 13q) og forsterket (19p) i SCLC [9], [13], [14], selv om våre circos tomter indikerer ingen åpenbar sammenheng mellom de to. Interessant, kromosom Xq, som vanligvis ikke sett på som et viktig område av CNV i SCLC, var hjemmet til flere av de mest betydningsfulle differensielt-uttrykte gener som utgjør PLK genet signatur alle var medlemmer av MAGE-A, eller melanoma- assosiert antigen-A, underfamilie. Denne underfamilie av gener er lokalisert på kromosom Xq28 og blir bare uttrykt i testis kjønnsceller og tumorceller [18]. Selv om deres biologiske funksjon er uklar, de representerer en klasse av tumorantigener som blir aktivt undersøkt som et mål for immunterapi [19], [20]. Mage-A gener ble oppregulert i Plk-sensitive cellelinjer i forhold til Plk-insensitive cellelinjer. Videre kan disse uttrykk mønstre korrelerer med CNV, som sensitive celler vist liten CNV på kromosom X, mens det mest resistente celler demonstrerte noen CNV tap. Vi tester for tiden viktigheten av dette genet familien som en biomarkør for PLK følsomhet.
Under vår studie en rapport fra Sos et al. [21] ble publisert i PNAS som spesifikt undersøkte bare SCLC cellelinjer (44 total) for narkotika følsomhet. Av de 267 testede forbindelsene i denne studien, ble bare 13 også undersøkt i CCLE og /eller CGP studier. Interessant, da Sos et al. så for narkotika følsomhet spesielt i
MYC
-amplified cellelinjer, de også fant PLK inhibitor BI-2536 til å være aktiv, i likhet med våre resultater, men ikke forfølge det videre. De viste også at flertallet av cellene følsomme for Aurora kinase inhibitor VX-680 demonstrerte
MYC
-amplification. Interessant, CGP også inkludert to Aurora kinase hemmere (VX-680 og ZM-447439) i sin studie; Men det gjorde ikke finne noen betydelig gruppering av PLK med Aurora kinase hemmere, som indikerer ingen sammenheng mellom disse to klassene av hemmere når analysert i den generelle befolkningen av kreft cellelinjer.
I denne studien vi konsekvent identifisert tre subtyper av SCLC cellelinjer som bruker uten tilsyn clustering av enten genekspresjon eller CNV datasett fra CGP eller CCLE (figur S4 og Tabell S3) studier. Bemerkelsesverdig var det liten overensstemmelse mellom disse to analysene, bortsett fra at et stort flertall av celler som smyger seg inn i en dominerende undertype, mens de gjenværende cellene fordelt ujevnt mellom to mindre subtyper. Genekspresjon og CNV subtyper heller ikke på linje med medikamentsensitivitet generelt (se figurene 3 og S2) eller PLK følsomhet spesielt. Dette tyder på at en omfattende genomics tilnærming, slik som circos tomten analyse, er nødvendig for å identifisere kritiske faktorer som bestemmer narkotika følsomhet og andre fenotyper i SCLC. Denne integrerte tilnærmingen kan bidra til å velge SCLC pasienter som vil dra mest nytte monoterapi bruk av legemidler som HDAC [22] og PLK [23] hemmere blir om lag effektiv tvers SCLC cellelinjene, men viser begrenset aktivitet i kliniske studier.
Andre unike tilnærminger har blitt tatt for å identifisere nye og effektive behandlingsformer for SCLC. Jahchan et al. funnet en overraskende sensitivitet på SCLC-celler til trisykliske antidepressiva i et medikament reposisjonering studie, som brukes bioinformatikk for å finne medikamenter som induserte endringer i genekspresjon motsatt av genekspresjon profilen av SCLC-celler [24]. Omvendt-fase protein arrays (RPPA) ble brukt til å identifisere PARP1 og EZH2 som potensielle terapeutiske mål i SCLC [25]. Til syvende og sist er det et behov for å avdekke den underliggende biologi av SCLC hvis vi håper å gjøre noen forbedringer i behandlingen av denne sykdommen i likhet med NSCLC. Dessverre har bare omtrent femti SCLC svulster gått omfattende genomisk analyse til dato de fleste er fra primær, tidlig stadium sykdommen [8], [9]. Derfor vil umiddelbar terapeutisk fremgang på dette feltet er avhengig av funn i modellsystemer, som for eksempel en skissert her, etterfulgt av validering i pasient kohorter.
Materialer og metoder
Cellekultur og veksthemming studier
Alle celler ble oppnådd fra ATCC og dyrket i sin anbefalte medium. Celleproliferasjon ble bestemt kvantitativt ved fluorescerende DNA-analyse [26] for heftende celler eller MTS analysen bruker CellTiter 96 vandige løsning Cell Proliferation Assay Kit fra Promega Corp. (Fitchburg, WI) for suspensjonsceller. Celler ble tilsatt til en 96-brønners plate i 100 pl komplett medium. Medikamentholdige medium ble tilsatt i de angitte konsentrasjoner av en dag etter utsåing. Irinotecan ble hentet fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), mens alle andre legemidler ble hentet fra Selleck Chemicals (Houston, TX). Etter inkubasjon i tre dager ved 37 ° C, ble analysen utført i henhold til produsentens instruksjoner. For DNA-analysen, ble fluorescensen målt ved bruk av 355/460 nm eksitasjon /emisjonsfiltre mens absorbansen for MTS-analysen ble målt ved 490 nm. Begge analyser ble målt med en 96-brønners plateleser. Hver eksperimentell tilstand ble analysert ved hjelp fem paralleller. Medikamentinneholdende medium ble fjernet fra adherente celler etter 24 timers inkubering og erstattet med 100 pl komplett medium, mens suspensjonsceller ble dyrket i kontinuerlig nærvær av medikament i 72 timer.
Datasett
den offentlig tilgjengelig CCLE og CGP narkotika følsomhet (IC
50), genekspresjon, CNV, og mutasjon data ble lastet ned fra https://broadinstitute.org/ccle (CCLE) og https://cancerrxgene.org (CGP) [10], [11]. De RNAseq data innhentet i studien ved Rudin et al. [8] ble lastet ned fra den europeiske Genome database. Alle data manipulasjon og statistiske analyser ble utført ved hjelp av SAS versjon 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC) eller R 2.15.3 (https://www.r-project.org/).
IC
50 dataanalyse
For SCLC eneste, 24 legemidler og 53 cellelinjer ble inkludert i CCLE, mens 92 medikamenter og 31 cellelinjer ble inkludert i CGP. Alt IC
50 større enn 8 uM i CGP ble terskel ved 8 pM. Boksplott ble trukket for IC
50 fra de to datasettene henholdsvis ved hjelp av R (https://www.r-project.org/). Mosaikk tomter ble trukket ved hjelp av proc sgrender i SAS versjon 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC).
genuttrykket dataanalyse
Normalisering av genuttrykk data (Affymetrix U133 Plus 2.0 for CCLE , Affymetrix U133A for CGP) involvert i fire trinn: 1) rådata ble normalisert via robust multi-matrise gjennomsnitt (RMA) metoden; 2) sonder uten et gen navn ble fjernet; 3) -genet nivådata ble oppnådd som gjennomsnittet av sonden verdien innenfor hvert gen og 4) genet nivådata ble deretter normalisert standard av genet. For genekspresjonen data, CCLE inkluderte 51 cellelinjer, mens den CGP inkluderte 30 cellelinjer, blant disse tre cellelinjer hadde duplikate målinger. Gjennomsnitt duplikatene generert 27 unike cellelinjer for CGP. Unsupervised konsensus clustering ble utført på de normaliserte genet nivå data med R-pakken «Consensus Cluster Plus»;
