Abstract
Aktivering av Wnt signal grunn av manglende evne til å degradere β-catenin er funnet i 85% av kolorektal kreft. Omtrent halvparten av tykktarm kreft uttrykker en konstitutivt aktiv KRAS protein. En betydelig andel av pasientene viser både unormalt. Vi har tidligere rapportert at samtidig nedregulering av både β-catenin og KRAS var nødvendig for å indusere signifikant celledød og tumorvekst inhibering av kolorektal kreftceller. Selv attraktiv, er en RNAi-baserte behandlingsmetoder fortsatt langt fra å være ansatt i klinisk setting. Derfor søkte vi å rekapitulere våre tidligere funn ved bruk av små-molekyl hemmere av β-catenin og KRAS. Vi viser her at β-catenin hemmere PKF115-584 og pyrvinium pamoate blokk β-catenin avhengig transkripsjonen aktivitet og synergize med KRAS inhibitor
S-trans, trans
-farnesylthiosalicylic syre (FTS, salirasib) i tykktarmen kreftceller drevet av wnt og KRAS onkogene signaler, men ikke i celler som bærer BRAF mutasjoner. Den kombinerte anvendelse av disse forbindelser var overlegne i forhold til bruken av en hvilken som helst medikament alene indusere cellevekstarrest, celledød, MYC og Survivin ned-modulering, og hemming av forankrings-uavhengig vekst. Ekspresjon analyse av utvalgte kreft-relevante gener viste nedregulering av CD44 som en felles respons til de kombinerte behandlinger. Disse dataene gir et bevis på prinsipp for en kombinasjon terapeutisk strategi ved kolorektalkreft
Citation. Mologni L, Brussolo S, Ceccon M, Gambacorti-Passerini C (2012) synergieffekter av Combined Wnt /KRAS Hemming i tykktarms kreftceller. PLoS ONE 7 (12): e51449. doi: 10,1371 /journal.pone.0051449
Redaktør: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, Storbritannia
mottatt: 16 august 2012; Godkjent: 31 oktober 2012; Publisert: 05.12.2012
Copyright: © 2012 Mologni et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av den italienske foreningen for Cancer Research (AIRC), Cariplo Foundation, den italienske helsedepartementet og Lombardia Regional Government. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nye fremskritt i vår forståelse av tumorbiologi har vist at, til tross for sin store heterogenitet, kreftceller forblir ofte avhengig av en begrenset gruppe genetiske defekter for å overleve. Suksessen til målrettet terapi i KML, GIST og undergrupper av NSCLC indikerer klart at selv avansert sykdom trenger funksjon av dens grunnleggere onkogener å vokse og overleve [1], [2]. Dette fenomenet, referert til som «onkogen avhengighet», gir grunnlag for målrettet cancerterapi, noe som bør ideelt sett være fri for uønskede bivirkninger på normale celler [3].
Colorectal cancer (CRC) er karakterisert ved vel -kjent genetiske defekter: de aller fleste (70-95%) av sporadiske CRC bære mutasjoner som hyper-aktiverer Wnt veien, til slutt fører til unormal β-catenin-avhengig genekspresjon [4], [5], [6], [7]. Disse forandringer forekommer tidlig i løpet av tumorutvikling [8] og sannsynligvis representerer avhengighetsskapende lesjoner for svulsten. Faktisk, nedregulering av β-catenin induserer vekststans og differensiering i CRC-celler [9]. Imidlertid svikter β-catenin målretting for å drepe cellene [9], [10], [11]. Dette kan henge sammen med at CRC bære en rekke andre mutasjoner som også synes å være relevant for å overleve. For eksempel, KRAS aktiverende mutasjoner er tilstede i omtrent 35 til 50% av kolon-kreft [4], [6], [12], [13], [14]. Hvis komplett utvalg av Ras pathway medlemmer blir tatt hensyn til, blant annet NRAS, BRAF, NF1, RASSF1A og oppstrøms reseptor tyrosin kinaser, deretter 60-80% av svulstene viser endring av veien [7], [15], [16 ]. Genomsekvense data viste at ca 30-60% av CRC prøvene havn både Wnt og Ras pathway mutasjoner samtidig [6], [7], [16]. Nyere transgene musemodeller av CRC streket betydningen av både Wnt og KRAS signalering i tykktarm tumorgenesen [15], [17], [18]. Derfor kan doble målretting være nødvendig for å oppnå viktige terapeutiske effekter.
I vårt tidligere arbeid, vi demonstrert at kombinert shRNA-mediert stanse av β-catenin og KRAS i CRC celler førte til massive induksjon av apoptose
in vitro
og undertrykkelse av tumorvekst
in vivo
, mens hver for seg rettet mot en av de to reaksjonsveier viste moderat effekt [19]. Her forsøker vi å oversette våre funn i en farmakologisk tilnærming. To urelaterte forbindelser med forskjellige virkningsmekanismer, PKF115-584 og pyrvinium pamoate, ble brukt til å blokkere β-catenin avhengig transkripsjon. PKF115-584 er en potent og spesifikk små-molekyl-inhibitor av β-catenin /Tcf4 interaksjonen og har blitt validert som en inhibitor av Wnt signalisering i forskjellige cancermodeller [20], [21], [22], [23]. Pyrvinium er et antelmintikum [24] som er blitt vist å indusere nedbrytningen av β-catenin og av dets ko-faktor pygopus, via aktivering av kasein kinase 1α [25].
S Anmeldelser –
trans
,
trans
-farnesylthiosalicylic syre (FTS, salirasib) har blitt beskrevet som en bestemt RAS-hemmer [26]. FTS ligner karboksyterminale
S
-farnesylcysteine formidling rekruttering av RAS proteiner til cellemembranen. Som en konsekvens, FTS selektivt forstyrrer foreningen av kronisk aktiv RAS med membranen, og dermed blokkere dens funksjon [27], [28], [29].
Vi fant at kombinasjonen av β-catenin inhibitorer PKF115 -584 og pyrvinium pamoate med RAS inhibitor FTS synergi induserer vekst og apoptose i CRC celler som både Wnt og KRAS avvikende aktivering. Disse dataene representerer et bevis på prinsipp for kombinert Wnt /RAS hemming i tykk- og endetarmskreft.
Materialer og Metoder
cellelinjer, antistoffer og inhibitorer
SW837 var en slags gave Dr. Manuela Gariboldi (IFOM, Milano, Italia) som opprinnelig hentet dem fra ATCC. IFOM Cell Biology Unit bekreftet sin identitet ved mikro genotyping. Alle andre cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection, der de er rutinemessig kontrolleres ved hjelp av genotypisk og fenotypisk testing for å bekrefte sin identitet. Ls174T og HCT-116 celler bære mutasjoner i CTNNB1 genet som stabiliserer β-catenin protein [30]. DLD-1, SW480, SW837 og LoVo-celler har en avkortet APC-genet [31], [32]. Disse seks cellelinjer som uttrykker et konstitutivt aktivert KRAS protein [33], [34], [35]. HT-29 og Colo-201 cellelinjer har villtype KRAS men havn en mutant BRAF
V600E allel [33], [36]. Full annotering av disse mutasjonene er rapportert i tabell S1. Ls174T celler som er stabilt transfektert med doxycycline-induserbar shRNA konstruksjoner ble tidligere beskrevet [19]. Alle celler ble holdt i RPMI 1640 medium (med unntak av DLD-1, som ble dyrket i DMEM og LoVo i Hams F12 nærings) supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 enheter /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 2 mmol /L L -glutamine, og inkubert ved 37 ° C med 5% CO
2 atmosfære. Ls174T celler med induserbar β-catenin og KRAS shRNA ble beskrevet tidligere [19]. De følgende antistoffer ble anvendt i denne studien: anti-KRAS (Abnova, klon 4F3, fortynnet 1:1000), anti-pygopus (Santa Cruz Bioteknologi, H-216, 1:200), anti-myc (Santa Cruz Bioteknologi, 9E10 , 1:200), anti-aktin (Sigma-Aldrich, 1:2000), anti-survivin (Santa Cruz bioteknologi, D-8, 1:200), anti-β-catenin (Millipore, 2H4A7, 1:1000) . PKF115-584 ble vennlig levert av Novartis, Inc. (Basel, Sveits).
S Anmeldelser –
trans
,
trans
-farnesylthiosalicylic syre (FTS) ble syntetisert som beskrevet [26]. Pyrvinium pamoate ble kjøpt fra Sigma-Aldrich. Alle hemmere ble oppløst i DMSO og lagret i små porsjoner ved -20 ° C.
cellevekst og celledød analyser
Cell vekst og levedyktighet ble vurdert til de angitte tider bruker CellTiter 96® vandige løsning Cell Proliferation analysesystem (Promega Corporation) følge instruksjonene, som tidligere rapportert [37]. For å evaluere induksjon av apoptose, ble cellene sådd ut i 6-brønns plater over natten og deretter behandlet med hemmere eller kjøretøy. Etter 72 timer ble cellene løsnet ved trypsin, vasket, og apoptose ble bestemt ved bruk av Annexin V-FITC apoptose Detection Kit (Bender MedSystems), i henhold til produsentens instruksjoner. Alle grafer og IC
50 verdier ble generert ved hjelp av GraphPad programvare.
Dual luciferase assay
Cellene i seks-brønns plate ble behandlet med hemmere eller kjøretøy og transfektert med to mikrogram TOPflash eller FOPflash plasmider og 0,1 ug av phRL-CMV (som koder for
Renilla luciferase
, anvendt som en intern kontroll for transfeksjonseffektivitet) under anvendelse av 3 pl av Fugene
TM 6 reagens. Etter 24 timer ble cellene høstet, vasket og lysert. Luciferasepreparater signaler ble oppdaget ved hjelp av Dual-Luciferase® Reporter analysesystem (Promega). Firefly luciferase intensitet ble normalisert i løpet Renilla luciferase signal
Aktiv KRAS pull-down analysen
Cellene ble behandlet med FTS eller DMSO i 15 timer og deretter lysert i Magnesium Lysis Buffer (MLB. 25 mM Hepes, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl
2, 1% NP-40, 0,25% natrium-deoksycholat, 10% glycerol) inneholdende proteaseinhibitorer (10 umol /L benzamidin-HCl og 10 ug /ml hver gang aprotinin, leupeptin og pepstatin A). Lysater ble klaret ved sentrifugering ved maksimal hastighet og kvantifisert ved hjelp av Bradford-analysen. Lik mengde av totale proteiner (1 mg) ble deretter inkubert med 10 ug av Raf-1 RBD agarosekuler (Millipore) i 45 minutter ved 4 ° C på et roterende hjul. Etter 3 vaskinger med MLB, ble kulene resuspendert i 2 x Laemmli-prøvebuffer, kokt og applisert på SDS-PAGE. Aktiv, trakk ned KRAS ble avslørt av anti-KRAS antistoff. Total KRAS (input) ble evaluert fra råolje lysat.
Synergi analyse
Celler ble behandlet med kjøretøy eller hemmere, single eller kombinert med forskjellige konsentrasjoner og forskjellige forhold. Etter 3 dager ble cellene splittet 1:10 og reseeded i nærvær av inhibitorer. På dag 6 ble cellevekstkultur /levedyktighet overvåket ved MTS-analyse. Relativ vekst, sammenlignet med bærer-behandlede kontroller, ble brukt til å beregne fraksjonen påvirket og kombinasjonsindeksen for hver forsøks kombinasjon, ved hjelp av CalcuSyn programvaren.
Western blotting
Cellene ble høstet, vasket med iskald PBS og resuspendert i lyseringsbuffer som beskrevet [19]. Totale celleekstrakter ble applisert på SDS-PAGE, overført til en nitrocellulosemembran og probet med de angitte primære antistoffer over natten ved 4 ° C. Proteiner ble avslørt av chemiluminescence etter inkubasjon med HRP-konjugert sekundære antistoffer (GE Healthcare, fortynnet 1:2500).
Soft-agar koloni analysen
Ti tusen celler ble innebygd i RPMI som inneholder angitt forbindelsene og 0,3% lavtsmeltende agarose type VII (Sigma-Aldrich) og sådd ut på toppen av en 0,5% agarose /RPMI bærersjikt i 6-brønns plater. Ferske hemmere ble tilsatt hver 7. dag til toppen agar laget. Koloniene ble talt etter 20 dager.
kvantitativ real-time PCR
Celler ble behandlet med kjøretøy eller hemmere i 24 eller 72 timer og høstet. Total RNA ble ekstrahert med TRIzol reagens (Invitrogen) og retrotranscribed med tilfeldige heksamerer ved hjelp av en standard prosedyre. For 96-brønners-matrise-genet satt, forover og revers primer-blanding (5 pmol hver) ble oppdaget i den tilsvarende godt for hvert mål gen, og platene ble holdt frosset ved -80 ° C inntil behov. Reaksjonen mix (2 ul cDNA, 10 mL Brilliant III Ultra-Fast SYBR® Grønn QPCR Master Mix og 7 pl vann, per brønn) ble lagt til pre-laget plater og kvantitativ PCR ble kjørt på en Stratagene MX3000P deteksjonssystem under de følgende betingelser: 95 ° C, 3 minutter (1 syklus); 95 ° C, 10 sek, 60 ° C, 20 sekunder (40 sykluser). Bekreftelsen forsøk ble utført in triplo ved å bruke standardsanntids-PCR-protokollen anbefalt av produsenten. GAPDH husholdningsgenet ble alltid anvendt som en intern referanse. Primere for GAPDH var TGCACCACCAACTGCTTAGC (fremover) og GGCATGGACTGTGGTCATGAG (revers). De primere for alle andre gener er oppført i Tabell S2.
Resultater
PKF115-584 (figur 1A) og pyrvinium pamoate (figur 1B) har vist seg å forstyrre β-catenin -associated transkripsjonen komplekse gjennom ulike mekanismer. For å bekrefte aktiviteten av de to legemidlene i CRC-celler, karakterisert vi deres effekter i det Ls174T cellelinje, bærer β-catenin og KRAS aktiverende mutasjoner [30], [33]. Denne cellelinje ble først valgt som en modell, fordi det tidligere ble brukt for å karakterisere virkningene av siRNA-mediert genet Slå [19]. Som rapportert i figur 1D-E, begge legemidlene hemmet cellevekst i en doseavhengig måte. Lignende veksthemming ble oppnådd i DLD-1 celler, som uttrykker en avkortet APC allel (figur S1A-B). Samtidig, de to forbindelsene hemmet transkripsjon fra den β-catenin /Tcf4-responsive reporter plasmid TOPflash (figur 1G-H). IC
50 målte verdiene for celledeling og TOPflash kurvene er enige, noe som tyder på at veksten arrest medieres av β-catenin hemming. Som forventet, pyrvinium indusert tap av pygopus uttrykk (figur 1K). Det samme resultat ble oppnådd i DLD-1-celler (figur S1E). I tillegg har pyrvinium blitt rapportert å tvinge β-catenin degradering [25]. Overraskende, β-catenin uttrykk var uendret i pyrvinium behandlet DLD-1 celler (figur S1E), mens det litt redusert i Ls174T celler (figur 1K). Sekvensanalyse av β-catenin genet bekreftet tilstedeværelsen av den S45F substitusjon i Ls174T celler og villtypesekvensen i DLD-1-celler i den N-terminale region fosforylering (figur S2). Begge stoffene blokkerte endogene ekspresjon av MYC, en velkjent β-catenin transkripsjonen target og en sterk promoter av cellevekst (figur 1J-K og figur S1D-E). For å bekrefte hemming av Wnt veien, var uttrykk for ytterligere to kjente målgener analysert ved real-time kvantitativ PCR. Både AXIN2 og CCND1 (koding for cyclin D1) gener ble nedregulert ved behandling med PKF115-584 og pyrvinium (figur 1 M-N).
(A-C) Kjemiske strukturer av PKF115-584, pyrvinium og FTS, som tidligere beskrevet (se ref. 20-29) (D-F) Dose-responseffekter av PKF115-584, pyrvinium og FTS på Ls174T celler vekst. Cellene ble eksponert ved økende doser av hver inhibitor i 72 timer. MTS-analysen ble brukt til å evaluere effekten av forbindelsene på celle-proliferasjon. IC
50-verdier er vist for hver forbindelse. (G-H) Luciferase-aktivitet fra TOPflash plasmidet ble bestemt etter inkubering i 24 timer med PKF115-584 eller pyrvinium. Verdier er relative lysenheter (RLU) med DMSO-behandlede celler satt som 1.00. (I) Western blot-analyse av aktiv GTP belastede KRAS pull-down (øvre panel) og total KRAS (nederst) fra Ls174T celler behandlet med FTS. (J-L) Western blot-analyse viser c-myc-ekspresjon i Ls174T celler behandlet med økende konsentrasjoner av hver forbindelse i 48 timer. Fra pyrvinium-behandlede celler, pygopus og β-catenin uttrykk også vist (K). Actin vises alltid som en lasting kontroll. (M-N) Kvantitativ PCR analyse av AXIN2 og CCND1 /cyklin D1 uttrykk etter behandling med økende doser (0,125 til 1,0 uM) av PKF115-584 (M) og pyrvinium (N). (O) Western blot-analyse av MEK fosforylering i FTS-behandlede celler. Total MEK og aktin er vist som kontroller. (P-Q) Dose-responskurvene på PKF115-584 og pyrvinium i fravær (tomme sirkler) eller nærvær (fylte sirkler) av 100 uM FTS. Hver enkelt kurve er normalisert på tilsvarende prøven uten β-catenin hemmer.
Ras hemmer FTS (figur 1C) hemmet cellevekst ved høye mikromolare konsentrasjoner (figur 1F og regne S1C), i tråd med tidligere rapporter [38], [39], [40]. FTS utarmet GTP-lastet (aktiv) KRAS basseng, og samtidig la total KRAS mengde uendret (figur 1i). Denne anti-KRAS aktivitet oversatt til en markert nedgang på MYC proteinnivå (figur 1) og MEK fosforylering (figur 1o), men ikke av FOS uttrykk (data ikke vist) i Ls174T celler. Men FTS behandling førte til ulike molekylære responser i DLD-1 celler: fosfor-MEK signalet var uforandret og MYC var bare minimalt påvirket, mens FOS uttrykk betydelig (figur S1F) redusert. For å vurdere om den anti-proliferativ aktivitet av β-catenin hemmere kan forsterkes av FTS, ble dose-responskurver generert ved å utsette Ls174T celler til økende doser av PKF115-584 (figur 1P) og pyrvinium pamoate (figur 1. kvartal) i fravær eller nærvær av 100 uM FTS. I begge tilfeller er tilsetningen av FTS forskjøvet kurven i betydelig grad. Spesielt følsomhet for pyrvinium økt med om lag 10 ganger (IC
50 pyrvinium, 0,1 mikrometer, IC
50 pyrvinium + FTS, 0,01 mm). Disse resultatene helt indikerer at anti-proliferative effekter av to β-catenin inhibitorer og RAS-inhibitor FTS korrelerer med spesifikk hemming av β-catenin og KRAS aktiviteter, henholdsvis i Ls174T celler. Videre forbedrer FTS cytotoksisitet av β-catenin inhibitorer i disse cellene.
For bedre å definere samarbeid med β-catenin og KRAS inhibering i CRC-celler, aktiviteten av PKF115-584 og pyrvinium, alene og i forskjellige kombinasjoner med FTS, ble testet ved MTS-analyse på et panel av CRC-cellelinjer som bærer forskjellige onkogene mutasjoner (tabell S1). Resultatene som ble oppnådd ved faste konsentrasjoner er vist i figur 2 som søylediagrammer (PKF115-584: 125 eller 250 nm; pyrvinium: 50 nM; FTS: 100 uM). Interessant, mens følsomheten for enkle midler forskjellig blant de forskjellige cellelinjer, i alle KRAS-muterte celler som de kombinerte behandlinger forårsaket betydelig høyere veksthemming sammenlignet med enkeltbehandlinger. Synergisme ble deretter studert mer omfattende over en utvalg av inhibitorer konsentrasjoner, under anvendelse av metoden beskrevet av Chou og Talalay, basert på masse-handling lov prinsipp [41]. Kombinasjon indeksverdier (CI) ble beregnet ut fra eksperimentelle data langs hele spekteret av delvis effekter og er vist som XY plott i figur 2. Spesifikke CI verdier ved ED50, ED75 og ED90 er rapportert i tabell 1. Som spådd av onkogen mutasjon status, alle cellelinjer som bærer mutasjoner i både Wnt veien (APC eller β-catenin) og KRAS viste synergis interaksjoner (CI 1), bortsett fra på ytterpunkter brøkdel berørt, hvor effektene er enten ubetydelig eller for sterk. I motsetning til dette, HT-29-celler (som bærer villtype KRAS og en mutert BRAF
V600E allel) viste ingen synergisme. Snarere antagonistiske effekter (CI 1) ble notert. Men kombinasjonen av PKF115-584 med BRAF-hemmer (PLX-4032) viste svak synergisme i HT-29 celler ved høye doser (figur S3). Ytterligere data oppnådd med pyrvinium /FTS i to KRAS- og en BRAF-muterte cellelinjer er vist i figur S4. Samlet sett viser analysen av CI-verdier på ED50 (pyrvinium /FTS) korrelasjon mellom KRAS /BRAF mutasjonsstatus og synergistisk interaksjon (p = 0,0021): alle KRAS muterte celler viste synergisme, mens verken av to BRAF mutant cellelinjer gjorde (figur S5) selv om det begrensede antall BRAF mutante cellelinjer som ble testet ikke tillater å trekke endelige konklusjoner. I kontrast, gjorde effektene ikke korrelerer med p53 eller MSI status (tabell 1). Til sammen disse resultatene tyder på at PKF115-584 og pyrvinium kan kombineres med FTS i CRC celler husing samtidige Wnt /KRAS genetiske avvik, for å oppnå bedre terapeutiske effekter.
De angitte cellelinjer ble dyrket i 6 dager i nærvær av inhibitorer som enkle midler eller i kombinasjon, eller bærer alene. MTS analysen ble brukt for å vurdere effekten av hver behandling på cellekultur vekst og levedyktighet. (A) PKF115-584 /FTS og (B) pyrvinium /FTS kombinasjon. For hver cellelinje, søylediagrammet (til venstre) viser effekten på en enkelt dose (PKF115-584, 0,25 mikrometer [Ls174T og DLD-1] eller 0,125 mikrometer [SW480 og HCT-116]; pyrvinium, 50 nm; FTS, 100 uM). XY graf (til høyre) viser kombinasjonsindekser som en funksjon av fraksjonen påvirket (se Materialer og Metoder). For hver cellelinje, gener som er mutert, påvirker Wnt og Ras trasé, er angitt i parentes. CTRL = kontroll; Pyrv = pyrvinium. I alle paneler, antall symboler (#) indikerer signifikans versus β-catenin inhibitor (PKF115-584 eller pyrvinium); stjerne (*) viser betydningen versus FTS; ett symbol, p 0,05; to symboler, p 0,01; tre symboler p. 0,001
Vi deretter videre karakterisert de synergistiske kombinasjoner ved hjelp av nye uavhengige analyser (figur 3 og figur S6). Cellevekst ble overvåket i løpet av flere dager, etter å eksponere Ls174T og DLD-1 celler til de tre stoffer, alene eller i kombinasjon, viser at FTS potensieres PKF115-584 og pyrvinium toksisitet allerede etter 3-4 dager (figur 3A og figur S6a). Veksthemming ble fulgt av induksjon av apoptose: antall tidlige apoptotiske celler var signifikant høyere i kombinasjons prøvene sammenlignet med hvert legemiddel alene (figur 3B og figur S6B). Som en sammenligning ble apoptose i Ls174T celler undersøkt i parallell etter induksjon av anti-β-catenin og anti-KRAS shRNAs, og nådde et tilsvarende nivå av tidlig apoptose i den dobbelt stilnet prøve (figur 3B). Stanse av target proteiner er vist i figur S7. Neste, som alle tre forbindelser er i stand til å hemme MYC uttrykk i Ls174T celler (figur 1J-L), bestemt vi om å kombinere suboptimale konsentrasjoner av stoffene kan indusere en bedre blokkering av MYC transkripsjon. Tidligere rapporter har vist at både KRAS og β-catenin er i stand til å regulere MYC ekspresjon i colon cancerceller [19], [42], [43]. Faktisk kombinasjonsbehandling i 24 timer viste en betydelig forbedring i MYC uttrykk inhibering sammenlignet med enkeltbehandlinger (figur 3C). Dette resultatet tyder på at MYC er en vanlig effektor av de to baner og dens nedregule korrelerer med cellevekst og levedyktighet inhibering i disse cellene. I motsetning til dette, observerte vi ingen effekt av kombinasjonene på myc-nivåer i DLD-1 celler (figur S6C), i samsvar med mangel på MYC nedregulering av FTS i disse cellene. Videre kombinert hemming forårsaket sterk ned-modulering av survivin uttrykk, mens ingen eller liten endring ble oppnådd ved enkle behandlinger (figur 3D og figur S6D). Survivin er en transkripsjons målet for både Wnt og KRAS trasé [19], [44], [45] og har en avgjørende rolle i overlevelse av KRAS-drevet kreft [46]. Til slutt, for å studere de langsiktige effektene av β-catenin og KRAS kombinert hemming ble forankringsuavhengig vekst vurderes etter en enkel tilsetning av sub-dødelige doser av PKF115-584 eller pyrvinium, og FTS. Som vist på figur 3E-F og i figur S6E-F, kombinasjoner av hver β-catenin inhibitor med FTS hadde en betydelig effekt på myk-agar vekst av Ls174T og DLD-1 celler.
(A) Cells ble behandlet med 100 uM FTS, 0,25 uM PKF115-584 eller 50 nM pyrvinium, alene eller i kombinasjoner, eller kjøretøy, i 6 dager. Cellekultur levedyktighet ble bestemt på dagene 3, 4 og 6 ved MTS. Den relative OD sammenlignet med vehikkelbehandlede kontrollceller ble registrert som overlevende fraksjon. (B) Ls174T celler ble dyrket i 3 dager i nærvær av de angitte forbindelsene (samme konsentrasjoner som i [A]); i parallell, Ls174T celler som bærer induserbare sirnas (SINT, ikke-målsøkende, siBC, anti-β-catenin, siKR, anti-KRAS) ble behandlet med doksycyklin i den samme tid. Apoptose ble bestemt ved annexin V /propidiumjodid dobbeltfarging. Prosentandelen av tidlige apoptotiske celler (annexin-V-positive /propidiumjodid-negative) er rapportert i diagrammet. (C) Ls174T-celler ble behandlet med PKF115-584 (0,5 uM), pyrvinium (50 nM) og FTS (100 uM), alene eller i kombinasjon, i 24 timer og c-myc ekspresjonen ble evaluert ved sanntids-PCR ved anvendelse av GAPDH som en referanse genet. Expression ble normalisert på kjøretøy-behandlede kontrollceller. (D) Cellene ble inkubert i 72 timer med inhibitorer og cellelysatene probet med anti-Survivin og p-aktin-antistoffer. (E-F) Ti tusen Ls174T celler ble dyrket i bløt agar i nærvær av PKF115-584 (0,1 uM), pyrvinium (25 nM), FTS (50 uM), alene eller i kombinasjon. Store kolonier ble talt 20 dager senere. Antallet kolonier dannet av ubehandlede kontrollceller er angitt som 100% (E). Representative fotografier er vist i panel (F). Statistisk analyse: se legende å regne 2.
For å få ytterligere innsikt i transkripsjons endringer forårsaket av den kombinerte behandlinger, uttrykk for en utvalgt panel av gener knyttet til Wnt og KRAS signalering, tykktarm kreft og apoptose, ble undersøkt ved hjelp av en hjemmelaget kvantitativ PCR array. Heatmap i figur 4A viser relative endringer i ekspresjon etter 72 timers behandling med enkle eller kombinerte stoffer, sammenlignet med bærer-behandlede kontrollceller. Som forventet, enkle midler forlot de fleste gener uendret, mens kombinasjonene induserte en generell undertrykkelse av den valgte gen sett. Spesielt CD44, COX2, CTBP2, Cykliner D1 og D2, ITF2, p70S6K2 og RASSF7 var sterkt nedregulert av begge kombinasjoner, i forhold til enkeltbehandlinger. I tillegg pyrvinium /FTS kombinasjonen forårsaket ned-modulering av flere gener som BCL2, BCL2L1 (som koder for den Bcl-x
L anti-apoptotiske faktor), BCL9L, KRAS, CDKN1A (p21
WAF1) og PRKCA. For å fange tidlig transkripsjons endringene som skjer før noen tegn på cellulært stress, ble en 24-timers puls kjøre med pyrvinium /FTS kombinasjon. Denne kombinasjonen ble foretrukket fremfor en med PKF115-584 for denne analysen, som pyrvinium viste en høyere grad av genet nedregulering. Dataene er rapportert i den høyre kolonnen lengst heatmap. Til tross for noen forskjeller med lengre legemiddeleksponering ble mange av endringene konservert, inkludert nedregulering av CD44, COX2, BCL2 og Cykliner D. I tillegg oppregulering av de pro-apoptotiske protein APAF1 ble notert. Interessant, p21
WAF1 var forbigående oppregulert på 24 timer før de blir nedregulert på 72 timer. For ytterligere å bekrefte disse data, ble noen få gener analysert uavhengig av standard real-time PCR i fire cellelinjer. Figur 4B viser resultatene fra Ls174T celler, som bekrefter genregulering observert i det opprinnelige datasettet. Dataene fra alle fire cellelinjer ble ytterligere analysert for å identifisere synergistisk genekspresjon modulasjon, definert som 2-gangers forandring av ekspresjon i kombinasjon sammenlignet med enkeltbehandlinger (figur 4C). Interessant, BCL2 uttrykk var synergi nedregulert i alle fire cellelinjer ved pyrvinium /FTS kombinasjon (fylt grå boksene). Cyklin D1 og CD44 mottok en synergistisk i tre av fire cellelinjer. CD44 ble også nedregulert i DLD-1-celler, men graden av modulasjon ikke når terskelen for en synergistisk effekt (figur S8). Den PKF115-584 /FTS kombinasjonen viste seg å være mindre effektive i denne analysen, med bare CD44 og viser synergistisk ned-regulering i minst to cellelinjer (Ls174T og SW480). Disse resultatene indikerer CD44 som en felles respons til dobbelt β-catenin /KRAS målretting.
Ls174T-celler ble behandlet i 24 eller 72 timer med inhibitorer og et panel av gener fokusert på Wnt, ble Ras og apoptose trasé studert ved QPCR anvendelse av en 96-brønns array (A) eller standard real-time PCR (B). Grafene i (B) viser uttrykk ganger endring i forhold til kjøretøybehandlede kontroller. (C) Sammendrag tabell rapporterer real-time PCR analyse av data fra alle cellelinjer. Fylte esker indikerer synergistisk effekt på genekspresjon (mer enn to gangers endring i forhold til hver enkelt behandling). PY = pyrvinium.
Etter å ha bevist effekten av dobbel Wnt /KRAS hemming
in vitro
, prøvde vi å oversette disse funnene i en ny terapeutisk strategi
in vivo
. Imidlertid er PKF115-584 ikke lenger produseres av Novartis, og dens syntese i stor skala viste seg å være ekstremt vanskelig og tidkrevende. Som for pyrvinium pamoate, er det rapportert å være dårlig absorbert [47]. Imidlertid oral administrering av pyrvinium ble beskrevet av to grupper [48], [49]. Derfor ble et pilotforsøk kjøre for å verifisere om stoffet kunne nå målet i nakne mus, ved å se på pygopus uttrykk i Ls174T xenotransplantater etter tre daglige orale administrasjoner på 10 mg /kg pyrvinium. Resultatene var negative (figur S9), derfor har vi ikke forsøker videre
in vivo
analyser.
Diskusjoner
Nesten alle kolorektal kreft viser endring av Wnt veien som styrer P-catenin aktivering. Derfor kan hemming av β-catenin føre til betydelig fremgang i forvaltningen av denne sykdommen. Men nyere data viste at mer enn en «driver» onkogen veien er ofte aktivert i en enkelt svulst [50], [51]. Derfor er multiple onkogen målretting sannsynligvis være nødvendig for å utrydde sykdom. I en betydelig andel av kolorektal tumorer, Wnt og KRAS pathway endringer eksistere [6], [13], [14]. Til tross for at det har vært kjent i nesten 30 år, har KRAS onkogen vært en unnvikende mål så langt. Midler som blokkerer KRAS posttranslasjonelle modifikasjoner har vært ineffektive i kliniske studier [52]. Strategier for å målrette nedstrøms effektorer av KRAS [53], [54], [55], eller for å etablere syntetiske dødelige interaksjoner [56], [57], [58] har vist ulike reaksjoner fra sak til sak, muligens på grunn av kompleksiteten i KRAS veien. Dette er også fremhevet av forskjellig molekyl utfallet av KRAS hemming observert i to CRC cellelinjer i vår studie. Å ta en annen tilnærming, FTS spesifikt forstyrrer KRAS docking til cellemembranen, ved å etterligne sin farnesylcysteine delen [29].
I dette arbeidet, effektene av kombinert β-catenin og KRAS hemming av små molekyler ble undersøkt . Synergisme var tydelig i et panel av CRC-cellelinjer som bærer forskjellige typer av mutasjoner som påvirker målet veier, ved hjelp av flere uavhengige analyser. Ved å kombinere sub-optimale doser av β-catenin og KRAS inhibitorer vi observert signifikant vekstinhibering og apoptose, som ble gjenspeilet av sterk nedregulering av ekspresjon Survivin. Survivin hemmer aktivering av effektor caspases og er oppregulert i mange kreftformer. Ved å trykke to veier som styrer sitt uttrykk i CRC celler, fikk vi fullstendig undertrykkelse av sin anti-apoptotiske aktivitet og dermed induksjon av apoptose.
