Abstract
Regulatoriske T-celler (tregs) spiller en viktig rolle i å opprettholde selv toleranse og immun homeostase. Til tross for mange studier på sammenhengen mellom Tregs akkumulering og alder, eller malignitet, den relaterte mekanismen har ikke vært godt utforsket. For å finne ut mekanismen av Tregs akkumulering i alderen kreft i urinblæren, undersøkte vi romanen mobil senesence genet
Senex Hotell og relevant apoptose gen mRNA uttrykk i sortert CD4 + CD25
hi Tregs fra alderen UBC givere, evaluert serum cytokin profiler relatert til tumor immunpatologi, og videre utforsket forholdet mellom
Senex
uttrykk, apoptose genekspresjon og cytokin sekresjon. Etter å ha stilnet Senex genekspresjon ned med RNA-interferens, vurderte vi også den cellulære apoptose av tregs sortert fra alderen UBC pasienter som svar på H
2o
2-mediert stress. Våre data indikerer at oppregulert
Senex
mRNA uttrykk i Tregs av alderen UBC pasientene var korrelert med pro-apoptotiske genekspresjon og cytokin konsentrasjon. Dempe
Senex
genuttrykk økt cellulær apoptose og pro-apoptotiske genekspresjon av Tregs, som svar på H
2o
2-mediert stress. Oppregulert
Senex
mRNA uttrykk sammen med redusert pro-apoptotiske genekspresjon og forstyrrelser i cytokiner syntese kan bidra til Tregs spredning og fremme tumorigenesis og metastasering. Overall, oppregulering av mobilnettet senescence genet
Senex
, var assosiert til regulatoriske T-celler opphopning i alderen kreft i urinblæren. Vår studie gir en ny innsikt i forståelsen av perifer Tregs akkumulering i alderen maligniteter
Citation. Chen T, Wang H, Zhang Z, Li Q, Yan K, Tao Q, et al. (2014) A Novel Cellular Senescence Gene,
Senex
, er involvert i Peripheral Regulatory T celler Opphopning i Aged kreft i urinblæren. PLoS ONE 9 (2): e87774. doi: 10,1371 /journal.pone.0087774
Redaktør: Pranela Rameshwar, Rutgers – New Jersey Medical School, USA
mottatt: 3. september 2013, Godkjent: 30 desember 2013; Publisert: 05.02.2014
Copyright: © 2014 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Varenr 81141104, nr 81272259) og Science Foundation i Anhui-provinsen (pkt No.11010402168) Natural. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Regulatory T-celler (tregs) spiller en viktig rolle i å opprettholde selv toleranse og immun homeostase ved å undertrykke en rekke fysiologiske og patologiske immunresponser mot seg selv og nonself, samt kvasi-selvtumorantigener [1 ], [2]. Rekruttert til tumorvev, Tregs ekspandere og bli aktivert i tumorvev og drenering lymfeknuter, undertrykke antitumorimmunresponser [3]. Det er funnet at perifert blod CD4 + CD25 + Tregs akkumuleres dramatisk hos friske mennesker i alderen og gnagere [4] – [5]. Økningen i Tregs forhold bidrar til aldersrelatert immun-undertrykkelse, øker mottakelighet for smittsomme sykdommer og kreft [6]. Videre har økt antall Tregs blitt observert hos pasienter med kreft i urinblæren (UBC), med svulst uttrykk for foxp3, en bestemt Tregs markør, korrelert med klinisk prognose [7]. Intratumoral opphopning av tregs har også blitt observert i kolorektal kreft, hjernesvulst og leverkreft [8] – [10]. Undertrykkelse av anti-tumorrespons, er disse akkumulerte intratumorale Tregs funnet å være relatert til dårlig prognose [8] – [10]. Til tross for alle de ovennevnte forsknings bestrebelser, de detaljerte mekanismer har ikke blitt godt belyst. En fersk studie tilnærminger Tregs opphopning fra et nytt perspektiv, rapporterer at mobilnettet apoptose er involvert i Tregs akkumulering i aldringsprosessen. Etter 24 timer i kultur, Tregs fra gamle dyr døde betydelig mindre i løpet av denne analysen enn gjorde Tregs fra unge mus, noe som tyder på at Tregs fra eldre mus er mer resistente mot apoptose [11]. Men mekanismene bak deres motstand mot apoptose i alderen mennesker, særlig i alderen kreftpasienter er ennå å bli utforsket.
Nyere studier har vist at oppregulert cellular senesence kan bidra til apoptoseresistens av senescent menneskelige celler. En undersøkelse har gjort identifiseringen av en roman genet,
Senex
, som regulerer stress-indusert prematur senescence trasé (SIP) i endotelceller (ECS) [12]. Interessant nok har disse senescent celler indusert ved
Senex
er motstandsdyktig mot tumor nekrose faktor (TNF-α) apoptose [12]. Videre under visse omstendigheter, noen senescent celler kan selv endre sine fenotyper i motsatt linjene. Ny mekanisme avslører at menneske Tregs kan indusere senescence men ikke apoptose i svaret naive og effektor T-celler [13]. Disse senescent responder T-celler indusert av tregs endre sine fenotyper og cytokin-profiler, og har potent undertrykkende funksjon. Stor oppmerksomhet har nylig blitt utbetalt til mobilnettet senescence, men den potensielle rolle senescence genuttrykk i alderen kreftpasienter som er involvert i Tregs opphopning fortsatt i stor grad ukjent.
For å analysere potensielle bidrag av alderdom og apoptose genuttrykk i perifert Tregs opphopning i alderen maligniteter, vi først sortert CD4 + CD25
hi Tregs i alderen UBC pasienter, og deretter undersøkt transkripsjons nivåer av relevante gen mRNA uttrykk i sortert CD4 + CD25
hi Tregs. Videre ble serum cytokin profiler relatert til tumor immunpatologi vurdert som indirekte vurdering for T-celle funksjon. Vi har også vurdert forholdet mellom senescence genet
Senex
mRNA uttrykk og cytokin sekresjon. Deretter vurderte vi den cellulære apoptose av kortsiktige dyrkede Tregs fra alderen UBC pasienter som svar på H
2o
2-mediert stress etter
Senex
genekspresjon ble stille med RNA-interferens. Våre data levert bevis for at oppregulert
Senex
mRNA uttrykk i Tregs av alderen UBC pasienter ble korrelert med cytokin konsentrasjon og pro-apoptotisk genuttrykk. Dempe
Senex
genuttrykk økt cellulær apoptose og pro-apoptotisk genuttrykk i kortsiktig kultivert Tregs, som svar på H
2o
2-mediert stress. Oppregulert
Senex
mRNA uttrykk sammen med redusert pro-apoptotiske genekspresjon og forstyrrelser i cytokiner syntese kan forklare spredning av tregs og fremme tumorigenesis og metastasering. I konklusjonen, vår studie gir en ny innsikt i forståelsen av perifer Tregs akkumulering i alderen maligniteter.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle deltakerne undertegnet en erklæring om skriftlig informert tillatelse. Prosedyrene som beskrives i denne studien ble godkjent av etisk komité av andre sykehus i Anhui Medical University.
Pasienter og friske donorer
perifert blod (PB) prøver fra 38 alderen UBC pasienter (62 til 79 år, gjennomsnittsalder 70,13), 34 alderen friske kontrollpersoner (60 til 74 år, gjennomsnittsalder 68,72) og 37 unge friske kontroller (22 til 56 år, gjennomsnittsalder 43.25) ble undersøkt på Second Hospital of Anhui Medical University 2010-2013. Ingen av pasientene fikk kreftbehandling før de blir registrert. Sammenfall av autoimmun sykdom, ble humant immunsviktvirus (HIV) og syfilis utelukket for alle registrerte personer. Klinisk iscenesettelse ble utført etter preoperativ radiologisk undersøkelse og ved kliniske parametre i forbindelse med patologisk undersøkelse av transuretral reseksjon prøver i henhold til TNM-klassifikasjon av 1997 (Union Internationale Contre le Cancer).
Antistoffer og flowcytometri
følgende monoklonale antistoffer (mAbs) spesifikke for menneskeoverflateantigener ble kjøpt fra Beckman Coulter-Immunotech (Marseille, Frankrike): fysoerytrin (PE) konjugert anti-CD4-antistoffer (13B8.2 klone); fluorescein-isotiocyanat (FITC) -konjugert anti-CD25 (klon B1.49.9); Peridinin Klorofyll Protein-Cychrome5.5 (Percp-Cy5.5) konjugert anti-CD127 (SK3 klone); tre farger reagenssettet for Tregs inneholder av PE-konjugert anti-CD4, FITC-konjugert anti-CD25, og Percp-Cy5.5-konjugert anti-127 (UCHT1, 13B8.2 og B911 klone); og dens isotype kontroll-antistoff. BU-Annexin V-FITC apoptose Detection Kit (Biouniquer Nanjing, Kina) ble brukt for treg cellulær apoptose vurdering. Celler ble analysert og sortert ved hjelp av Coulter Epics XL flowcytometer (FCM) med system II programvare og COULTER EPICS ALTRA HyPerSortTM System med expo 32 MULTI programvare (Beckman Coulter, Miami, FL, USA).
Undersøkelse av perifer CD4 + CD25 + CD127
lave Cells
Om 2-5 ml av PB ble samlet inn. Alle prøver ble antikoagulert med heparin og undersøkes innen 4 timer. Rundt 100 ul av anti-koagulert blod ble inkubert ved 25 ° C i 15 min med 5 ul FITC-konjugert CD25-spesifikt mAb, 5 ul PE-konjugert CD4-spesifikk mAb, 5 ul Percp-Cy5.5-konjugert anti-127 mAb og sine respektive isotype kontroller. Etter inkubering ble de røde blodcellene lysert og vasket i PBS to ganger. Fargede celler ble raskt oppdaget ved hjelp av FCM og analysert ved hjelp av system ii programvare. Som tidligere beskrevet [14], hyppigheten av CD4 + CD25 + CD127
lave Tregs ble uttrykt som en prosentandel av CD4 + T-celler ved sekvensiell gating på lymfocytter og CD4 + T-celler.
Isolering av CD4 + CD25
høye og CD4 + CD25- Cells
Om 15-20 ml PB ble samlet for cellesortering. Perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble isolert ved tetthetsgradient separering ved hjelp av CAPPEL LSM Lymphocyte Separation Medium (MP Biomedicals, Solon, OH). Isolerte PBMC ble vasket 3 ganger med PBS. Om 1 × 10
7 PBMC ble overflaten farget med PE-konjugert anti-CD4 og FITC-konjugert anti-CD25. Da CD4 + CD25
høye og CD4 + CD25- celler ble sortert ved hjelp av portene på en Becton Counter flow-cytometri celle-sorter (ALTRA HyPerSortTM System). Som vi tidligere har beskrevet [15], konsekvent renhet 93% ble oppnådd for både CD4 + CD25
høy T-celle og CD4 + CD25-cellefraksjoner
Cell Culture and Treatment
Flowcytometri sortert CD4 + CD25high Tregs og CD4 + CD25- Teffs ble belagt i 24-brønners plater (Wuxi Nest Bioteknologi Co, Ltd, Wuxi, Kina), og dyrket i RPMI-1640 (HyClone) inneholder 10% FBS ( Gibco) og antibiotika for 24 timer. Da celler ble behandlet med en subcytotoxic konsentrasjoner av H
2o
2 (100 uM) i 2 timer som en stress-indus. Alle celler ble inkubert ved 37 ° C i en fuktet 5% CO
2 atmosfære inkubator.
siRNA Transfeksjon
Ordnet CD4 + CD25
høye og CD4 + CD25- celler fra alderen UBC pasienter og friske donorer ble transfektert med siRNA ved å bruke lipofektamin 2000 (Invitrogen) i overensstemmelse med fabrikantens protokoller. Sluttkonsentrasjonen av siRNA var 33 nM. Duplexes av siRNA målretting
Senex
mRNA (sekvensene er oppført i Tab 1) og kontrollere siRNA (kryptert sekvens) ble syntetisert av Invitrogen (Shanghai, Kina).
Undersøkelse av Cellular apoptose
Flowcytometri sortert CD4 + CD25
høye Tregs og CD4 + CD25- Teffs ble farget med Annexin V-fluoresceinisotiocyanat (Annexin V-FITC) og propidiumjodid (PI, Biouniquer, Nanjing, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner. Cellene ble deretter inkubert i 15 minutter i mørket før de blir underlagt analyse på et strømningscytometer (FACSCalibur, Becton Dickinson).
Sanntids Kvantitativ PCR analyse
Total RNA ble isolert ved anvendelse av RNeasy Kit (Qiagen). cDNA ble syntetisert med Superscript III (Invitrogen) revers transkriptase-syntese kit. Kvantitativ real time PCR ble utført på 7000 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) ved hjelp av Mesagreen qPCR Master Mix Plus for SYBR analyse (Takara). Primerne brukte og deres sekvenser er oppført i Tabell 1.
serumcytokinene
Serumprøver fra UBC pasienter og friske kontroller ble samlet inn. Konsentrasjonen av IL-2, IL-10, IL-17, ble TNF-α og TGF-β bestemt ved anvendelse av enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA) kits (eBioscience) i henhold til produsentens instruksjoner.
Statistisk analyser
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS 15.0 programvare (SPSS Inc., Chicago, IL). Statistisk signifikans av forskjeller ble bestemt av den ikke parametrisk uparet Mann-Whitney
U
-test og parametrisk Students
t
test for parede eller uparede prøver når det passer. Korrelasjoner ble evaluert ved hjelp av Pearsons koeffisienten test. Forskjeller ble betraktet som signifikant for p-verdier mindre enn 0,05.
Diskusjon
markant økt CD4 + CD25 + CD127
lav Treg Frekvens og transkripsjonsfaktor foxp3 mRNA uttrykk i Gamle UBC Pasienter
Resultater og
i lys av den kritiske rollen perifer Tregs akkumulering i alderen maligniteter, CD4 + CD25 + CD127
lav treg frekvens ble undersøkt i perifert blod alderen UBC pasienter i alderen friske kontroller og unge friske kontroller. I samsvar med tidligere studier, ble det observert en økning i Treg frekvens i begge alderen UBC pasienter og eldre friske kontroller, sammenlignet med unge friske kontroller. I mellomtiden, Tregs frekvens var betydelig høyere i alderen UBC pasienter enn i alderen kontroller (figur 1). Økt Tregs frekvens bidrar til aldersrelatert immunosuppresjon, øker forekomsten av infeksjon og cancer, og fører til sykelighet og dødelighet hos eldre [4] – [6]. En studie viste en aldersavhengig defekt svulst clearance, som ble korrelert med Tregs høyde [16]. Viktigere, CD25-uttømming førte til tumor klaring, noe som tyder på at alderen Tregs grensen anti-tumor immunitet [16].
Treg frekvens ble oppdaget ved hjelp av flowcytometri. En økt CD4 + CD25 + 127
lav Tregs frekvens (10,67 ± 0,58%) ble observert i Gamle UBC pasienter i forhold til alderen friske kontroller (7,14 ± 0,41%) og unge friske kontroller (5,09 ± 0,37%). Uttrykt som gjennomsnitt ± SD, ble data analysert med den parametriske Student t-test. ▴ vs Young friske kontroller, P 0,05; △ vs. Alderen friske kontroller, P . 0,05
transkripsjonsfaktor foxp3 spiller en viktig rolle i opprettholdelsen av selvtoleranse og høy foxp3 uttrykk er nødvendig for undertrykkende funksjon i menneskelig CD4 + Tregs [17] – [19]. I denne studien ble foxp3 mRNA uttrykk i begge alderen UBC pasienter og friske personer undersøkt. Som forventet, foxp3 mRNA nivåer betydelig økt i CD4 + CD25
hi Tregs sortert fra alderen UBC pasienter og eldre friske kontroller, sammenlignet med unge friske kontroller. Men det var ingen signifikant forskjell i foxp3 mRNA uttrykk mellom Tregs fra alderen UBC pasienter og eldre friske kontroller (figur 2). Avviket mellom Tregs frekvens og foxp3 mRNA uttrykk kan ha blitt forårsaket av funksjonelle forskjeller, som tidligere studier demostrated at foxp3 + T-celler hos mennesker er funksjonelt heterogen [1]. Oppregulert foxp3 mRNA uttrykk, sammen med den økte Tregs frekvens, kan øke svulster rømme, immunsuppresjon og føre til ineffektiv svulst klaring i alderen UBC pasienter.
tregs ble sortert etter FACS, foxp3 mRNA nivået ble oppdaget av real- tid kvantitativ PCR. Foxp3 mRNA uttrykk ble økt i Tregs både Alderen UBC pasienter (2
– △△ CT = 0,0272 ± 0,0081) og alderen friske kontroller (0,0184 ± 0,0059) sammenlignet med unge friske kontroller (0,0097 ± 0,0039) (p = 0,035 , 0,021 henholdsvis). Ingen forskjell ble påvist i Tregs foxp3 mRNA uttrykk mellom Alderen UBC Pasienter og Alderen friske kontroller. Uttrykt som gjennomsnitt ± SD, ble datoen analysert med Mann-Whitney
U
-test. ▴ vs. Tregs sortert fra Young friske kontroller, P . 0,05
oppregulert
Senex
mRNA uttrykk og downregulated Gene Expression of
P53
,
P16
,
P21 Hotell og
Caspase-3
i CD4 + CD25
hi Tregs av Alderen UBC Pasienter
for å evaluere potensielle bidrag til perifer Tregs akkumulering,
Senex
mRNA uttrykk av CD4 + CD25
hi Tregs og CD4 + CD25- effektor T (Teff) celler ble undersøkt. Betydelig økning i
Senex
mRNA uttrykk ble oppdaget i CD4 + CD25
hi Tregs i forhold til CD4 + CD25- Teffs i alderen UBC pasienter, og denne økningen ble ikke observert i andre grupper. I mellomtiden,
Senex
mRNA uttrykk for Tregs i alderen UBC pasienter var signicantly høyere enn i eldre og unge friske kontroller (figur 3). Videre mRNA nivåer av apoptose regulatoriske genet Caspase-3, P53, P16 og P21 (2
– △△ CT = 1183,42 ± 321,17, 15,66 ± 4,83, 23,06 ± 4,59 og 2415,85 ± 863,72, henholdsvis) ble betydelig redusert i CD4 + CD25
hi Tregs sortert fra alderen UBC pasienter, sammenlignet med CD4 + CD25- Teffs (figur 4). ble påvist noen signifikante forskjeller i apoptose regulatoriske genuttrykk i CD4 + CD25
hi Tregs sortert fra aldrende og unge friske kontroller, sammenlignet med Teffs.
tregs ble sortert etter FACS,
Senex
mRNA-nivået ble detektert ved sanntids-kvantitativ PCR. En betydelig økning i
Senex
mRNA uttrykk ble oppdaget i CD4 + CD25
hi Tregs (2
– △△ CT = 0,8532 ± 0,1078) sammenlignet med CD4 + CD25- Teffs (0,1564 ± 0,0731 ) i Alderen UBC pasienter (
p
= 0,027), og denne økningen ble ikke observert i andre grupper. Tregs
Senex
mRNA uttrykk i Gamle UBC pasienter var signicantly høyere enn i Gamle friske kontroller (0,0923 ± 0.0519) og unge friske kontroller (0,1455 ± 0.0792) (p 0,05 for hver Mann-Whitney
U
-test). Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. ▴ vs. Teffs sortert fra Alderen UBC pasienter, P 0,05; △ vs. Tregs i Alderen friske kontroller og Unge friske kontroller, P. 0,05
tregs ble sortert etter FACS, ble mRNA nivåer oppdaget av sanntids kvantitativ PCR. I Alderen UBC patiens, apoptose regulatoriske gener caspase-3, P53, P16 og P21 mRNA uttrykk (2
– △△ CT = 1183,42 ± 321,17, 15,66 ± 4,83, henholdsvis 23,06 ± 4,59 og 2415,85 ± 863,72,) redusert i Tregs av alderen UBC pasienter (
p
0,05 for hver Mann-Whitney U test). Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. ▴ vs. Teffs sortert fra Aged UBC pasienter, P . 0,05
Senex
genet har vist seg å gi en unik gatekeeper funksjon i SIPS og apoptose trasé i egenkapitalbevis [12 ]. Over uttrykk for
Senex
genet kan føre til egenkapitalbevis senescence, og disse
Senex
indusert senescent celler var resistente mot tumor nekrose faktor (TNF-α) indusert apoptose når egenkapitalbevis ble utsatt for subcytotoxic konsentrasjoner av H
2o
2. Videre
Senex
overekspresjon induserte en økning i både mRNA og proteinnivåene for p16, og det var en reduksjon i protein ekspresjon av hyperfosforylert Rb. Resultatene indikerte at
Senex
aktivert p16 /pRb vei [12]. Selv om den kritiske rollen
Senex
genet i å beskytte egenkapitalbevis mot mobil apoptose har blitt godt demonstrert,
Senex
genet i tregs fortsatt uttrykk for stor grad ukjent. I denne studien,
Senex
gen mRNA uttrykk ble funnet å være signifikant oppregulert i perifere CD4 + CD25
hi Tregs sortert fra alderen UBC pasienter, sammenlignet med Teffs. Den oppregulert
Senex
genet kan spille en tilsvarende rolle for å indusere Tregs senescenc og beskytte dem fra mobilnettet apoptose. Tidligere studier har vist at senescent vekst arrest er etablert og vedlikeholdt av p53 /p21 og /eller P16 /PRB tumor suppressor trasé [20] – [22]. Det er kjent at villtype p53-protein kan indusere celle apoptose [23]. Caspase 3 er et nedstrøms effektor cystein-protease i den apoptotiske vei, og det er ansett som en av de viktigste etterfølgerne apoptose [24]. P16-genet og P21-genet kan hemme cyclin-avhengige kinaser (CDK) og induserer cellesyklus arrest i G0-G1 fase [25] – [26]. Vi antok at cellesyklusregulerende molekyler, inkludert p53, p21 og p16 kan være involvert i Tregs akkumulering i alderen UBC pasienter. Våre resultater indikerer at uttrykket av apoptose regulatoriske genet
P53
,
P16
,
P21 Hotell og
Caspase-3
, noe som kan fremme cellulær apoptose som tidligere beskrevet [23] – [26], nedregulert i Tregs av alderen UBC pasienter. Den oppregulert
Senex
gen sammen med nedregulert pro-apoptotiske genet kan føre til redusert apoptose i tregs, og Tregs akkumulering i utvikling og progresjon av alderen kreft i urinblæren.
Økt nivåene av TGF-β1, IL-10, IL-17 og TNF-α serumkonsentrasjon og redusert nivå av IL-2 serumkonsentrasjon i Gamle UBC Pasienter
for en indirekte vurdering for T-celle funksjon, vi evaluert serum cytokin profiler relatert til tumor immunpatologi. Sammenlignet med alderen friske kontroller og unge friske kontroller (
p
0,05 for hver T Test), var det en tydelig økning i konsentrasjonen av IL-10 (13,03 ± 2,16 pg /ml), IL-17 ( 18,29 ± 3,45 pg /ml), TGF-β1 (16,22 ± 3,35 ng /ml) og TNF-α (25,18 ± 5,74 pg /ml) i serum av alderen UBC pasienter. Samtidig var det en nedgang i IL-2 serumkonsentrasjon både i alderen UBC pasienter (165,29 ± 26,45 pg /ml) og alderen friske kontroller (196,69 ± 32,38 pg /ml), som sammenlignet med unge friske kontroller (409,24 ± 90,81) . Det ble imidlertid ikke observert noen statistisk signifikant forskjell i IL-2-konsentrasjon i serum mellom alderen UBC pasienter og eldre friske kontroller (p = 0,243) (figur 5).
uttrykt som gjennomsnitt ± SD, data ble analysert med parametrisk Students T-test. ▴ vs. Alderen friske kontroller og Unge friske kontroller, P 0,05; △ vs. Unge friske kontroller, P. 0,05
Som den viktigste kilden til TGF-β1 og IL-10 i vedlikehold av selv toleranse og T-celle homeostase, regulatoriske T-celler hemmer effektor T-celler primært gjennom produksjonen av cytokiner, slik som TGF-β1 og IL-10 [27]. Denne studien viser at serumkonsentrasjoner av både TGF-β1 og IL-10 en signifikant økning i alderen UBC pasienter. Forhøyede nivåer av TGF-β1 og IL-10 tyder på at den akkumulerte Tregs i alderen UBC pasienter kan ha høy undertrykkende kapasitet, hemme antitumor immunresponser og fremme svulst immun flukt. TNF-α er den prototypiske proinflammatoriske cytokiner. Selv opprinnelig vist å være giftig for tumorceller i høye doser, har TNF-α vist seg å ha tumorfremmende funksjon [28]. Likeledes cytokin IL-17, som utskilles av Th17-celler, er vanligvis foretrukket i genereringen av T-celle-antitumorimmunitet, men disse effektene er overskygget av deres rolle i veksten av tumorer [29]. I den foreliggende undersøkelse, kan høye nivåer av TNF-α og IL-17 i alderen UBC pasienter fremme tumorgenese, som tidligere undersøkelse hadde vist at de kan fremme tumor angiogenese.
interleukin-2 er fremstilt hovedsakelig av CD4 + T hjelperceller og CD8 + -T-celler i sekundære lymfoide organer, og IL-2-produksjon er sterkt induseres etter aktivering av antigen [30]. I stand til å aktivere flere immun-celle-undergrupper, inkludert T-celler, er interleukin-2 essensiell for utviklingen, overlevelse og funksjon av treg-celler [30] – [31]. Betydelig nedgang i IL-2 med alderen er blitt beskrevet, i hovedsak basert på ex vivo-analyser, hvori T-celleproduksjon av IL-2 ser ut til å være mangelfull [6]. IL-2 virker på celler som uttrykker enten høy-affinitet IL-2R trimere eller lav-affinitet IL-2R dimerisk. Høye nivåer av den trimere IL-2R forbigående uttrykt ved CD4 + og CD8 + T-celler etter aktivering TCR whileTreg celler konstitutivt uttrykker høye nivåer av IL-2R rimeric [30]. I vår studie ble det observert en tydelig nedgang i IL-2 serumkonsentrasjon både i alderen UBC pasienter og eldre friske kontroller. Lave konsentrasjoner av IL-2 kan fortrinnsvis stimulere spredning av Treg celler gjennom høy affinitet trimere IL-2R, og bidra til perifer Tregs opphopning i den eldre befolkningen.
Senex
Expression ble korrelert med P53, TGF-β1 og IL-2 uttrykk i Gamle UBC Pasienter
Vi ytterligere utforsket potensialet forholdet mellom senescence genet
Senex
mRNA nivå og serum cytokin profiler eller apoptose regulerende gen mRNA uttrykk . Bruke Pearson korrelasjonsanalyse, våre data tydet på at
Senex
mRNA uttrykk er negativt korrelert med P53 mRNA uttrykk (p = 0,012) og IL-2 -konsentrasjon (p = 0,026), mens en positiv korrelasjon mellom
Senex
mRNA uttrykk og TGF-β1 konsentrasjon (p = 0,001) ble regnet ut i Gamle UBC pasienter.
Senex
genekspresjon var negativt korrelert med
P53
mRNA uttrykk (Figur 6A), noe som tyder på at
Senex
genet kan gi sin spesielle funksjon ved nedregulering av pro-apoptotiske gen
P53
uttrykk. Videre
Senex
genekspresjon var positivt korrelert med TGF-β1 nivå (figur 6B), noe som tyder på at oppregulert uttrykk for
Senex
genet kan forklare den høye undertrykkende kapasitet på akkumulert Tregs i alderen UBC pasienter. Til slutt,
Senex
genet ble negativt korrelert med IL-2 serumkonsentrasjon (figur 6C). Spredning av Tregs kan sterkt undertrykke CD4 + T-hjelperceller og CD8 + T-celler, og hemmer sekresjon av IL-2 i alderen UBC-pasienter.
Ved hjelp av Pearsons koeffisient test,
Senex
ekspresjon var negativt korrelert med (A) P53 mRNA ekspresjon (Pearson korrelasjonskoeffisient = -0,405, p = 0,012) og (B) IL-2-konsentrasjon (Pearson korrelasjonskoeffisient = -0,362, p = 0,026) i alderen UBC pasienter. (C) Positiv korrelasjon mellom
Senex
uttrykk og TGF-β1 konsentrasjon (Pearson korrelasjonskoeffisient = 0,507, p = 0,001) ble funnet ut av Pearsons koeffisient test.
Dempe Down
Senex
Gene Expression Økt Tregs apoptose i Response til H
2o
2-mediert Stress in vitro
Våre ovennevnte data antydet at oppregulert Senex genekspresjon var negativt korrelert med
P53
mRNA uttrykk i CD4 + CD25
høye Tregs, som innebar at
Senex
genet kan hemme Tregs cellulær apoptose etter nedregulering av pro-apoptotiske genuttrykk. For å undersøke om Tregs fra alderen UBC pasienter har en lavere ratio på celle apoptose, CD4 + CD25
høye Tregs og CD4 + CD25- Teffs ble sortert, etterfulgt av flowcytometrisk analyse etter å ha blitt farget med Annexin V-FITC og PI. Annexin V binder spesifikt til det eksponerte fosfatidylserin på apoptotisk celleoverflaten mens PI kan trenge inn i døde celler og skytes inn med nukleinsyre [32]. Våre data rapportert at tregs fra alderen UBC pasientene hadde færre Annexin V + apoptotiske celler (0,84 ± 0,34%) sammenlignet med Teffs (9,27 ± 3,66%) (figur S1). Dette er i tråd med tidligere studie [11], noe som tyder på at tregs fra alderen UBC pasienter er mer motstandsdyktig mot apoptose.
For ytterligere å studere potensielle rolle
Senex
genet i Tregs apoptose i alderen UBC pasienter, vi forstummet ned
Senex
genuttrykk med RNA interferens i kortsiktige dyrkede Tregs som svar på H
2o
2 indusert oksidativt stress. H
2o
2 er en kjent induktor av oksidativt stress når den leveres i en subcytotoxic dose [33]. I denne studien, sortert CD4 + CD25
høye Tregs og CD4 + CD25- Teffs ble utsatt for subcytotoxic konsentrasjoner av H
2o
2 (100 mm) i 2 timer. Våre resultater viser at 100 mikrometer H
2o
2 behandling økt Annexin V + apoptotiske celler i både CD4 + CD25
høye Tregs (11,2 ± 2,6%) og CD4 + CD25- Teffs (13,1 ± 4,3%), og ingen signifikant forskjell ble observert i H
2o
2 indusert cellulær apoptose mellom Tregs og Teffs. Dempe ned
Senex
genet ved siRNA basseng transfeksjon for 24 timer, så ved 100 mikrometer H
2o
2 behandling i 2 timer, økt Annexin V + apoptotiske celler i CD4 + CD25
høye Tregs ( 21,5 ± 3,4%), men gjennomgår de samme prosedyrene ble Annexin V + apoptotiske celler ikke funnet å øke i CD4 + CD25-Teffs (13,9 ± 3,1%) (figur 7). Videre ble ingen signifikant forskjell observert i mobilnettet apoptose i både Tregs og Teffs når cellene ble bare behandlet med siRNA transfeksjon uten H
2o
2 behandling (figur 7). Videre tie ned Tregs
Senex
genuttrykk førte til oppregulering av pro-apoptotisk genet
P53
,
P16
,
P21 Hotell og
caspase -3
mRNA-ekspresjon som reaksjon på stress (figur 8). Transfeksjonseffektiviteten var 45 ± 7,2%, noe som ble bekreftet av fluorescens-merket FAM-siRNA.
Senex
mRNA uttrykk inhiberingshastigheten var mer enn 90% sammenlignet med ikke-kodende RNA (ncRNA) (figur S2).
Ordnet CD4 + CD25
høye tregs ble farget med Annexin V -FITC før flowcytometrisk analyse. Celle apoptose ble oppdaget som Annexin V + apoptotiske celler. 100 pM H
2o
2 behandling i 2 timer øket apoptotiske celler i både Tregs (11,2 ± 2,6%) og Teffs (13,1 ± 4,3%) og ingen signifikant forskjell ble observert i H
2o
2 indusert apoptose mellom Tregs og Teffs. Dempe ned
Senex
gen med RNA interferens (RNAi) for 24 timer, så ved H
2o
2 behandling i 2 timer, økt apoptotiske celler i Tregs (21,5 ± 3,4%), men gjennomgår samme prosedyre, apoptotiske celler ble ikke funnet å øke i Teffs (13,9 ± 3,1%). Ingen forskjell ble observert i cellulær apoptose mellom Tregs og Teffs når cellene ble behandlet med siRNA transfeksjon alene.
ble oppdaget Gene mRNA nivåer av sanntids kvantitativ PCR. Etter
Senex
genet ble stille ned i 24 timer, etterfulgt av H
2o
2 behandling i 2 timer, apoptose regulatoriske gener
Caspase-3
,
P53
,
P1
6 og
P21
mRNA uttrykk (2
– △△ CT = 6705,73 ± 1124,07, 253,08 ± 16,01, 154,58 ± 35,12 og 5135,79 ± 985,47, henholdsvis) oppregulert i CD4 + CD25
hi Tregs (
p
0,05 for hver Mann-Whitney U test). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. ▴ vs. H
2o
2-behandlede celler, P . 0,05
Forrige studien viste at
Senex
genet bidratt til apoptoseresistens av menneskelig egenkapitalbevis [ ,,,0],12]. I denne studien, tie ned
Senex
genuttrykk økt Tregs apoptose som svar på H
2o
2 indusert oksidativt stress.
