Abstract
feilregulert mirnas spiller avgjørende roller i kreftutvikling og kreft progresjon. I denne studien ble funksjon av MIR-1228 * i å regulere kreft progresjon undersøkt i magekreft. Redusert uttrykk for MIR-1228 * ble observert i menneskelige mage kreft vev sammenligne med normalt vev. Deretter ble rollen som MIR-1228 * evalueres
in vivo
hjelp svulsten xenograft modell. I denne modellen, MIR-1228 * overekspresjon trykkes xenograft tumordannelse. Videre viste vi MIR-1228 * negativt regulert NF-kB aktivitet i SGC-7901 magekreftceller og fant at CK2A2 var et mål av MIR-1228 *. Oppregulering av MIR-1228 * redusert uttrykk av mesenchymale markører og økt epiteliale markør E-cadherin, noe som tyder på sin potensielle rolle i å undertrykke epitelial-mesenchymale overgang. Sammen er disse funnene gir det første bevis på at Mir-1228 * spiller en viktig rolle i å regulere magekreft vekst og foreslår at selektiv restaurering av MIR-1228 * kan være gunstig for magekreft terapi
Citation. Jia L Wu J, Zhang L, Chen J, Zhong D, Xu S, et al. (2013) Restaurering av MIR-1228 * Expression Undertrykker Epitelial-Mesenchymale Overgang i magekreft. PLoS ONE 8 (3): e58637. doi: 10,1371 /journal.pone.0058637
Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan
mottatt: 25 oktober 2012; Godkjent: 05.02.2013; Publisert: 12 mars 2013
Copyright: © 2013 Jia et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
microRNAs (mirnas) er en klasse av kort ( 20-23 nukleotider i lengde), endogene, enkelt-trådet RNA som regulerer genekspresjon ved å bevirke translatorisk undertrykkelse eller mRNA degradering [1], [2]. Via disse molekylære mekanismer, mirnas besitte normale biologiske funksjoner, slik som regulering av celleproliferasjon, differensiering og apoptose. Dessuten har feilregulert mirnas vist seg å spille kritiske roller i regulering av karsinogenese og progresjon av kreft [3], [4]. Abberant mirnas uttrykk har blitt observert i mange typer maligniteter inkludert magekreft [5].
Epitelial-mesenchymale overgang (EMT) er en biologisk omprogrammering hendelse som gjør at epitelceller til å gjennomgå mange biokjemiske endringer for å skaffe en mesenchymale celle fenotype. Mens EMT er avgjørende for riktig embryoutvikling, økende bevis tyder på at avvikende aktivering av EMT fører til ondartet svulst progresjon [6]. Det har blitt vist at EMT er en viktig prosess som bidrar til utvikling av kreft, karakterisert ved tapet av epiteliale markør E-cadherin, en økning i mesenkymal markør vimentin, og en økning i den vandrende og invasive oppførsel [7], [8].
i vår forrige undersøkelse, ved å analysere miRNA rekke kreft i bukspyttkjertelen kuler, ble Mir-1228 * funnet som en av kreftrelaterte mirnas (data ikke vist). Her har vi gitt bevis for at Mir-1228 * ble nedregulert i mage kreft vev sammenlignet med normalt vev. Restaurering uttrykk for MIR-1228 * i magekreftceller signifikant hemmer cellemigrasjon og tumorvekst. Mekanistisk, viste vi at Mir-1228 * hemmer NF-kB aktivering og potensielt undertrykker EMT.
Materialer og metoder
Cell Culture
Menneskelige magekreft cellelinjer SGC-7901 , AGS og BGC-823 ble kjøpt fra institutt for biokjemi og cellebiologi (Chinese Academy of Sciences). En normal mage epiteliale cellelinje GES-1 ble kjøpt fra Beijing Institute for Cancer Research. Disse cellene ble holdt ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator i RPMI-1640 (SGC-7901 og BGC-823), F-12K (AGS) eller DMEM (GES-1) medium supplementert med 10% føtalt bovint serum [ ,,,0],9], [10].
kliniske prøver
Femti par av magekreft og tilstøtende prøver ikke-kreft vev ble oppnådd fra pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon ved Second Affiliated Hospital, College of Medicine , Zhejiang University. De samsvarende ikke-cancer tilstøtende vev ble erholdt på minst 5 cm fra tumorstedet. Ingen av pasientene hadde gjennomgått radioterapi eller kjemoterapi før operasjonen. Vevsprøver ble oppsamlet, hurtigfrosset i flytende nitrogen, og lagret ved -80 ° C inntil anvendelse [11]. Alle vev ble histologisk bekreftet å være mage adenokarsinomer. Studien ble godkjent av Second Affiliated Hospital Ethics Committee of Zhejiang University College of Medicine. Den signerte informert samtykke ble innhentet fra alle deltakere eller fra pasientenes representanter om direkte samtykke ikke kan innhentes.
RNA Utvinning og Real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert fra de dyrkede celler eller vev ved hjelp av TRIzol (Invitrogen), og konsentrasjonen av total-RNA ble bestemt. Syntese av cDNA og real-time PCR ble utført ved anvendelse av TaqMan mikroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) og den TaqMan® mikroRNA Assay Kit (Applied Biosystems), respektivt. Sanntids-PCR ble utført på en Applied Biosystems ™ StepOnePlus Real-Time PCR System i henhold til protokollen. Uttrykket nivået av MIR-1228 * ble normalisert til RNU6B. De Real-Time PCR reaksjoner ble utført i tre eksemplarer. Den relative uttrykk for miRNAs ble beregnet ved hjelp av komparative Ct metoden [12].
tumorinokulasjon analysen i hårløse mus
Kvinne BALB /c atymiske nakne mus i en alder av 4 uker ble kjøpt fra Shanghai Laboratory Animal Senter (Chinese Academy of Sciences). Alle prosedyrer som involverer dyr ble godkjent av forsøksdyr etiske komité, College of Medicine, Zhejiang University. MIR-1228 * eller MIR-NC stabil transfeksjon SGC-7901 celler suspensjoner (2,5 × 10
7 celler /ml) i 200 mL serumfritt medium ble subkutant injisert i flankene av nakne mus, henholdsvis. Tumorveksten ble undersøkt to ganger per uke i 5 uker, og tumorvolumet (V) ble overvåket ved å måle lengden (L) og bredden (W) av tumoren med calipers og beregnes ved formelen V = 1/2 (L x W × W) [13].
Cell Migration
migrasjon evne MIR-1228 * eller MIR-NC stabil transfeksjon SGC-7901 celler ble oppdaget ved hjelp Transwells (8 mm porestørrelse, Corning). De Transwells ble satt inn i 24-brønners plater. Ferskt trypsinert og vaskede celler ble suspendert i 100 ul serumfritt RPMI 1640 inneholdende 1% føtalt bovint serum. Om 1 × 10
5 celler /brønn ble plassert i øverste kammer i hvert innlegg. 200 ul av RPMI 1640 inneholdende 20% føtalt bovint serum ble tilsatt til de nedre kamre. Etter inkubering i 24-48 timer ved 37 ° C i en 5% CO
2 fuktet inkubator ble cellene fiksert med 95% absolutt alkohol og farget med krystallfiolett [14]. Cellene i det indre kammer ble fjernet med en bomullspinne og cellene festet til undersiden av membranen ble tellet og avbildes under en invertert mikroskop ved 200 x forstørrelse i løpet av fem tilfeldige felt i hver brønn. Hvert forsøk ble utført in triplo.
Western Blot
Totale proteiner ble målt ved anvendelse av BCA kit (Pierce) i henhold til produsentens protokoll. Proteinene av celler ble fraksjonert ved elektroforese på 12% SDS-polyakrylamid-gel og elektro-blottet til nitrocellulose (NC) membraner i 2,5 timer ved 200 V. NC-membraner ble inkubert med blokkeringsbuffer i 1 time ved romtemperatur, fulgt av behandling over natten med det primære antistoff ved 4 ° C, og deretter med et HRP-konjugert sekundært antistoff (MBL). Etter vasking ble de reaktive bånd detektert ved anvendelse av et ECL Western blot-påvisning kit (Millipore) i henhold til produsentens instruksjoner. Antistoffer som brukes i dette forsøket var kanin monoklonalt anti-E-cadherin (Epitomics), anti-vimentin (Epitomics), anti-β-catenin (Epitomics), anti-Snail (Cell Signaling), anti-Slug (Cell Signaling), anti -ZEB1 (Cell Signaling), anti-ZEB2 (Santa Cruz), anti-CK2A2 (Santa Cruz) og mus anti-GAPDH (KangChen Biotech).
Immunohistochemistry
Parafin seksjoner, 3- um i tykkelse, ble bakt i 2 timer ved 60 ° C og deparaffinized. Antigen gjenfinning ble utført ved anvendelse av citrat natrium-buffer (pH 7,2) ved 95 ° C i 15 minutter og deretter objektglass ble avkjølt ved romtemperatur i 30 minutter. Etter å ha blitt behandlet med 3% hydrogenperoksid i 15 minutter for å blokkere endogen peroksidase, ble delene behandlet med normalt geiteserum begrensnings væske i 30 minutter for å redusere ikke-spesifikk binding, og deretter kanin polyklonalt anti-E-cadherin (Santa Cruz) eller kanin monoklonalt anti-vimentin (Epitomics) ble inkubert seksjonene i 12 timer ved 4 ° C. Etter gjenoppvarming i 1 time og vasking 5 ganger ble snittene inkubert med sekundært antistoff i 30 minutter ved romtemperatur. Diaminobenzidine ble brukt for fargereaksjoner.
Plasmid Bygg og Cell Transfeksjon
Mir-1228 * ekspresjonsvektor (MIR-1228 *) eller negativ kontroll (MIR-NC) ble konstruert ved kloning av glødet oligonukleotider som inneholdt den optimaliserte MIR-1228 * stilk-løkke (oligonukleotider ble utformet som: topp strand, 5′-TGC TGG TGG GCG GGG GCA GGT GTG TGG TTT TGG CCA CTG ACT GAC CAC ACA CCC CCC CGC CCA C-3 « ;. bunnen strand, 5’CCT GGT GGG CGG GGG GGT GTG TGG TCA GTC AGT GGC CAA AAC CAC ACA CCT GCC CCC GCC CAC C-3 «) eller negativ kontroll stilk-løkke i pcDNA6.2-GW /EmGFP vektor ( Invitrogen) [15]. Den to-kb MIR-1228 * promoter-regionen ble forsterket (Primere ble utformet som: fremover, 5»-ATC TAG GGT ACC CTC ACT TGG AG CCA CAC AGA-3 «; omvendt, 5»-GAC TGA AGA TCT ACC TCA AGA GTT GGG GTG TG-3.) og coloned til pGL3-Enhancer Vector (Promega) [16], navngitt som pGL3-MIR-1228 * -promoter. Den tomme pGL3-Enhancer Vector fungerte som en negativ kontroll (pGL3-kontroll). Mir-1228 * målområdet av CK2A2 3’UTR sekvensen ble kjemisk syntetisert ved Shanghai Biotech og innsatt nedstrøms pMIR-RAPPORT luciferase plasmid (Applied Biosystems), navngitt som pMIR-CK2A2. Den pReceiver-c-Rel ORF-klone med GFP-tag ble kjøpt fra GeneCopoeia. For å generere stabile transfekterte celler, ble Mir-1228 * og MIR-NC uttrykk konstruerer transfektert inn SGC-7901 cellelinje ved hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter 48 timer, blasticidin (14 ug /ml) ble tilsatt til mediet. Den pGL3-MIR-1228 * -promoter /kontroll, GFP-c-Rel /kontroll, pMIR-CK2A2 /kontroll eller NF-kB reporter vektor (Promega) ble transient transfektert inn SGC-7901 celler ved hjelp Lipofectamine 2000, PRL-TK ( Promega) ble anvendt som intern normalisering [17].
Luciferase assay reporter
luciferase reporter-analyse ble utført i SGC-7901-celler. Cellene ble vasket to ganger med PBS og lysert i passiv Lysis Buffer (Promega) og luciferase-aktivitet ble målt fra 20 ul lysat ved hjelp av Dual-luciferase reporter Assay System (Promega) på GloMax 20/20 Luminometer (Promega). Alle data ble oppnådd ved å ta gjennomsnittet av resultatene fra minst tre uavhengige repetisjoner.
Statistical Analysis
Forskjeller mellom uttrykket nivåer av MIR-1228 * i mage kreftpasienter ble bestemt av Wilcoxon signert-rank test. De kliniske data ble analysert ved hjelp av chi-kvadrat test. T-test og ANOVA ble benyttet for å analysere
in vitro Kjøpe og
in vivo
dataene. Alle
P
verdiene var tosidig og forskjeller ble definert som statistisk signifikant for
P
0,05. Resultatene ble analysert ved hjelp av SPSS V.16.0 programvare (SPSS Inc). * P 0,05, ** P 0.01.
Resultater
MIR-1228 * er ofte nedregulert i Human Gastric Cancer
For det første, for å avgjøre om MIR-1228 * er forskjellig uttrykt i menneskelig primær mage kreft, uttrykket nivået av modne MIR-1228 * ble undersøkt ved hjelp av TaqMan real-time PCR i 50 par av menneskelige mage kreft vev og pair-matchet tilstøtende noncancerous mage vev. Våre resultater viser at ekspresjonsnivået av MIR-1228 * ble signifikant redusert i magekreft vev sammenlignet med de tilstøtende noncancerous gastrisk vev (Fig. 1A). Om 72% av tumorprøver var lavere uttrykt med MIR-1228 (Fig. 1B). Bruk av 2
-ΔΔCT verdier ganger endring av MIR-1228 * 1.0 ble ansett som lav, mens det 1.0 ble ansett som høyt uttrykk [18]. MIR-1228 * ekspresjon ble også undersøkt i gastrisk cancer cellelinjer og en udødeliggjort normal gastrisk mucosal epitelcellelinje (GES-1). Som vist på fig. 1C, MIR-1228 * var betydelig lav uttrykk i alle kreftcellelinjer sammenlignet med GES-1. Samlet utgjør disse resultatene gir sterke bevis for at Mir-1228 * ble nedregulert i magekreft.
(A) I menneskelige mage kreft vev sammenlignet med sammenkoblede tilstøtende noncancerous (normal) mage vev, Mir-1228 * ble nedregulert. Uttrykket av MIR-1228 * ble analysert ved real-time PCR og normalisert til RNU6B. Resultatene vises på en logg skala. De statistiske forskjeller mellom prøvene ble analysert med Wilcoxon signed-rank test (n = 50). (B) Relativ uttrykk for MIR-1228 * i 50 mage kreft vev sammenlignet med matchede normalt vev. Data er vist som 2
-ΔΔCT verdier. (C) Ekspresjon av MIR-1228 * i 3 magecancercellelinjer og en immortalisert normal gastrisk mucosal epitelcellelinje (GES-1) ble utført ved sanntids-PCR og normalisert til RNU6B. Resultatene er midler ± SEM, n = 3.
Videre MIR-1228 * uttrykk ble evaluert med hensyn til clinicopathological kjennetegn ved pasientene. Alle pasientene hadde ingen fjernmetastaser og alle vev ble histologisk bekreftet med mage adenokarsinomer. Alle saker (n = 50) ble delt i to grupper: MIR-1228 * lav uttrykk (n = 36) og Mir-1228 * høy uttrykket (n = 14). Mir-1228 * lav-uttrykket gruppen hadde tilbøyeligheter mot større tumorstørrelse. Men det var ingen signifikante sammenhenger mellom MIR-1228 * uttrykk og andre clinicopathologic funksjoner som alder, kjønn, histologisk type eller TNM stadium (tabell 1).
Økt MIR-1228 * Expression Undertrykker xenograft svulstdannelse
for å vurdere funksjonell rolle MIR-1228 * i magekreft, den optimaliserte MIR-1228 * stilk-løkke ble klonet inn pcDNA6.2-GW /EmGFP vektor. Gastric cellelinje SGC-7901 celler ble transfektert med pcDNA6.2-GW /EmGFP-MIR-1228 * eller pcDNA6.2-GW /EmGFP-NC vektor- og stabil cellelinjer ble generert og heter Mir-1228 * eller MIR-NC, henholdsvis. Som forventet, RT-PCR-analyse viste at Mir-1228 * stabile celler hadde en økning på modne MIR-1228 * uttrykk for sammenlignet med MIR-NC stabile celler (Fig. 2A). Det var ingen morfologiske forandringen i MIR-1228 * stabile-transfektert celler sammenlignet med nontransfected celler. SGC-7901 celler med eller uten transfeksjon av MIR-1228 * ble implantert subkutant i flankene av hårløse mus for å evaluere de potensielle effektene av MIR-1228 * på magekreft vekst
in vivo
. Overekspresjon av MIR-1228 * undertrykte betydelig tumorvekst (Fig. 2B). Ved slutten av forsøksperioden, er størrelsen og våtvekt av tumorer med MIR-1228 * overekspresjon var betydelig mindre og lavere enn den for kontrollgruppen (Fig. 2C-D). Dermed tyder dataene som MIR-1228 * hemmer xenograft tumorvekst av magekreftceller
in vivo
.
(A) MIR-1228 * var mer enn ti-fold endringer i speil 1228 * stabilt transfektert SGC-7901, sammenlignet med NC. Resultatene er midler ± SEM, n = 3. (B) Økt MIR-1228 * uttrykk undertrykker xenograft tumorvekst. Stabil transfeksjon av SGC-7901 celler med MIR-1228 * eller MIR-NC ble injisert subkutant i nakne mus. Volumet av hver tumor ble målt to ganger hver uke. Det gjennomsnittlige volum av tumorer utviklet i nakne mus er vist som gjennomsnitt ± SEM, n = 6 per behandlingsgruppe. De statistiske forskjeller mellom prøvene ble bestemt av to-veis ANOVA. (C) sammenlignet med kontrollgruppen, de xenografter med MIR-1228 * overekspresjon var betydelig mindre. Musene ble avlivet 5 uker etter inokulering. To grupper «bilde av svulster vises. (D) tumorer fra hver gruppe ble veid umiddelbart etter fjerning. Svulsten vekt er angitt som betyr ± SEM, n = 6.
NF-kB Aktivering er ansvarlig for Nedre Uttrykk av MIR-1228 * i Gastric Cancer
Nyere arbeider har viste at de fleste mirnas har transkripsjonsfaktor (TF) bindingsseter og mange studier har rapportert at mirnas kan reguleres ved TFS [19]. Her har vi brukt bioinformatiske programmer (Arrangøren 2,0 og P-kamp) for å identifisere potensielle regulatorer av miRNA-1228 * [16], [17]. Vi fant tre c-Rel bindende domener i 2-kb MIR-1228 * promoter-regionen (fig. 3A). Siden c-Rel subenheten er et medlem av NF-kB familie og hyperactivation av NF-kB aktivitet har blitt vist å være assosiert med magekreft, [20], [21]. Vi antok at NF-kB aktivering er knyttet til nedregulering av MIR-1228 * i magekreft.
(A) Skjematisk representasjoner av MIR-1228 * promoter-regionen (de svarte pilspisser er c-Rel bindende domener), jo lavere er pGL3-MIR-1228 * -promoter konstruere. (B) 24 timer etter transfeksjon med pGL3-MIR-1228 * -promoter eller pGL3-kontroll, SGC-7901-celler ble stimulert med eller uten TNF-α og /eller PDTC i 8 timer, deretter relativ luciferaseaktivitet ble målt. Luciferaseaktiviteten ble normalisert til Renilla luciferase-aktivitet uttrykt ved PRL-TK og deretter sammenlignet med det relative nivået av luciferase pGL3-kontroll. *
P
0,05 sammenlignet med kontroll.
#
P
0,05 sammenlignet med TNF-α-behandlede gruppen. (C) SGC-7901 celler ble ko-transfektert med pGL3-MIR-1228 * -promoter /pGL3-kontroll og GFP-c-Rel /GFP-kontroll, og den relative luciferaseekspresjon ble oppdaget 48 timer senere. Luciferase-aktiviteten ble normalisert til Renilla luciferase-aktivitet uttrykt ved PRL-TK og deretter sammenlignet med den relative luciferase nivået av GFP-kontroll. Data ble uttrykt som betyr ± SEM, n = 3.
For å bevise vår hypotese, vi opprettet en luciferase konstruere med MIR-1228 * promoter-regionen og evaluert sin aktivitet i respons til NF-kB aktivering. Et eksperiment ble utført ved dyrking av SGC-7901-celler i 8 timer i nærvær av TNF-α (50 eller 100 ng /ml, klassisk NF-kB sti aktivator) og /eller pyrrolidin-ditiokarbamat (PDTC, 100 uM), en utbredt hemmer av transkripsjonsfaktor NF-kB [22]. SGC-7901-celler ble transfektert med pGL3-MIR-1228 * -promoter eller pGL3-kontroll, 24 timer senere transfekteres SGC-7901-celler ble eksponert i 8 timer til TNF-α med eller uten PDTC for å undersøke hvorvidt NF-kB aktiverings regulerer MIR-1228 * promoter aktivitet. Vi har observert at TNF-α behandling markert hemmet MIR-1228 * promoter-aktivitet og inhibering av NF-kB med PDTC hindret TNF-α-mediert nedregulering av de aktivitetsnivåer (Fig. 3B), noe som tyder på at NF-kB kan negativt regulere speil 1228 * uttrykk. For ytterligere å avgjøre om NF-kB subenhet c-Rel er ansvarlig for dereguleringen MIR-1228 *, transfektert vi SGC-7901 celler MIR-1228 * -promoter med eller uten GFP-c-Rel og observert en betydelig reduksjon av luciferase aktivitet i GFP c-Rel gruppen enn kontroll (fig. 3C). Samlet tyder dataene på at NF-kB subenheter c-Rel bidrar funksjonelt til nedregulering av MIR-1228 * i magekreft.
MIR-1228 * Undertrykker NF-kB aktivitet og CK2A2 Expression i SGC-7901
for å undersøke påvirkning av MIR-1228 * på NF-kB signalveien, ble NF-kB reporter konstruksjoner transfektert inn enten MIR-1228 * eller MIR-NC stabilt transfektert SGC-7901 celler og aktiviteten NF-kB luciferase ble bestemt etter 48 timer. Våre resultater viste at aktiviteten av NF-kB ble signifikant redusert ved overekspresjon av MIR-1228 * (fig. 4A), noe som indikerer en negativ tilbakekoplingssløyfe mellom MIR-1228 * ekspresjon og NF-kB aktivitet. For ytterligere å identifisere nedstrøms mål for Mir-1228 * i NF-kB vei, utførte vi bioinformatikk analyse og funnet CK2A2 var en av de antatte målgener som ble spådd. Ved hjelp av Miranda og RNA22 [23], [24], vi ligger en potensiell bindingssete for MIR-1228 * på 3’UTR av CK2A2 (Fig. 4B). CK2A2 er en underenhet av proteinkinase CK2 som er involvert i NF-kB veien [25], [26] og dens ekspresjon har blitt observert å være oppregulert i flere kreftformer, inkludert magekreft, [27], [28]. Videre undersøkelser om sammenhengen mellom CK2A2 og MIR-1228 * viste at protein nivåer av CK2A2 var samtidig nedregulert på MIR-1228 * stabil overekspresjon i SGC-7901 celler (fig. 4C). For å verifisere hvorvidt CK2A2 er et ekte mål for MIR-1228 *, ble et segment av CK2A2 3’UTR inneholdende bindingssetet klonet inn i 3’UTR av luciferasegenet i pMIR-RAPPORT plasmidet [29]. Det fluorescerende intensitet av reportergenet ble signifikant redusert i gruppen som ble ko-transfektert med pMIR-CK2A2 og MIR-1228 * sammenlignet med kontrollen (Fig. 4D). Disse resultatene antydet at Mir-1228 * samhandler med CK2A2 mRNA 3’UTR.
(A) SGC-7901-MIR-1228 * og SGC-7901-MIR-NC ble transfektert med NF-kB reporter konstruere hhv. 48 timer etter transfeksjon, ble luciferase-aktiviteten målt. Luciferase-aktiviteten ble normalisert til Renilla luciferase-aktivitet. Resultatene er midler ± SEM, n = 3. (B) Skjematisk diagram over den antatte bindingssetet av MIR-1228 * i CK2A2 spådd av Miranda. (C) Western blot analyse viste at protein nivået av CK2A2 i MIR-1228 * stabil overekspresjon SGC-7901-celler ble betydelig redusert sammenlignet med MIR-NC. Nivået av GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. (D) MIR-1228 * betydelig redusert luciferase lesing når ko-transfektert med pMIR-CK2A2 3’UTR plasmid, som indikerer samspillet mellom MIR-1228 * og CK2A2 3’UTR på dette området. Luciferaseaktiviteten ble normalisert til Renilla luciferase-aktivitet uttrykt ved PRL-TK. Data ble uttrykt som betyr ± SEM, n = 3.
MIR-1228 * Hemmer EMT
Det har blitt rapportert at aktivering av NF-kB spille en viktig rolle i EMT for kreft progresjon [30], [31], og inhibisjon av NF-kB aktivitet i visse tumorcellelinjer forårsaket en reversering av EMT [32]. Siden MIR-1228 * synes å negativt regulerer NF-kB aktivitet, vi derfor undersøkt om MIR-1228 * kan også negativt regulere EMT i magekreft. Western blot viste at overekspresjon av MIR-1228 * i SGC-7901 celler nedregulert mesenchymale markører (vimentin, β-catenin, snegle, Slug, og ZEB1 /2), mens oppregulert epitelial markør E-cadherin (Fig. 5A ). Videre MIR-1228 * overekspresjon forårsaket en nedgang på celle migrasjon (Fig. 5B-C). Immunhistokjemisk farging ble ansatt for å ytterligere bekrefte EMT-relaterte proteiner endringer av MIR-1228 * transfektert SGC-7901 celler i xenograft modell. Det ble vist at ekspresjonen av vimentin redusert og ekspresjon av E-cadherin øket sammenlignet med som i kontrollcellene (fig. 5D). Lignende funn ble observert i en annen magekreft cellelinje AGS (Fig. S1). Dataene gir det første bevis på at Mir-1228 * restaurering i magekreft regulerer EMT negativt.
(A) Western blot analyse av epitel markør (E-cadherin) og mesenchymale markører (vimentin, β-catenin, Snail , Slug, og ZEB1 /2) i MIR-1228 * stabilt transfektert SGC-7901 celler og kontroll. (B) Transwell migrasjon analysen viste at SGC-7901 celler stabilt transfektert med MIR-1228 * hadde lavere vandrende potensial i sammenligne med MIR-NC (× 100). (C) Den relative nivået av cellemigrering er presentert som gjennomsnitt ± SEM, på grunnlag av tre uavhengige eksperimenter. (D) Uttrykk for EMT-relaterte markører i xenograft tumor. Immunhistokjemisk farging indikerte redusert vimentin og økt E-cadherin uttrykk i MIR-1228 * xenograft tumor sammenlignet med kontrollgruppen (× 400).
Diskusjoner
Magekreft er den fjerde vanligste ondartet svulst over hele verden og i dag er den nest største årsaken til kreft-relaterte dødelighet [33], [34]. Selv om dagens praksis som kombinerer kjemoterapi eller strålebehandling med kirurgisk reseksjon har betydelig økt total overlevelse av magekreftpasienter, er den samlede fem års overlevelse fortsatt lav. Gastrisk karsinogenese er ansett for å være en multifaktoriell og flertrinnsprosess som involverer aktivering av onkogener og inaktivering av tumorsuppressorgener [35].
mirnas er endogene ikke-protein-kodende korte RNA som spiller viktige roller i cellulære fysiologi, utvikling, og sykdommer ved negativ regulering av genekspresjon. Analyser av miRNA ekspresjonsprofiler har vist at mange mirnas blir avvikende uttrykt og korrelert med tumorgenese, progresjon, og prognose av forskjellige hematologiske og faste tumorer inkludert magekreft [36]. Å identifisere og belyse de biologiske funksjonene mirnas deregulering i magekreft kan hjelpe oss til bedre å forstå patogenesen av denne dødelige sykdommen og gir nye muligheter til å utvikle miRNA-basert terapi. For eksempel har MIR-221 og MIR-222 er vist å være positivt å regulere gastrisk cancer celleproliferasjon og invasjon, noe som tyder på at ved å velge inhibering av disse mirnas være fordelaktig for magekreft behandlinger [37]. mirnas spille en rolle i etiologien og patogenese av en rekke kreftformer ved å målrette en rekke onkogener eller tumordempere gener. MIR-21 er overuttrykt i H. pylori-infisert gastrisk mucosa og mage kreft vev. Tvangs uttrykk for MIR-21 øker invasivitet av magekreftceller, er RECK direkte mål på MIR-21 [38]. MIR-218 hemmer invasjon og metastasering av magekreft ved å målrette den Robo1 reseptoren [39]. Ueda et al [40] identifisert 22 oppregulert og 13 nedregulert mirnas i magekreft versus ikke-tumor slimhinner, Low uttrykk for skuffelse 7g og MIR-433 og høy uttrykk for MIR-214 ble forbundet med ugunstig utfall i generelle overlevelse uavhengig av kliniske kovariater, inkludert dybde på invasjon, lymfe-node metastasering, og scenen. MIR-375 er ofte nedregulert i magekreft og fungere som en tumor suppressor å regulere magekreft celleproliferasjon potensielt ved å målrette den JAK2 onkogen [10]. Vår annen studie viste MIR-1228 * ble en epitelial kreft-relaterte miRNA (upublisert). Imidlertid har kun noen få studier av MIR-1228 * blitt rapportert. Guled et al [41] viste at Mir-1228 * ble sterkt uttrykt i maligne mesothelioma prøvene sammenlignet med normale prøver. Men den biologiske funksjonen til denne miRNA har ennå ikke blitt vurdert. I denne studien identifiserte vi at Mir-1228 * ble nedregulert i mer enn 70% av magekreft prøvene sammenlignet med sine nontumor kolleger og gi eksperimentelle bevis for at det kan fungere som en tumor suppressor gjennom negativt regulerer EMT og hemme NF -κB aktivitet.
Våre data tyder på nedregulering av MIR-1228 * i mage kreft vev og mage kreft cellelinjer. Ulike molekylære mekanismer føre til miRNA feilregulering, slik som genetisk mutasjon, epigenetisk aberrasjon og deregulert transkripsjonen aktivitet [42]. TFS kunne regulere miRNA ekspresjon ved binding til promoter-regioner, i enten fysiologiske eller patologiske kontekster [43]. For å undersøke hvordan MIR-1228 * ble deregulert i magekreft, analyserte vi den to-kb promoter regionen oppstrøms av MIR-1228 * og funnet tre mulige c-Rel bindende domener. Selv om NF-kB er best kjent for sin transkripsjonen aktivering funksjon, senere arbeider med p65, relB og c-Rel vist at NF-kB kan nedregulerer spesifikke gener [17], [44], [45]. Ved hjelp av en MIR-1228 * promoter-reporter konstruksjon som inneholdt 2-kb fragmenter av MIR-1228 * promoter, fant vi at NF-kB sti aktivator TNF-α redusert MIR-1228 * promoter aktivitet. Og NF-kB hemmer PDTC bemerkelsesverdig antagonized TNF-α-mediert MIR-1228 * promoter lav aktivitet. Våre data viser også at c-Rel var i stand til å bindes direkte med MIR-1228 * promoter og negativt regulere uttrykk. Siden c-Rel subenheten er et medlem av NF-kB-familien, NF-kB-aktivering phenocopied virkningene av c-Rel i regulering MIR-1228 * ekspresjon, noe som tyder på at NF-kB veien er negativt involvert i nedregulering av mir-1228 * i magekreft. Videre MIR-1228 * overekspresjon også ført til nedregulering av NF-kB aktivitet. Derfor våre data skissere en dobbel negativ feedback loop mellom NF-kB og MIR-1228 *. Den eksakte mekanismen for hvordan dette negativ tilbakekopling oppstår behov for å bli ytterligere undersøkt.
CK2A2 er en underenhet av proteinkinase CK2, som er et sterkt konservert og allestedsnærværende protein serin /treonin kinase. Overekspresjon av CK2 er blitt observert i en rekke kreftformer, inkludert de av melkekjertlene, prostata, nyre, lunge, hode og hals og mage [27], [46]. Overekspresjon av CK2 i brystkjertlene til transgene mus fører til hyperplasi og dysplasi som til slutt fører til adenokarsinomer [47]. CK2 ble overexpressed i hodet og nakke plateepitelkarsinom linjer og vev. Knockdown av CK2 subenheter forskjellig hemmet IκBα degraderings, NF-kB kjernefysiske lokalisering, fosforylering, DNA-binding, og reporter aktivitet [25]. CK2 spiller en viktig rolle i HER-2 /neu signalering, fremme IKB degradering og NF-kB aktivering [26]. I denne studien viste vi at MIR-1228 * redusert ekspresjon av CK2A2 på proteinnivået. Den luciferase assay med en reporter som inneholder MIR-1228 * bindende sekvens på 3’UTR av CK2A2 mRNA antydet at Mir-1228 * direkte rettet mot 3’UTR av CK2A2. Samlet utgjør disse dataene indikerer at undertrykkelsen av NF-kB aktivitet ved MIR-1228 * kan være gjennom målretting CK2A2 uttrykk. EMT er nå alle kjent for å forekomme i en rekke sykdommer, inkludert utviklingen av kreft. Det erkjennes at EMT er en viktig prosess for å danne diffus histologi og initiere metastase ved å øke bevegeligheten av tumorceller [48]. EMT er regulert ved forskjellige onkogene signaliseringsreaksjonsveier slik som AKT og NF-kB [49], [50]. Nærmere bestemt, aktivering av NF-kB er blitt vist å fremme EMT mens hemming av NF-kB aktivitet i mesenchymale celle bevirker en reversering av EMT [30]. Tap av E-cadherin uttrykk og gevinst på vimentin uttrykk anses å være de viktigste molekylære markører for EMT [51].
