Abstract
Bakgrunn
Autophagy har paradoksale og komplekse funksjoner i kreftutvikling, og autofagi relatert gener (ATG) er viktige regulatorer i autofagi. Inntil nå har mer enn 30 forskjellige ATG proteiner blitt identifisert i gjær, og deres pattedyr kolleger har også blitt rapportert. Selv om rollene til noen ATG proteiner i kreft har blitt karakterisert, er rollen til ATG10 nesten helt ukjent.
metodikk /hovedfunnene
For å undersøke clinicopathological rolle ATG10 i tykktarmskreft, vi analysert ATG10 uttrykk i kolorektal kreft vev og cellelinjer. Proteinekspresjon analyse viste at ATG10 er sterkt øket i kolorektal cancer (tissue – 18/37 tilfeller, 48%; cellelinje -8/12 cellelinjer, 66%). Immunhistokjemisk analyse med clinicopathological egenskaper indikerte en sterk forening av oppregulering av tumor ATG10 med lymfeknutemetastase (p = 0,005) og invasjon (p 0,001). Videre begge 5 års sykdomsfri overlevelse og total overlevelse av pasienter som har svulster som ikke uttrykker ATG10 var betydelig høyere enn de av pasientene som bærer ATG10-uttrykker svulster (p = 0,012).
Konklusjon /Betydning
Økt uttrykk for ATG10 i tykk- og endetarmskreft er assosiert med lymphovascular invasjon og lymfeknutemetastase som indikerer at ATG10 kan være en potensiell prognostisk maker i kolorektalkreft
Citation. Jo YK, Kim SC, Park IJ Park SJ, Jin DH, Hong SW, et al. (2012) økt uttrykk av ATG10 i tykktarmskreft er assosiert med Lymphovascular Invasion og lymfeknutemetastase. PLoS ONE 7 (12): e52705. doi: 10,1371 /journal.pone.0052705
Redaktør: Henrik Einwaechter, Klinikum rechts der Isar der TU München, Tyskland
mottatt: 23. mars 2012; Godkjent: 19 november 2012; Publisert: 20.12.2012
Copyright: © 2012 Jo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Senter for utvikling og kommersialisering av Anti-Cancer Therapeutics og den koreanske Helse 21 R D Project (A062254 og A102059, Helsedepartementet, velferd og familiedepartementet, Korea), den Asan Institute for miljø- og biovitenskap (2011-069 ), og Basic Science Research Program (2010-0009164, National Research Foundation, Korea). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ubiquitin /26S proteasomet system er en av de store banene som regulerer protein omsetning i cellene. Autophagy er mekanismen i stor grad ansvarlig for fjerningen av langlivede proteiner og bulk omsetning av cytosoliske komponenter. Autophagosomes er dobbelt-membran vesikler som sluker målet underlag og sikring med lysosomer å produsere autolysosomes [1]. Autophagosome dannelse er regulert av en familie av evolutionally konservert autofagi relaterte genet (ATG) proteiner [2], [3].
Ubiquitin (Ub) konjugering er en godt koordinert hendelse som krever E1, E2, og E3 enzymer [4]. To proteinkonjugering systemer, som er lik de som er involvert i protein ubiquitylation, er nødvendig for autophagic vesikler [3]. ATG7 fungerer som en E1-lignende aktivere enzymet, binding til ATG8 /LC3 eller ATG12. Aktivert ATG8 eller ATG12 blir deretter overført til E2-lignende konjugering enzymer, ATG3 og ATG10. Endelig er det ATG8-fosfatidyletanolamin (PE) og ATG12-ATG5 konjugater dannet. De ATG12-ATG5 konjugerte danner et kompleks med ATG16 til å opptre som en E3-enzym for den ATG8-PE-konjugat, som binder til autophagosome membranen gjennom en lipidering reaksjon [2]. Mutasjoner i bindingsstedene for ATG7 og ATG10 forhindre dannelsen av ATG12-ATG5 konjugat [5]. Fordi autophagy er involvert i mange cellulære prosesser og homeostase, deregulering av dette systemet synes å spille en rolle i mange humane patofysiologiske tilstander som nevrodegenerativ sykdom, type 2 diabetes, smittsomme sykdommer, medfødte immunsykdom, så vel som kreft [6].
i likhet med andre sykdommer, er rollen til autophagy i kreft er ganske komplisert. Nylige studier har vist at nedregulering av ATG-gener (eller deres regulatorer) direkte eller indirekte akselerere tumorutvikling [7], [8]. Videre redusert autophagy forbedrer nekrose-avhengig inflammasjon, for ytterligere å fremme tumorutvikling [9]. Imidlertid har andre studier antydet at økt autofagi kan også bistå svulst utvikling. Faktisk, fremmer autofagi celle overlevelse etter påkjenninger ved å regulere metabolske homeostase. Tumorceller har til å overleve i hypoksi og dissosiasjon fra omgivende celler. Således autophagy kunne fremme tumordannelse og metastase ved å øke tumorcelleoverlevelse [7], [10]. Hittil har mer enn 30 forskjellige ATG proteiner blitt identifisert i gjær, og deres pattedyr kolleger også har også blitt rapportert [5], [11]. Selv om rollene til noen ATG proteiner i kreft har blitt karakterisert, er rollen til ATG10 nesten helt ukjent. Her vurderte vi sammenhengen mellom ATG10 uttrykk og clinicopathological funksjoner i sporadisk kolorektal kreft. Våre funn viser at økt ATG10 uttrykket er sterkt assosiert med lymfeknutemetastase og lymphovascular invasjonen i tykk- og endetarmskreft.
Resultater
ATG10 Up-regulering i tykktarmskreft
For å evaluere ATG10 uttrykk i tykktarmskreft, vi først analysert med kolorektal kreft vev ved Western blot. Tumorvev og deres omkringliggende normale vev ble oppnådd ved tidspunktet for kirurgi. Resultatet viste at ATG10 ekspresjon i tumorer var signifikant høyere enn den til den tilstøtende normal slimhinne. ATG10 ble økt i 18 av de 37 tilfellene (48%) av tykk- og endetarmskreft (Fig. 1a). Vi deretter undersøkt ATG10 uttrykk i kolorektal cellelinjer. I samsvar med resultatene oppnådd ved anvendelse av tumorvev, ATG10 ekspresjon var høyere i cancercellelinjer, inkludert AMC5, LoVo, SW480, SW48, HCT15, DLD1, RKO og CaCo2 enn i den CCD841 normal kolorektal cellelinje (Fig. 1b). Tatt sammen indikerer disse resultater at ATG10 er oppregulert i kolorektal cancer
(a) ATG10 ekspresjon i kolorektale vev ble undersøkt ved Western blot-analyse (n = 37;. T, tumorvev, N, tilsvarende normal vev). ATG10 ekspresjon var normalisert til aktin uttrykket (n = 37). (B) Western blot analyse av ATG10 uttrykk i flere kolorektal cellelinjer (Normal – CCD841; Cancer – HCT116, HT29, KM12C, WiDr, LoVo, SW480, SW48, HCT15, DLD1, RKO, CaCo2). ATG10 uttrykk ble kvantifisert ved densitometri.
Forholdet mellom ATG10 Expression og tumorprogresjon og Invasion
Vi undersøkte rollen ATG10 i tumorprogresjon og invasjon videre. For å undersøke clinicopathological funksjoner, ble immunhistokjemisk analyse av en vev matrise med 127 kolorektal kreft prøver utført (fig. 2 og tabell 1). Vev uten flekker eller svak farging (≤10%) ble kategorisert som negativ (-). Vev med 10% farging ble kategorisert som positive (+). Tretti av de 127 vevsprøver (24%) viste ATG10 uttrykk. Forholdet mellom ATG10 ekspresjonssystemer og clinicopathological egenskaper er vist i tabell 2. Resultatene viste at ATG10 ekspresjon var sterkt assosiert med lymphovascular invasjon (
P
0,001) og lymfeknutemetastase (
P
= 0,005). Imidlertid ATG10 ekspresjon ble ikke signifikant assosiert med alder, kjønn, tumorsetet, serum carcinoembryonic antigen, eller tumor proliferasjon. Disse resultatene viser at ATG10 uttrykket er sterkt assosiert med lymphovascular invasjonen i tykk- og endetarmskreft.
ATG10 uttrykk mønster i kolorektalkreft ble bestemt ved immunhistokjemisk analyse av en vev microarray. (A og b) Negative prøver (-) med ≤10% farging (200), (c og d) Prøver med 10% til 50% farging (+, x 200), og (e og f) eksemplarer med 50 % farging (+, × 200).
Forholdet mellom ATG10 Expression og pasientoverlevelse
Resultatene av immunhistokjemisk analyse viste at ATG10 er nært knyttet til tumorinvasjon, som er kjent risikofaktor for tilbakefall og overlevelse utfall. Derfor vurderte vi sammenhengen mellom ATG10 uttrykk og satsene for 5-års sykdomsfri overlevelse (DFS) og total overlevelse (OS) i kolorektal pasienter. De fem-års DFS og OS forekomst av pasienter som har svulster som ikke uttrykker ATG10 var betydelig høyere enn de av pasientene som bærer ATG10-uttrykker tumorer (5-årig OS [gjennomsnitt ± SEM], 76,4 ± 0,4%
vs.
57,5 ± 0,1%,
P
= 0,012;. 5 års DFS, 75,8 ± 0%
vs
42,8 ± 0,1%,
P
= 0,012) ( fig. 3). Disse resultatene antydet at ATG10 kan være en potensiell prognostisk maker i tykk- og endetarmskreft. I en multivariat analyse med potensielle overlevelses variabler, lymfeknutemetastase alene var signifikant assosiert med overlevelse parametere, mens ATG10 uttrykk var ikke (Hazard Ratio, 4,736
vs
1,404;. 95% konfidensintervall, 1,763 til 12,723
vs
0,676 til 2,916;.
P
= 0,002
vs
0,363)
forholdet mellom ATG10 uttrykk og 5 års sykdomsfri overlevelse (. DFS) og total overlevelse (OS) forekomst av kolorektal kreftpasienter ble analysert ved Kaplan-Meier-kurver.
nedregulering av ATG10 Trykt Cell Proliferation i kolorektal kreft celler
Vi videre undersøkte effekten av nedregulering av ATG10 på celleformering i HCT116-celler. Uttømming av ATG10 ekspresjon av RNA-interferens lett undertrykkes celleproliferasjon hastighet i HCT116-celler, hvilket antyder at ATG10 har funksjonell rolle i celleproliferasjon (fig. 4).
HCT116-celler ble transient transfektert med enten egge negativ siRNA (Scram) eller ATG10 spesifikk siRNA (siATG10) deretter celleformeringshastigheten ble daglig bestemt ved anvendelse av en CCK-8 assay kit (a). Nedregulering av ATG10 ved siRNA ble bekreftet med Western blot-analyse (b). Data er representert ved gjennomsnitt ± SEM (n = 3).
diskusjon
Autophagy styres av ATG-proteiner og deres regulatorer [5], [8]. ATG proteiner initiere autophagosome formasjonen gjennom autophagic konjugering system [2]. Rollen til ATG6 i kreft har blitt karakterisert. Tidligere studier har rapportert at redusert ATG6 uttrykk fremmer tumordannelse i dyremodeller, og ATG6 er nedregulert i ulike kreft hos mennesker [12] – [15]. Imidlertid er rollen til andre ATG proteiner i tumorigenesis ikke godt forstått.
I denne studien evaluerte vi ATG10 uttrykk hos pasienter med sporadisk kolorektal kreft. ATG10 er et E2-lignende enzym som er involvert i Ub-lignende modifikasjon, som er avgjørende for autophagosome formasjonen. Tidligere studier har rapportert at flere over-uttrykte Ub-E2-lignende proteiner fremme tumorutvikling i forskjellige cancere [16] – [18]. Imidlertid er rollen til ATG10 i kreft har ikke enda blitt evaluert. I motsetning ATG6, som er nedregulert i kreft, de foreliggende resultatene indikerer at ATG10 økes i tykk- og endetarmskreft. Videre ATG10 uttrykk var sterkt assosiert med tumorinvasjon og metastasering. Våre funn tyder på at ATG10 kan være et onkogen protein. Vi evaluerte også effekten av ATG10 over-ekspresjon på celleproliferasjon og i en mus xenograft modell ved hjelp av RKO carcinoma celler som stabilt uttrykker ATG10. Celleproliferasjon og tumorvekst ble ikke signifikant påvirket av ektopisk uttrykk for ATG10 (data ikke vist). Men knock-down av ATG10 uttrykk med siRNA trykt celleproliferasjon sats i HCT116 cellene. Derfor fortsetter vi å undersøke effekten av oppregulert ATG10 på tumorigenesis.
Genetiske endringer er ansvarlig for økt uttrykk av mange onkogene proteiner. Den kromosomale regionen ATG10 (5q14) er ofte tapt i eggstokkreft, magekreft, og brystkreft [19], [20]. Imidlertid har de siste genom-wide DNA microarray studier viste at 5q14 regionen forsterkes i neurofibrosarcoma og bukspyttkjertelkreft [21], [22]. Kopier nummer variasjoner på 5q14 i kolorektal kreft er ikke godt forstått. Dermed fremtidige studier er nødvendig for å fastslå allele endringer på dette locus i tykk- og endetarmskreft.
Autophagy synes å ha to funksjoner i kreft. Spesielt kan tidspunktet for autophagy være viktig for tumorutvikling. I det tidlige stadium av tumorgenese, synes autophagy til å fungere som en tumor suppressor. Som et resultat av inhibering av autophagy øker DNA-skade, kromosomale endringer så som alleliske tap og forsterkning, og oksidativt stress, noe som kan føre til onkogene arrangementer [23], [24]. Men autofagi fremmer også tumorigenesis. Autophagy induksjon av løsrivelse fra ekstracellulære matrise assists svulst celle overlevelse under anoikis, noe som bidrar til spredning og metastasering [25], [26]. I samsvar med disse tidligere studiene våre resultater viste at ATG10 uttrykket er nært forbundet med lymphovascular invasjon og lymfeknutemetastase i tykk- og endetarmskreft. Disse funnene kan forklares ved tilkobling av tumor-erstattet noder eller intravaskulære tumor aggregater med systemiske lymfeknuter via lymphovascular kanaler [27], [28]. Tumor invasjon og metastasering er kjente risikofaktorer for tilbakefall og overlevelse utfallet. Ifølge denne oppfatningen, fant vi at ATG10 uttrykk i svulster var assosiert med lavere overlevelse. Imidlertid bør forholdet mellom ATG10 uttrykk og kliniske resultater bekreftes med en større kohort å bedre forstå hvilken rolle ATG10 i kreft.
I konklusjonen, ATG10 oppregulering i kolorektal kreft er nært forbundet med lymphovascular invasjon og lymfeknutemetastase, noe som indikerer at ATG10 kan være nyttig som en prognostisk markør og som et terapeutisk mål i tykk- og endetarmskreft.
Materialer og metoder
Pasienter og vevsprøver
For å evaluere ATG10 uttrykk, 37 kolorektal kreft vevsprøver ble tilfeldig valgt ut fra arkiv prøver fra resections utført mellom juni 1999 og mai 2003 på Asan Medical Center (Seoul, Korea). For den påfølgende klinisk validering av differensial protein uttrykk mønstre, evaluert vi vevsprøver fra totalt 124 pasienter med sporadisk kolorektal kreft, inkludert påfølgende pasienter som gjennomgikk reseksjon med kurativ hensikt (R0 reseksjon, n = 119; R1 reseksjon, n = 5) (tabell 1). Pasienter med arvelig nonpolyposis tykktarmskreft eller familiær adenomatøs polypose ble ekskludert, som var de som gjennomgikk preoperativ chemoradiation terapi. Gjentakelse, inkludert regionale og fjernmetastaser, skjedde i 22 av 124 pasienter (17,7%) som gjennomgikk kurativ reseksjon under oppfølging (gjennomsnitt, 58 måneder, utvalg, 3-123 måneder). Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke, og studieprotokollen ble godkjent av IRB (Institutional Review Board), i samsvar med Helsinkideklarasjonen.
Cellelinjer og reagenser
CCD841 celler var vennlig gitt av Dr. SY Rha (Yonsei University, Seoul, Korea) [29]. Den AMC5-cellelinjen ble avledet som tidligere beskrevet [30]. Og andre kreftcellelinjer som HCT116, HT29, KM12C, WiDr, LoVo, SW480, SW48, HCT15, DLD1, RKO og CaCo2 ble kjøpt fra ATCC (Manassas, Virginia). Alle celler ble dyrket ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator og opprettholdt i RPMI1640 medium inneholdende 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA).
Western blot analyse
proteiner fra vev og celler ble fremstilt ved anvendelse av protein-prøvebuffer (62,5 mM Tris-HCl, 25% glycerol, 2% SDS, 5% 2-merkaptoetanol, 0,01% bromfenolblått) (BioRad, Hercules, CA). Proteiner (ca. 50 ug) ble kvantifisert ved anvendelse av Bradford-oppløsning (BioRad) i henhold til fremstilling instruksjon og deretter, separert med SDS-polyakrylamid-gel-elektroforese og overført til polyvinylidenfluorid membraner (BioRad). Membranene ble inkubert med primære antistoffer mot ATG10 (1:3000; MBL, Nagoya, Japan) og aktin (1:10,000; Chemicon International, Temecula, CA). Membranene ble deretter inkubert med pepperrot peroksidase-konjugert sekundære antistoffer. (1:5000, Pierce, Rockford, IL)
immunhistokjemisk farging
Tissue array-blokkene ble utarbeidet med en presisjonsinstrument (Beecher Instruments Sun Prairie, WI). Immunhistokjemisk farging basert på den streptavidin-biotin-metoden ble utført ved anvendelse av et Dako LSAB kit (Dako, Carpinteria, CA) med monoklonale antistoffer ATG10 (MBL). Svak farging (≤10%) og ingen farging ble scoret som negativ (-), og 10% farging ble scoret som positive (+). Prøver med negativ immunkjemiske farging ble undersøkt to ganger for å bekrefte resultatene.
Cell Proliferation Assay
Liten interfering RNA for ATG10 (siATG10, siGENOME SMART basseng) og egge kontroll ikke-måls siRNA (Scramble) ble syntetisert ved Dharmacon, Inc. (Thermo Scientific, Chicago, IL). HCT116-celler ble transfektert med 0,5 pmol /l siATG10 eller kryptert siRNA med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Deretter formeringshastigheten ble målt ved anvendelse av en celleformering analysesett (CCK-8) i henhold til produsentens protokoll (Dojindo Corporation, Japan). Kort sagt ble celler i 96-brønns plate blandet med 10 ul av CCK-8-løsning, og ble deretter inkubert i en time i en CO
2 inkubator. Den påfølgende kolo endringen ble målt ved hjelp av en Victor mikrotiterplateleser (PerkinElmer) satt til å overvåke endringer i absorbans ved 450 nm.
Statistical Analysis
Cross-tabellen analyse ved hjelp av Fishers eksakte test med to- sided Verifikasjonen ble brukt til å sammenligne immunhistokjemiske funn i henhold til de clinicopathological funksjoner og tilbakefall forekomsten av pasienter. Primære endepunktene var tilbakefall, 5-års DFS, og 5-års OS. Overlevelse ble sammenlignet med Kaplan-Meier metoden med log-rank test, og potente overlevelsesfaktorer ble bekreftet ved hjelp Cox regresjonsmodell. Den signifikansnivå på 5% ble valgt for hver analyse. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS (versjon 19, SPSS Inc., Chicago, IL).
