Abstract
forekomst og dødelighet av tykk- og endetarmskreft (CRC) er høyere i afrikanske amerikanere (AA) enn andre etniske grupper i USA , men årsakene til forskjellene er ukjent. Vi utførte genuttrykk profilering av sporadisk CRC fra AAs vs. europeiske amerikanere (EAS) for å vurdere bidraget til CRC ulikheter. Vi evaluerte genuttrykket av 43 AA og 43 EA CRC svulster matches av scenen og 40 matchende normale kolorektal vev ved hjelp av Agilent menneske hele genomet 4x44K cDNA arrays. Gene og sti-analyser ble utført ved hjelp Betydningen Analyse av mikromatriser (SAM), Ten-fold kryssvalidering, og oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA). SAM avdekket at 95 gener ble uttrykt forskjellig mellom AA og EA pasienter på en falsk funnrate på ≤5%. Ved hjelp av IPA vi fastslått at mest fremtredende sykdom og sti sammenslutninger av forskjellig uttrykt gener relatert til betennelser og immunrespons. Ten-fold kryssvalidering vist at følgende 10 gener kan forutsi etnisitet med en nøyaktighet på 94%: CRYBB2, PSPH, ADAL, VSIG10L, C17orf81, ANKRD36B, ZNF835, ARHGAP6, TRNT1 og WDR8. Uttrykk av disse 10 genene ble validert ved QRT-PCR i en uavhengig test sett av 28 pasienter (10 AA, 18 EA). Våre resultater er den første til å implisere differensial genuttrykk i CRC rasemessige ulikheter og indikere fremtredende forskjell i CRC betennelse mellom AA og EA pasienter. Forskjeller i mottakelighet for betennelse støtter eksistensen av distinkte tumor microenvironments i disse to pasientpopulasjoner
Citation. Jovov B, Araujo-Perez F, Sigel CS, Stratford JK, McCoy AN, Yeh JJ et al. (2012) Differential Gene Expression mellom afrikansk-amerikanske og europeiske amerikanske pasienter med kolorektal kreft. PLoS ONE 7 (1): e30168. doi: 10,1371 /journal.pone.0030168
Redaktør: Hassan Ashktorab, Howard University, USA
mottatt: 30 mars 2011; Godkjent: 15 desember 2011; Publisert: 19 januar 2012
Copyright: © 2012 Jovov et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av bevilge midler for Gastrointestinal Specialized Program for fremragende forskning (GI SPORE, P50 106 991) og ved University of North Carolina Senter for Gastrointestinal biologi og sykdom (CGIBD, P30 DK 34987). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er fortsatt den vanligste gastrointestinal kreft i USA, til tross for de siste forbedringer i diagnostikk og behandling av sykdommen. Forekomst og dødelighet av CRC for afro-amerikanere (AA) er høyere enn i USA befolkningen [1], [2]. Mange epidemiologiske og genetiske undersøkelser har fokusert på AAs [3], [4], [5], [6] med mål om å tyde årsakene til slike forskjeller. Mens man ikke kan se bort fra bidraget av sosioøkonomiske faktorer, så som en mer avansert stadium av sykdom ved diagnose i AAs, andre biologiske faktorer bidrar også til progresjon av kreft i tykktarmen [4]; [7]. Det gjenstår imidlertid et biologisk basis for eksistensen av en mer aggressiv CRC i afrikanske amerikanske pasienter for å bli ytterligere belyst. Genomisk ustabilitet er en viktig funksjon i tumor utvikling, og det er minst 3 forskjellige baner i CRC patogenesen: kromosom ustabilitet (CIN), mikro ustabilitet (MSI), og CpG island methylator fenotype baner (CIMP) [8], [9]. Noen eller alle av disse banene kan bidra til en mer aggressiv CRC biologi i afrikanske amerikanere. Nye genom-wide assosiasjonsstudier i CRC har vist ikke bare sterke bevis for felles enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) foreningen i en rekke gener og kromosomale regioner, men også genetisk heterogenitet i CRC foreningen i AAs versus EAs [4], [10] , [11], [12], [13]. Ulik forekomst av MSI og annet nivå av metylering for funksjonelt svært relevante gener ble også rapportert som en mulig faktorer i CRC rasemessige forskjeller [8], [14], [15].
Vi antok at genuttrykk profiler av CRC i afrikansk-amerikansk og europeisk-amerikanske pasienter kan avdekke biologiske forskjeller mellom de to populasjoner som kan forklare den mer aggressiv kreft fenotype i afrikansk-amerikanere. Derfor utførte vi genom-wide genuttrykk profilering i et stort sett med tumorprøver som ble matchet for utvalgte kliniske variabler. Vi analyserte resultatene på gen- og sti nivåer for å identifisere viktige forskjeller i tumorbiologi mellom afrikansk-amerikansk og europeisk-amerikanske pasienter.
Metoder
Pasienter
Ett hundre og fjorten tumorer (86 inkludert i opprinnelige analysen og 28 for valideringsstudie) og 40 normalt vev fra avidentifiserte CRC pasienter ble hentet fra Institutional Forsk (IRB) godkjente University of North Carolina (UNC) vev anskaffelser Facility etter UNC School of Medicine IRB godkjenning for denne studien. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter. Alle prøver ble samlet mellom 1999 og 2008 ved tidspunktet for operasjonen og hurtigfrosset i flytende nitrogen. Pasienter med kjent familiær adenomatøs polypose og arvelig non-polypose CRC ble ekskludert. De identifiserte data inkludert rase, tumor, node og metastase (TNM), klasse eller differensiering, margin status, og overlevelse var tilgjengelige for de fleste pasienter.
RNA Isolation og Microarray Hybridisering
all RNA isolering og hybridisering ble utført på Agilent (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) DNA-mikromatriser menneskelig hele genom 4X44 K ved UNC. RNA ble ekstrahert fra macrodissected snap-frosset tumorprøver ved hjelp av alle prep Kits (Qiagen, Valencia, CA) og kvantifisert ved hjelp av Nanodrop spektrofotometri (ThermoScientific, Wilmington, DE). RNA kvalitet ble vurdert med bruk av Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). RNA ble valgt for hybridisering ved anvendelse av RNA integritet nummer og ved inspeksjon av 18S og 28S ribosomalt RNA. Ligner RNA kvalitet ble valgt på prøvene. Ett mikrogram RNA ble anvendt som et templat for cDNA-preparat før hybridisering til Agilent 4X44 K hele humane genom matriser. cDNA ble merket med Cy5-dUTP og en referansekontroll (Stratagene; Katalognummer # 740000; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, [16] ble merket med Cy3-dUTP hjelp av Agilent lav RNA innspill lineær forsterkning kit og hybridisert over natten ved 65 ° C til Agilent 4X44 K hele menneskets genom arrays. arrays ble vasket og skannet en Agilent scanner (Agilent Technologies, Santa Clara, CA).
Alle microarray data er i MIAME kompatibel form og rå og bearbeidet data har blitt deponert i Gene Expression Omnibus (GEO), se https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/, tiltredelse nummer. GSE28000
Microarray og statistisk analyse
alle array-data ble normalisert ved hjelp av LOWESS normalisering. data ble ekskludert av gener med dårlig flekk kvalitet eller gener som ikke har en midlere intensitet større enn 10 for en av de to kanaler (grønn og rød) i minst 70% av forsøkene. den log2 forholdet mellom den midlere røde intensitet over midlere grønn intensitet ble beregnet for hvert gen, etterfulgt av LOWESS normalisering [17]. Manglende data ble tilregnet med k-nærmeste naboer imputering (KNN) med k = 10 [18]. Gener som var signifikant opp- eller ned-reguleres ble identifisert ved hjelp av Betydningen Analyse av mikromatriser (SAM) [19]. SAM tildeler en poengsum for hvert gen på grunnlag av en forandring i genekspresjon i forhold til standardavviket for gjentatte målinger. For genene med score større enn en justerbar terskel, bruker SAM permutasjoner av de gjentatte målinger for å anslå hvor stor prosentandel av gener identifisert ved en tilfeldighet – den falske funnraten (FDR). Analyseparametere (Delta) ble satt til å resultere i FDR≤5%.
Nettverk og genet ontologi analyse
Forskjellig uttrykte gener ble undersøkt for nettverk og genet funksjonelle sammenhengen av oppfinnsomhet Pathways Analysis (IPA) programvare (Oppfinnsomhet Systems, www.ingenuity.com;. [20] IPA skanner sett av input gener å identifisere nettverk ved hjelp av oppfinnsomhet Pathways Knowledge Base for interaksjon mellom identifiserte «Focus Genes «, i denne studien, differensielt uttrykte gener mellom AA og EA og kjente og hypotetiske samspill gener som er lagret i kunnskapsgrunnlaget i IPA programmet ble brukt til å generere et sett av nettverk med en maksimal nettverksstørrelse på 35 gener /proteiner. Networks vises grafisk som gener /genprodukter ( «noder») og de biologiske forholdet mellom nodene ( «kanter»). Alle kanter er fra kanonisk informasjon som er lagret i oppfinnsomhet Pathways kunnskapsbase. i tillegg IPA beregner en poengsum for hvert nettverk i henhold til tilpasning av brukerens settet av betydelige gener. Stillingen indikerer sannsynligheten for Focus Gener i et nettverk fra Oppfinnsomhet kunnskapsbase blir funnet sammen på grunn av tilfeldigheter. En score på 3, som cutoff for å identifisere genet nettverk, indikerer at det er bare en 1/1000 sjanse for at fokus genene er vist i et nettverk skyldes tilfeldigheter. Derfor en score på 3 eller høyere indikerer en 99,9% sikkerhet for å utelukke tilfeldig sjanse.
Ten-fold Cross Validation (Ten-f-CV)
Ten-f-CV-analyse [ ,,,0],21] ble brukt til å velge mindre representativt sett av gener for valideringsstudie av QRT-PCR. Ved bruk av ti-f-CV analyse vi identifisert 10 gener som kan forutsi etnisk av pasienten som rekken ble utført med en feilrate på 6%, noe som antyder at disse 10 gener er representative for hele genet listen.
kvantitativ real-time PCR
Validering av microarray resultater ble utført på 28 CRC pasienter (10 AA og 18 EA). Ti differensielt uttrykte gener (identifisert av SAM og utvalgte hjelp av Ten-f-CV-metoden) ble validert ved QRT-PCR. Den hydroxymethylbilane syntase (HMBS) genet fungerte som husholdningsgenet [22]. QRT-PCR ble utført i duplikater ved hjelp SYBR Grønn genuttrykk Analyser (Applied Biosystems, Ster City, CA), som inkluderer pre-optimalisert primer setter spesifikke for de genene blir validert [23]. De validerte genene var: Krystallinsk, beta B2 (CRYBB2), fosfoserin- fosfatase homolog (PSPH), Adenosindeaminase-lignende (ADAL), V-set og immunoglobulin domene som inneholder 10 som (VSIG10L), kromosom 17 åpen leseramme 81 (C17orf81) , Ankyrin gjenta domene 36B (ANKRD36B). Sink finger protein 83 (ZNF83), Rho GTPase aktivere protein 6 (ARHGAP6), WD gjenta domene 8 (WDR8), tRNA nucleotidyl transferase, CCA-tilsette, 1 (TRNT1), og HMBS. Data ble samlet inn ved hjelp av ABI PRISM 7500 sekvens deteksjonssystem (Applied Biosystems, Forster City, CA). QRT-PCR data for hver prøve ble normalisert ved hjelp av uttrykket av husholdningsgenet HMBS. Grafer fremstilt fra normalisert data i forhold til HMBS. Statistisk analyse av disse dataene ble utført med en tosidig
t
-test eller med en tosidig Wilcoxon rank sum test hvis uttrykket dataene ikke følger normalfordeling.
Resultater
Identifikasjon av forskjellig uttrykt gener mellom AA og EA CRC pasienter
pasientkarakteristikker for 43 AA og 43 EA pasienter ble matchet av TNM staging (tabell 1). De to populasjoner var lik i alder, kjønn og tumorlokalisasjon. Førti ikke-tumor kolon vev (13 Aas og 27 EAS) ble brukt til genetiske sammenligninger av normal tykktarm genuttrykk mellom Aas og EAs.
Sammenligningen av genuttrykk profiler fra AA og EA svulster ved hjelp av SAM avslørt 95 genet transkripsjoner å bli uttrykt forskjellig mellom de to gruppene på FDRs av ≤5%. Femti-åtte gener ble opp regulert (tabell 2) og 37 nedregulert (tabell 3) i svulst Aas. Vi brukte Oppfinnsomhet Pathway Analysis å vurdere sykdom og sti sammenslutninger av disse 95 gener som var forskjellig uttrykt i CRC svulster ved rase. Sykdommen foreningen Analysen avdekket sammenslutninger av forskjellig uttrykt gener med genetiske veier som er knyttet til betennelsesreaksjon, leverlidelse, utviklingsforstyrrelser, genetiske lidelser og nevrologiske sykdommer (tabell S1). De seks øverste tilhørende trasé for differensielt uttrykte gener er vist i fig. 1. Tre av disse seks banene er relatert til betennelses og immunrespons. Differensielt uttrykte gener i de fem høyeste poeng nettverk er vist i Tabell 4. Topp forbundet nettverksfunksjoner for ulikt uttrykte gener var: 1) organismeskader og misdannelser, genekspresjon, cellulær utvikling 2) lipid metabolisme, lite molekyl biokjemi, molekylær transport 3) cellular montering og organisasjon, organutvikling, karbohydrat metabolismen 4) antigen presentasjon og betennelsesreaksjon, cellulær bevegelse 5) atferd, fordøyelsessystemet utvikling og funksjon, endokrine system utvikling og funksjon. En av disse nettverkene (nettverk 4, antigen presentasjon og inflammatorisk respons) er grafisk vist på fig. 2. Syv av de ni gener i dette nettverket var opp regulert i AA-pasienter (HLA-DQB1, IL33, Pak2, PROKR1, SAA2, TLR4, ZNF234), og to gener ble nedregulert (DHX58, IL27).
Y-aksen er en invers indikasjon på p-verdi eller betydning. The Threshold linjen markerer p = 0,05. (Merk at tre av seks topp trasé som vises er relatert til betennelser og immunrespons).
Røde symboler er tildelt for oppregulert og grønt for nedregulert gener. Node form svarer til den funksjonelle rolle av molekyler som vist i tegnforklaringen. Direkte eller indirekte samhandling er vist av komplette eller stiplede linjer.
Vi har også utført SAM analyse ved hjelp av ikke-tumor kolon vev fra AA og EA pasienter og ikke se differensial genuttrykk (data ikke vist), noe som tyder på at de endringene vi identifisert er svulstens mikromiljø bestemt.
Validering av microarray resultater
for å velge en representativ gruppe av gener for QRT-PCR validering av forskjellig uttrykt gener mellom AA og EA CRC pasienter, utførte vi en 10-fold kryssvalidering analyse som resulterte i valg av følgende ti gener: CRYBB2, PSPH, ADAL, VSIG10L, C17orf81, ANKRD36B, ZNF835, ARHGAP6, TRNT1 og WDR8.
uttrykk av disse ti gener ble validert ved QRT-PCR på et uavhengig testsett av 28 CRC pasienter (10 AA og 18 EA). QRT-PCR-resultater er vist i fig. 3. To av de 10 differensielt uttrykte gener var oppregulert i AA vs. EA CRC pasienter; CRYBB2, p = 0,0004 og PHSP, p = 0,001 (Fig 3;. Panel A.). Åtte ble nedregulert i AA vs. EA CRC pasienter; VSIG10L, p = 0,015; C17orf81, p = 0,032; WDR8, p = 0,002; TRNT1, p = 0,004; ANKRD36B, p = 0,044; ARHGAP6, p = 0,049; ADAL, p = 0,074; ZNF83, p = 0,11; (Figur 3;. Panel B.). Retning av endring (opp eller ned forskrift) for QRT-PCR validerte gener var i overensstemmelse med SAM resultater. Åtte av ti gener i QRT-PCR valideringsstudie nådd et statistisk signifikant nivå (p 0,05; CRYBB2, PSPH, C17orf81, ANKRD36B, VSIG10L, WDR8, TRNT1 og ARHGAP6).
Panel A. Uttrykk for to oppregulert gener i afroamerikanske pasienter med kolorektal kreft: CRYBB2, PSPH. Panel B. Uttrykk av åtte nedregulert gener i afroamerikanske pasienter med kolorektal kreft: ARHGAP6, VSIG10L, C17orf81, ZNF83, ANKRD36B, ADAL, WDE8 og TNRT1. Poeng er relative Ct-verdiene for de enkelte prøver; horisontale linjer er middelverdier for prøvesettet. De vesentlig forskjellig uttrykt gener (p 0,05) mellom afrikansk-amerikansk (n = 10) vs. europeisk-amerikanske (n = 18) CRC svulster er merket med en stjerne. Grafer fremstilt fra normaliserte gener uttrykk data i forhold til renhold (HMBS) genet.
Diskusjoner
Årsakene til CRC misforhold som eksisterer mellom AA og EA pasienter fortsatt å være fullt belyst. Selv om det meste av forskningen på dette misforholdet har fokusert på sosioøkonomiske faktorer, nyere funn støtter sterkt rollen av genetiske og biologiske faktorer. ble rapportert genetiske forskjeller mellom AA og EA CRC pasienter for SNP forening, for forekomst av MSI og nivå av genet metylering [4], [14], [15]. Noen av disse forskjellene kan føre til differensial genuttrykk mellom AA og EA CRC pasienter. I denne studien analyserte vi genuttrykk profiler av 86 svulster fra 43 AA og 43 EA pasienter. Det ble identifisert signifikante forskjeller i ekspresjonen av gener relatert til immunresponsen og inflammasjon i den tumor-mikromiljøet mellom disse to gruppene. Denne tolkningen ble støttet av både sykdom foreningen og sti analyser. De fleste av immunrelaterte gener hadde høyere uttrykk i svulster fra afroamerikanske pasienter enn i de fra European-amerikanske pasienter. Selv om foreløpige, disse funnene er nye og kan ha implikasjoner for kreftbehandling. Fra denne studien, vet vi ikke hvorfor CRC fra afrikanske-amerikanske pasienter ville ha en annen immunologisk profil enn svulster fra European-amerikanske pasienter. Vi hypotese at årsakene til disse forskjellene er multifaktoriell. Kronisk inflammasjon er antatt å være en forårsakende faktor i kolorektal kreft [24], [25]. Det ble vist at en immunrespons signatur i leveren hos kreftpasienter forutsier metastaser og tilbakefall av hepato-cellulært karsinom [26]. Derfor bør fremtidige studier vurdere om den immunologiske profilen til CRC i afrikansk-amerikanske pasienter er en predisponerende faktor for tumorprogresjon og metastasering. Tidligere undersøkelser identifisert en to-genet svulst signatur (CRYBB2 og PSPHL) som nøyaktig differensiert mellom afrikansk-amerikanske og europeiske amerikanske prostatakreftpasienter [27]. De to genene ble også uttrykt forskjellig mellom afrikansk-amerikanske og europeiske amerikanske brystkreftpasienter [28] I denne studien har vi funnet oppregulering av CRYBB2 og PSPH genet i CRC av afrikansk-amerikanske pasienter. Mutasjoner i CRYBB2 genet er også ansvarlig for familiær grå stær [29]. PSPHL er en homolog av PSPH. Interessant er PSPH lokalisert på kromosom 7p15.2, en kromosomal region som er kjent for å ha forsterkning av funksjon relatert til avansert stadium tumor i ikke-små-celle lunge adenokarsinom [30]. Det ble vist at økt uttrykk av PSPH i ikke-småcellet lungekreft tilsvarer klinisk respons på behandling med erlotinib [31]. Således er det mulig at økt ekspresjon av PSPH bidrar til CRC følsomhet i Aas og at nivåene av PSPH ekspresjon kan korreleres med respons til anti-EGFR-behandling. Disse mulighetene må testes i fremtidige studier. Vurderer nedregulert gener i AAs vi fant lavere uttrykk for C17orf81 genet. Nedregulering av dette genet var assosiert med kreft i tykktarmen [32], hvilket antyder at lavere ekspresjon av dette genet kan bidra til en mer aggressiv CRC i Aas. Andre ned regulerte gener i AAs inkluderer: TRNT1 (involvere i RNA behandlingen; [33]); ARHGAP6 (fremmer aktin ombygging: [34]); WDR8 (letter dannelsen av multiprotein komplekser: [35]). Tatt i betraktning de cellulære funksjoner av disse genene er det ikke vanskelig å forestille seg hvordan deres uttrykk kan påvirke aggressivitet CRC.
Hel-genom genekspresjon analyse eksperimenter kan være utsatt for funn som enten er unike for en selektert pasientpopulasjon eller er kunstig skapt av den anvendte teknologi. For å utelukke muligheten for en gjenstand, ble to ulike tilnærminger brukes til å krysse validere våre genuttrykk data. Først sammenlignet vi våre resultater for de differensielt uttrykte gener mellom 86 tumorer og 40 omkringliggende ikke-tumorvev med de fra en publisert meta-analyse av fem CRC genekspresjon datasett i Oncomine [36], [37], [38], [ ,,,0],39], [40]; Tabell S2. Vi har funnet en meget god overensstemmelse mellom resultatene og resultatene av de andre 5 meta-analyser. Av de 20 beste over-uttrykte gener i CRC svulster over de 5 andre meta-analyser (Oncomine; https://www.oncomine.org), ble 15 også funnet å være signifikant oppregulert (FDR, mindre enn 5%) i vår studie. Av de 20 beste under uttrykte gener i CRC svulster over de 5 andre metaanalyser, 17 var signifikant nedregulert (FDR, mindre enn 5%). I vår studie
For det andre, vi validert uttrykk for ti viktige gener via QRT-PCR og bekreftet forskjeller i genuttrykk mellom CRC av AAS og EAs for åtte av dem.
i konklusjonen, genuttrykket profilen til CRC tilsvarer forskjeller i tumorbiologi mellom afrikansk-amerikanske og European-amerikanske pasienter. Implikasjonene av disse forskjellene i sykdoms aggressivitet og effekten av behandlingen bør vurderes i fremtidige studier.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Oppfinnsomhet Pathway Analyse av foreningen av forskjellig uttrykte gener med topp bio funksjoner.
doi: 10,1371 /journal.pone.0030168.s001 plakater (docx)
Tabell S2. Host Sammenligning av topp 40 ulikt uttrykt gener i fem andre CRC microarray studier og denne studien.
doi: 10,1371 /journal.pone.0030168.s002 plakater (docx)
