Abstract
I kreft hos mennesker, metylering av lange ispedd kjerneelement -1 (LINE-en eller L1) retrotransposons reduseres. Dette skjer innenfor rammen av genomet bred hypometylering, og selv om det er vanlig, er dens rolle dårlig forstått. L1S er vidt utbredt både på innsiden og utsiden av gener, intragenic og intergeniske hhv. Interessant, innsetting av aktive full-lengde L1-sekvenser inn i verts genet introner forstyrrer genekspresjon. Her evaluert vi hvis intragenic L1 hypometylering påvirker deres verts genuttrykk i kreft. Først hentet vi data fra L1base (https://l1base.molgen.mpg.de), en database som inneholder putatively aktive L1 innsett, og sammenlignet intragenic og intergeniske L1 tegn. Vi fant ut at intragenic L1 sekvenser har blitt bevart over evolusjonær tid med hensyn til transkripsjonen aktivitet og CpG dinukleotidpolyfosfater nettsteder for pattedyr DNA metylering. Da vi sammenlignet regulert mRNA nivåer av celler fra to forskjellige eksperimenter tilgjengelig fra Gene Expression Omnibus (GEO), en database oppbevaringssted for høy gjennomstrømning genuttrykk data, (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) ved chi-kvadrat. Den odds ratio på nedregulert gener mellom demetylert normal bronkialepitelet og lungekreft var høy (p 1E
-27, OR = 3,14; 95% CI = 2,54 til 3,88), noe som tyder på kreft genome wide hypometylering nedregulere genet uttrykk. Omfattende analyse mellom L1 steder og genuttrykk viste at uttrykket av gener som inneholder L1S hadde en signifikant høyere sannsynlighet for å bli undertrykt i kreft og hypomethylated normale celler. I motsetning til dette er mange mRNA avledet fra gener som inneholder L1S forhøyet i argonaute 2 (AGO2 eller EIF2C2) -depleted celler. Hypomethylated L1S øke L1 mRNA nivåer. Til slutt fant vi ut at AGO2 mål intronic L1 pre-mRNA komplekser og undertrykker kreftgener. Disse funnene representerer en av mekanismene for kreft genome wide hypometylering endring genuttrykk. Hypomethylated intragenic L1S er en kjernefysisk siRNA mediert
cis
regulatoriske element som kan undertrykke gener. Dette epigenetisk regulering av retrotransposons sannsynlig påvirker mange aspekter av genomisk biologi
Citation. Aporntewan C, Phokaew C, Piriyapongsa J, Ngamphiw C, Ittiwut C, Tongsima S, et al. (2011) Hypomety-lering av Intragenic LINE-en undertrykker transkripsjon i kreftceller gjennom AGO2. PLoS ONE 6 (3): e17934. doi: 10,1371 /journal.pone.0017934
Redaktør: Esteban Ballestar, Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), Spania
mottatt: 14 september 2010; Godkjent: 18 februar 2011; Publisert: 15 mars 2011
Copyright: © 2011 Aporntewan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien støttes delvis av Thailand Research Fund (TRF), Nasjonalt Senter for genteknologi og bioteknologi (BIOTEC), National Science and Technology Development Agency (NSTDA), Four Seasons Hotel Bangkok og Thai Røde Kors fjerde Cancer Care Charity og Chulalongkorn University. Chureerat Phokaew er støttet av en Royal Golden Jubilee Ph.D. Tilskuddet (PHD /0190/2550), franske ambassaden i Thailand og Chulalongkorn University. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i kreft, metylering DNA i resten av genomet, særlig ved en lang ispedd kjerneelement-1 (LINE-1 eller L1) retrotransposon, er generelt oppbrukt og denne hendelse inntreffer innenfor konteksten av genomet bred eller global hypometylering [1], [2], [3]. Global hypometylering kan spille flere roller i flertrinnskreftutvikling. Mest vanlig anerkjent virkning er å lette kromosomal ustabilitet [4], muligens mediert av hypomethylated genomet forbundet replika uavhengig DNA dobbel tråd bryte feilutsatte reparasjon [5], [6]. Nylig er det en rapport som hypometylering av en L1 aktiverer alternativ promoteren MET oncogen [7]. Imidlertid er rollen til global L1 metylering, på genom bred genekspresjon blir mindre hyppig studert og således ikke godt karakterisert.
DNA metylering er et grunnleggende molekyl karakteristikk av det humane genomet, og endring av denne epigenetisk regulering er assosiert med kreft [2]. Effektene av promoter metylering på kromatin konfigurasjon og gentranskripsjon har blitt godt dokumentert [8]. I motsetning til dette, hvilke mekanismer, hvor DNA-metylering innenfor et gen (gen legeme metylering) kontrollerer genekspresjon, er mindre kjent. Gene kroppen metylering endringer kan ha flere konsekvenser. Unike denaturert sekvenser i introner er ofte funnet i høyt uttrykte gener [9]. I motsetning til dannelsen av heterochromatin av tett intragenic DNA-metylering begrenser effektiviteten av RNA-polymerase [10]. Likevel, disse bevisene innebar at metylering av intragenic repetitive sekvenser, inkludert L1S, kan også være viktig for å opprettholde normal funksjon av knyttet genomisk loci.
L1S er også utbredt i genomet [11]. L1 innsetting har flere mulige funksjonelle konsekvenser [12]. Det er bemerkelsesverdig at L1S ikke er jevnt fordelt [11] og mange er utelatt fra genomiske regioner som inneholder husholdningsgener [13]. En genetisk konstruert in vitro-studie viste at innsetting av aktive L1-sekvenser inn i verts genet introner avbryter genekspresjon [14]. Gjennom evolusjonen retrotransposition hendelser produsert 500.000 eksemplarer av L1 i det menneskelige genom [15]. Imidlertid er ikke alle L1S er fulle lengde og aktive; de fleste er avkortet. Det er 80-100 retrotransposition-kompetent L1S i det menneskelige genom, men bare seks av disse er tenkt å ligge til grunn alle historiske retrotransposition hendelser [16]. Mer enn 10.000 L1S er lengre enn 4,5 kb og inneholder en 5 «UTR, to åpne leserammer og en 3» UTR som har et polyadenyleringssignal [17]. Mer enn 2000 av disse L1S er intragenic, og de bor i mer enn 1000 gener.
Nylig har vi evaluert metylering mønstre av de 5 «UTR av L1 sekvenser [1], [18] og fant at metylering nivåene varierer i hver locus og i forskjellige celletyper i villtype-celler. I humane kreftformer, er det metylering av L1 retrotransposons redusert variabelt [1], [18], [19]. Tapet av genomet bred L1 metylering i kreftceller forekommer som en generalisert prosess. Imidlertid er L1 metylering påvirket av sin plassering i genomet [18]. For eksempel er L1S i ulike introner av de samme genene vanligvis modifiseres på en lignende måte [18]. L1 hypometylering er korrelert med visse cellulære fenotyper. I kreft, er L1 hypometylering direkte forbundet med flertrinns karsinogenese og aggressive kreftformer med dårlige prognoser [1], [20], [21], [22], [23], [24]. Videre, i normale celler metylering av L1 kan bli endret i forbindelse med visse cellulære fenotyper som høy risiko for kreft, vev differensiering og kost [25], [26], [27], [28], [29], [30] , [31], [32], [33]. Interessant, flette repeterende sekvens (IRS) hypometylering mønstre er forskjellige i celler med forskjellige fenotyper. For eksempel er Alu hypometylering ofte funnet i aldrende celler, men L1 hypometylering er ikke [34]. Disse linjene av bevis fører oss til hypoteser om at tusenvis av gener kan reguleres ved intragenic L1 hypometylering i kreftceller.
Her hentet vi data fra L1base (https://l1base.molgen.mpg.de) [ ,,,0],17], til en database som inneholder putatively aktive L1 innsett, sammenligne intragenic og intergeniske L1 tegn. Da vi sammenlignet mRNA nivåer fra hypomethylated normale celler og kreft uttrykk array-biblioteker, tilgjengelig fra Gene Expression Omnibus (GEO), en database oppbevaringssted for høy gjennomstrømning genuttrykk data, (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) [35], [36]. Til slutt, omfattende analyser mellom L1 steder og genom bredt genuttrykk ble utført for å evaluere genet regulatoriske mekanismer intragenic L1S i kreft.
Resultater
Intragenic og intergeniske L1 sekvenser viser tydelige strukturelle trekk
Sequence varianter av hver lang L1 er klassifisert i henhold til evolusjonsperioden og retrotransposition aktivitet [17]. Her, analyserte vi hvis L1S kan skjelnes avhengig steder hvis sekvensene som er innenfor gener, intragenic eller mellom gener, intergeniske (Fig. 1A). Ulike egenskaper, som er beskrevet i L1base [17] inkludert kromosom beliggenhet, underfamilien, sekvens og CpG øyer, fra 9355 intergeniske L1S og 2546 intragenic L1S funnet i 1,454 gener ble evaluert av 218 chi-kvadrat tester og 18 t-tester (Støtte Tabell S1 og S2). Eksempler på en chi-kvadrat-test og en t-test ble vist (Fig. 1B og 1C). Statistisk analyse viste at det er mange strukturelle kjennetegn ved intragenic L1S som er forskjellig fra intergeniske L1S (fig. 1 og støttebordet S2). 100 khikvadrattester analysert varianter av sekvensene som bestemmer L1 transkripsjonen og retrotranspositional aktivitet og tilstedeværelsen av CpG øyer og 57 av testene var signifikant forskjellig ved p-verdiene 0,001 (Fig. 1D og støttebordet S2). Disse testene viste prevalens er av konserverte sekvenser av intragenic L1S var alltid høyere enn intergeniske L1S mens alle muterte sekvensene var mer vanlig i intergeniske L1S (Fig. 1D og Støtte Tabell S2). I tillegg ble hyppigere CpG øyer observert i intragenic L1S (Fig. 1D og Støtte Tabell S2). Dette funnet ble støttet ved å sammenligne hjelp av 18 funksjoner av t-test (Fig. 1C, 1E og Støtte Tabell S2). Intergeniske L1S inneholde flere A- og T-nukleotider, frameshifts, hull og stoppkodoner. I kontrast, intragenic L1S inneholde høyere G-C-innhold og intactness poengsum (Fig. 1E og Støtte Tabell S2). I konklusjonen, har intragenic L1 sekvenser blitt bevart over evolusjonær tid med hensyn til transkripsjonen aktivitet og CpG dinukleotidpolyfosfater nettsteder for pattedyr DNA metylering. Disse funnene underforstått fysiologiske funksjoner intragenic L1 metylering.
A) L1S ble delt inn i to klasser, intragenic og intergeniske L1S som er representert av blå og røde piler, henholdsvis. B) Forskjellene i strukturelle egenskaper mellom L1 gruppene ble analysert ved hjelp av chi-kvadrat test, for kategoriske funksjoner og C) homoscedastic
t
-test for ikke-kategoriske funksjoner. D) 100 p-verdier på chi-kvadrat tester av tre klasser av L1 sekvens tegn, ble de konserverte sekvenser, muterte sekvenser og tilstedeværelsen av CpG øyer, som er funnet overrepresentert eller underrepresentert i intragenic L1S vises, intragenic L1S intergeniske L1S og intergeniske L1S intragenic L1S hhv. E) 18 p-verdier av t-tester av L1 tegn som er overrepresentert og underrepresentert i intragenic L1S ble vist i blått, intra inter, og rød farge, inter intra henholdsvis
Intragenic. L1S undertrykke gener i kreftceller
L1S er hypomethylated i mange kreftformer [1]. For å undersøke om intragenic L1S kontroll vertsgener i L1 hypomethylated kreftceller sammenlignet vi genuttrykk i kreft mellom gener innehar intragenic L1S og resten. Gener som innehar L1S ble bestemt av L1base [17] og uttrykk microarray data er offentlig tilgjengelige data fra GEO [35], [36]. Hvert gen ble klassifisert av to student t-tester, opp- og ned-regelverket. Hvis den midlere av kreft gruppen var statistisk høyere eller lavere enn normalt gruppe, ble genet klassifisert som opp- eller ned-regulert, henholdsvis. Hvis t-test var ikke statistisk signifikant, var genet klassifisert som ikke opp- eller ikke nedregulert, respektivt. Fordelingen av gener som innehar L1S som viste økt ekspresjon i cancer ble sammenlignet med resten av genet satt av chi-kvadrat tester (fig. 2A). ble utført samme analyse for gener med redusert uttrykk i kreft (Fig. 2B). Figur 2A og 2B viste eksempler på chi-kvadrat tester av genuttrykk i magekreft. Gener som innehar intragenic L1S ble funnet mindre sannsynlig å bli oppregulert (odds ratio (OR) = 0,61, p = 3.04E-06) (fig. 2A). Videre ekspresjon av gener som inneholder L1S var mer vanlig redusert (OR = 1,64, p = 2.66E-13) (fig. 2B). Intragenic L1S kan kontrollere hundrevis av gener. Blant 1,340 gener som inneholder L1S, ble 1,242 gener ikke oppregulert og 304 gener ble nedregulert (Fig. 2A og 2B). Analyse av en rekke ekspresjonssystemer matriser viste lignende resultater. Vi testet hode og hals karsinomer, cervikale kreftcellene, lunge adrenocarcinoma celler, leverkreft, brystkreft celler, ductal og lobular brystkreft, blærekarsinom situ, mikrosatelitt ustabile magekreft, prostatakreft metastase. Vi fant at genene nedregulert i cervikale kreftcellene, lunge adrenocarcinoma celler, brystcancerceller, duktalt og lobular brystkreft, blærekarsinom situ, mikrosatelitt ustabile magekreft er mer sannsynlig å inneholde L1S. Videre gener med høyere uttrykk nivåer i hode og hals plateepitelkarsinom, livmorhalskreftceller, leverkreft, brystkreft celler, blære carcinoma situ, mikro ustabil mage kreft, metastase prostatakreft er mindre sannsynlig å ha L1S (Støtte tabell S3 og Fig . 2C). Derfor kan intragenic L1S undertrykke vert gener i disse kreftformene. Selv om in vitro innsetting av aktive L1 sekvenser i verts genet introner forstyrret genuttrykk [14], de fleste mRNA nivåer fra gener som inneholder L1 var ikke fraværende (Støtte fig. S1). Videre, en sammenligning av gener i kreft, slik som beskrevet i støttebordet S3.1-S3.9, viste at sannsynligheten for gener inneholdende L1 for å være vanlig nedregulert i uavhengige eksperimenter er høyere enn gener uten L1 (p-verdi = 7.99E-08, mener L1 = 1,6642, mener ingen L1 = 1,4861) (Støtte fig. S2). Disse analysene støttet biologiske betydningen av intragenic L1S i genregulering i kreft.
a) og b) er chi-kvadrat 2 × 2 tabeller, p-verdier og odds ratio, sammenligner andelen av magekreftgener som innehar L1S mellom opp – ( «Up») eller ned- ( «ned») regulert og ikke opp- eller ikke nedregulert gruppene, respektivt. C) Prosentandeler av L1-inneholdende mRNA-er som er opp- eller ned-reguleres i forskjellige krefttyper. D) EPHA3 mRNA og L1-EPHA3-IVS5 og IVS15 metylering nivåer i WSU-HN celler og Aza-DC-behandlet WSU-HN17s. E) To chi-kvadrat 2 × 2 tabeller, p-verdier og odds ratio, sammenligner andelen Aza-DC-behandlede hBECs eller hMSCs gener som innehar L1S mellom nedregulert ( «ned») og ikke nedregulert grupper, henholdsvis. F)% av mRNA fra gener som inneholder L1S i Aza-DC-behandlede hBECs og hMSCs. «Up» og «Down» indikerer økt og redusert uttrykk, henholdsvis. GSE poster, GSM prøver og type
t
-test og 2 × 2 tabeller av chi-kvadrat tester er gitt i Støtte tabell S3.
For å demonstrere sammenhengen mønster mellom L1 metylering nivåer og genekspresjon, vi målte intragenic L1 metylering nivåer og verts genet mRNA nivå. Tidligere har vi evaluert metylering nivåer av 17 intragenic L1 loci og fant at L1 metylering nivåer av L1-EPHA3-IVS5 og L1-EPHA3-IVS15 er sterkt korrelert i kreftceller, noe som tyder locus spesifikk mekanisme [18]. Måling av intragenic L1-EPHA3 metylering og EPHA3 mRNA nivåer i hode og nakke plateepitelkreft (HNSCC) cellelinjer (WSU-HNS) viste at lavere nivåer av intragenic L1-EPHA3-IVS5 og L1-EPHA3-IVS15 metylering korrelert med lavere EPHA3 mRNA nivåer (Pearson r = 0,7961 og 0,7638, henholdsvis fig. 2D). EPHA3 mRNA i WSU-HN17 celler var også betydelig lavere når L1-EPHA3 ble hypomethylated (paret
t
-test; p 0,001 Fig. 2D). Derfor kan nivået av mRNA være direkte korrelert med intragenic L1 metylering.
Tap av metylering i normal celle undertrykker gener som havn L1S
En analyse av genuttrykk i humane bronkiale epitelceller (hBECs ) og menneskelige stamceller (hMSCs) etter genome wide demetylering av 5-aza-2′-deoksycytidin (aza-dC) behandling viste større utbredelse av intragenic L1S i nedregulert gener (OR = 1,52, p = 0,0017 og OR = 1,62, p = 0,0069, henholdsvis) (fig. 2E, 2F og støttebordet S3), interessant nok et lignende mønster som finnes i kreft (fig. 2C). Vi ytterligere utforsket hvis genom bredt hypometylering regulert gener i kreft. Vi utførte en chi-kvadrat test for å fastslå betydningen av overlapping mellom nedregulert gener i demetylerte hBECs og i lungekreft. Gener som ble nedregulert i Aza-dC behandling på hBECs ble funnet å fortrinnsvis ha lavere mRNA nivåer i kreftceller i lungene (p = 2.67E-28; OR = 3,14; 95% CI = 2,54 til 3,88, figur 3A og 3B og Støtte tabell S4). Dette støtter hypotesen om at hypometylering ned regulerer gener i kreft.
A) 2 × 2 tabeller, p-verdier og odds ratio og B) odds ratio for mRNA som er under-uttrykk ( «Down») i lungekreft og Aza-dC-behandlede hBEC-celler sammenlignet med ikke-Aza-dC-behandlede hBEC celler for (A og B) alle gener, (B) gener med L1S (L1) og gener uten L1S (No L1). B) Den midterste, topp og bunnlinjen for hver to-farge-boksen er odds ratio og øvre og nedre 95% konfidensintervall (CI), henholdsvis. C) 2 × 2 tabeller, p-verdier og odds ratio og D) prosenter av mRNA som er under-uttrykt ( «ned») i begge Aza-DC-behandlede celler og kreftceller sammenlignet med gener som ikke er nedregulert i Aza-dC behandlede celler eller kreft, for gener med og uten L1S (L1 og Nei L1). De tilsvarende 2 × 2 krysstabeller for A) og B) og C) og D) er gitt i støttebordet S4 og S5, henholdsvis.
Interessant, hypometylering ned regulerer begge grupper av gener med L1 (p 2.59E-04; OR = 3,24; 95% CI = 1,73 til 6,05; Støtte tabell S4) og uten L1 (p 2.34E-24; OR = 3,09; 95% CI = 2,46 til 3,87; støtte Tabell S4). Derfor er det mulig at i tillegg til L1 er det andre DNA metylert gen legemeelementene som regulert genekspresjon. Denne hypotese støttes av en nylig rapport som i genet legeme, unike denaturert sekvensene er mer utbredelse i høyt uttrykte gener [9]. For å skille rolle L1S videre, vi sammenlignet mellom gener med og uten L1S. Vi fant at ved nedregulering av gener i både Aza-dC behandlet hBECs og lungekreft er mer utbredt i gener inneholdende L1S enn i gener uten L1. (OR = 2,08, p = 0,009, Fig. 3C og 3D og Støtte tabell S5). Derfor hypometylering reduserer uttrykket av mange gener i kreft, og intragenic L1S fungere som en metylering-mediert
cis
regulatoriske element.
Mange gener ofte nedregulert i kreft skjerm hypermethylated arrangører [8] . Men vi fant ingen sammenheng mellom arrangøren hypermethylation i kreft og tilstedeværelsen av intragenic L1S. Gener med hypermethylated promoteren har vist seg å være oppregulert når cellene ble demetylert. Uttrykket av gener med L1 ble ikke ofte økt når kreftcellene ble demetylert (Støtte Tabell S6.1 og S6.2).
L1 hypometylering øker L1 RNA-nivåer
Måling av metylering og RNA nivåer viste en invers korrelasjon mellom genom bred L1 metylering og L1-RNA (Pearson r = -0,6955, fig. 4A). Dette funnet støtter hypotesen om at L1 hypometylering øker L1 RNA transkripsjon [37]. Intronic gener er blitt foreslått for å danne avvikende RNA komplekser med vertsgener og dermed å inaktivere vert gentranskripsjon [38]. L1S er retrotransposable elementer som kan likevel innehar transkripsjonen aktivitet ved et betydelig antall loci [29]. Videre er noen L1S transkriberes utover sine polyA addisjon områder og dermed produsere kimære RNA som inkluderer både L1 og unike intronic sekvenser [39]. Vi screenet for og funnet L1-EPHA3 RNA fra intron 15 av den EPHA3 genet og det observert en signifikant invers sammenheng mellom L1-EPHA3 RNA og L1-EPHA3 metylering (Pearson r = -0,8686, Fig. 4B). Derfor fører L1 hypometylering til økt L1 transkripsjon og dermed produserer mer intronic L1 RNA.
A) Genome bredt L1 metylering og L1 RNA-nivå i WSU-HN celler. B) L1-EPHA3 metylering og L1-EPHA3 RNA-nivåer.
Intragenic LINE-1 elementer undertrykke transkripsjon i kreftceller gjennom AGO2
Retrotransposon RNA eller avskrift danner dsrna strukturer utløse RISC montering [40]. Etter binding små interfererende RNA (siRNA), gjenkjenner RISC og forringer komplementære RNA-molekyler [41]. L1S har opp til tre interne promotorer, ved 5 «og 3′-ender, og i 5» antisense-retning [42], [43], [44]. De sense- og antisense promotorer i den 5 «UTR produsere toveis transkripter som deretter bearbeides til sirnas for å forhindre retrotransposition [40]. Derfor hypotese vi at L1 RNA og intronic pre-mRNA av gener inneholdende L1S, på grunn av komplementaritet av begge sekvenser, danner dsRNA som kan bli målrettet ved RISC dermed tappe mengden av mRNA avledet fra gener som inneholder L1S. RISC-komplekset består av dicer, argonaute og siRNA. En lignende kompleks med AGO2 virker til taushet gentranskripsjon i kjernen [45], [46].
Hvis intragenic L1 RNA reduserer vert gen mRNA via AGO2 vil AGO2 protein deprivasjon føre til økt mRNA nivåer av gener hosting L1S. Analyse av mRNA microarray av AGO2 nedregulert celler, AGO2sh [47], viste at den begrensede ekspresjon av AGO2 i en human embryonisk nyrecellelinje (HEK293T) resulterte i et uttrykk mønster av genet inneholdende L1S som var motsatt av den som ble observert i løpet av L1 hypometylering; nemlig, de var mer sannsynlig å være oppregulert (OR = 1,44, p = 0,0004, Fig. 5A og 5B og Støtte Tabell S3). Den shRNAs av DICER1, AGO1, AGO3 og AGO4 ikke oppregulere gener med L1 (Støtte Tabell S6.3-S6.7). Dette antydet at AGO2 fortrinnsvis begrenser konsentrasjonen av mRNA avledet fra gener som inneholder L1S. Vi evaluerte ytterligere en mRNA microarray eksperiment hybridiserte av AGO2 utfelt RNA [48] og fant at AGO2 kanskje ikke direkte degradere mRNA som er avledet fra gener som inneholder L1S. Selv om RISC binder og forringer mRNA, mRNA-er avledet fra gener som inneholder L1S var mindre sannsynlig å være bundet av AGO2 (OR = 0,64, p = 0,009, Fig. 5A og 5B og støttebordet S3), som opprinnelig var overraskende gitt resultatene av AGO2sh eksperimenter (fig. 5A og 5B og Støtte Tabell S3).
A) 2 × 2 tabeller, p-verdier og odds ratio og B) prosenter av L1 inneholder-gener som viser økt mRNA nivåer i AGO2sh behandlet -celler ( «Up»), eller er bundet av AGO2 i AGO2IP ( «bundet»), henholdsvis. C) 2 × 2 tabeller, p-verdier og odds ratio og D) odds ratio (95% KI) sammenligner HEK293T mRNA mellom oppregulert gener og ikke oppregulert gener på AGO2sh og bundet av AGO2 proteiner for alle genene (D), gener med L1S (L1) og gener uten L1S (No L1), (C og D). D) Den midterste, topp og bunnlinjen for hver to-farge-boksen er odds ratio og øvre og nedre 95% CIS, henholdsvis. E) Nivåer av AGO2, EPHA3 mRNA og L1RNA i WSU-HN17 AGO2si celler. Data representerer gjennomsnitt ± SEM. GSE poster, GSM prøver, type
t
-test for A) og B) er gitt i Støtte tabell S3. 2 × 2 krysstabeller for C) og D) er gitt i Støtte Tabell S4. F) To scenarier av AGO2-target bindende reflekterer i forskjellige mRNA matrise resultater ved bruk AGO2-IP og AGO2sh som prober. Negativt resultat var forventet fra mRNA uttrykk microarray hjelp AGO2-IP RNA som prober, ( «AGO2-IP + mRNA array»), når introner av pre-mRNA ble målrettet. Men positivt resultat var forventet fra mRNA uttrykk mikromatriser bruker mRNA fra AGO2sh som prober, ( «AGO2sh + mRNA array»), uavhengig AGO2 er rettet mot pre-mRNA eller mRNA.
Når sammenligne AGO2-bundet mRNA
