Abstract
IGROVCDDP cisplatin-resistent eggstokkreft cellelinje er også motstandsdyktig mot paclitaxel og modeller motstanden fenotype av residiverende ovarialcancer pasienter etter førstelinje platinum /taxan kjemoterapi. En TaqMan lav tetthet array (TLDA) ble anvendt for å karakterisere ekspresjonen av 380 gener assosiert med kjemoterapi motstand i IGROVCDDP celler. Paclitaxel motstand i IGROVCDDP medieres av gen- og protein overekspresjon av P-glykoprotein, og proteinet er funksjonelt aktiv. Cisplatin motstand ble ikke reversert ved elacridar, bekrefter at cisplatin er ikke en P-glykoprotein substrat. Cisplatin motstand i IGROVCDDP er multifaktoriell og formidles delvis av glutation sti og redusert akkumulering av stoffet. Total cellulær glutation ble ikke økt. Imidlertid enzymaktiviteten av GSR og GGT1 ble oppregulert. Den cellulære lokalisering av kobber transporter CTR1 endres fra membranassosiert i IGROV-1 til cytoplasmatisk i IGROVCDDP. Dette kan formidle tidligere rapportert akkumulering defekt. Det var redusert ekspresjon av natrium- kalium-pumpen (ATP1A), MRP1 og FBP som alle tidligere er blitt assosiert med platina akkumulering defekter i platina-resistente cellelinjer. Cellular lokalisering av MRP1 ble også endret i IGROVCDDP skiftende basolaterally, sammenlignet med IGROV-en. BRCA1 ble også oppregulert på genet og proteinnivå. Overekspresjon av P-glykoprotein i en motstandsdyktig modell utviklet med cisplatin er uvanlig. Dette viser at P-glycoprotein kan være oppregulert som en generalisert stressrespons og ikke som en spesifikk respons på et substrat. Mekanismer preget i IGROVCDDP celler kan være aktuelt for residiverende ovarialcancer pasienter behandlet med frontline platina /taxan kjemoterapi
Citation. Stordal B, Hamon M, McEneaney V, Roche S, Gillet JP, O’Leary JJ, et al. (2012) Motstand mot Paclitaxel i en Cisplatin-Resistant Ovarian Cancer Cell linje er mediert av P-glykoprotein. PLoS ONE syv (7): e40717. doi: 10,1371 /journal.pone.0040717
Redaktør: Alexander James Roy Bishop, University of Texas Health Science Center i San Antonio, USA
mottatt: 23 februar 2012; Akseptert: 12. juni 2012; Publisert: 11.07.2012
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Denne forskningen ble finansiert av en Marie Curie International Incoming Fellowship fra EU FP7 program, og en irsk Kreftforeningen postdoktorstipend (BS) . Samarbeidet mellom Britta Stordal og National Cancer Institute ble støttet av en Travel Fellowship fra European Association of Cancer Research. Denne forskningen ble også støttet av egenutført Research Program av National Institutes of Health, National Cancer Institute, Senter for Cancer Research (JPG, MG). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og en nalysis, beslutningen om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
introduksjon til
prognosen for kvinner med eggstokkreft er svært dårlig. De fleste pasientene stede med avansert sykdom og den langsiktige overlevelsen hos disse pasientene er 10-30% [1]. Nåværende behandling av eggstokkreft er kirurgi etterfulgt av platina /taxan kombinasjonskjemoterapi [1]. Det kjemoterapeutiske midler cisplatin og paclitaxel blir brukt i behandling av mange faste tumorer, inkludert eggstokk-karsinom. Cisplatin binder seg til DNA-tråden, som hindrer både DNA-replikasjon og RNA oversettelse og til slutt utløse apoptose. Paclitaxel forårsaker cytotoksisitet ved å binde til og stabilisere polymeriserte mikrotubuli. På grunn av deres forskjellige virkningsmekanismer, er platinums og taxaner ofte kombinert i kreftbehandling. Innledende respons på kjemoterapi ved kreft i eggstokkene er høy, men opp til 80% av pasientene vil etter hvert tilbakefall og blir platina /taxan motstandsdyktig.
IGROVCDDP cisplatin-resistente ovarie cellelinje er en uvanlig cisplatin-resistente modell, som det er også kryss-resistent til paclitaxel. Når kjøpte cisplatin motstand er produsert i cellelinjer, bare 17% er også motstandsdyktig mot paclitaxel [2]. 41% av cisplatin resistente modeller er ikke motstandsdyktig mot paclitaxel og 28% av cellemodeller blir overfølsomme for paclitaxel [2]. Dette tyder på at de fleste kreftpasienter vil dra nytte av som får kjemoterapi som veksler mellom cisplatin og paclitaxel, som utvikler resistens mot en medikament er mindre tilbøyelige til å føre til resistens mot den andre. Utfordringen er hvordan man skal identifisere hvilke pasienter som vil svare godt til vekselstrøm terapi mellom cisplatin og paclitaxel. Dette er fordi mens flertallet av kreftpasienter kan reagere godt til denne behandlingsstrategien, korset motstandsdyktig årsklasse, ville respondere dårlig og må behandles med alternativ behandling.
IGROVCDDP modeller motstanden fenotype av eggstokkreft pasienter som har mislyktes standard frontlinjen kombinasjon platina /taxan kjemoterapi. Kjemoterapeutiske medikamenter som IGROVCDDP er ømfintlig for, kan være egnet for behandling av platina /taxan resistent kreft i eggstokkene. Studerer IGROVCDDP multiresistent modellen vil tillate oss å forstå mekanismene for kryssresistens mellom platinums og taxaner. Det er vårt mål å oversette molekylære markører for denne kryssresistens fenotyper til klinisk behandling av residiverende resistent ovarialcancer.
Metoder
Cell Kultur og cytotoksisitetsassayer
human IGROV-1 ovarian cancer-cellelinje og dens cisplatin-resistente variant IGROVCDDP ble erholdt fra professor jan Schellens [3], [4]. Celler ble dyrket i antibiotika og kjemoterapi-fri RPMI (Sigma # R8758) med 10% FCS (Lonza, Belgia). Celler ble opprettholdt i en fuktig atmosfære med 5% CO2 ved 37 ° C, og var
mycoplasma-, gratis. For å bestemme cytotoksiske celler (1 x 10
4 celler /brønn) ble sådd ut i flatbunnede, 96-brønners plater og tillatt å feste over natten. Brønnene ble behandlet i tre eksemplarer med serielle fortynninger av medikamentet i et sluttvolum på 200 ul. Medikamentfrie kontroller ble inkludert i hver analyse. Platene ble inkubert i ytterligere 5 dager, og cellelevedyktigheten ble bestemt ved anvendelse av en syre-fosfatase analyse [5].
TaqMan Low Density Array (TLDA)
celler (1,25 x 10
6 celler /10 cm parabol) ble belagt og lov til å feste seg og vokse i 3 dager å nå 70-80% samløpet. Cellene ble deretter trypsinisert, vasket i 10 ml PBS, sentrifugert og supernatanten fjernet. Cellepelletene ble lagret ved -80 ° C før analyse. Totalt RNA ble fremstilt ved anvendelse av en RNeasy Mini Kit (Qiagen, UK). Den TLDA utvalg ble utført på biologiske tredoble prøver som beskrevet i Gillet
et al
. 2011 [6]. Median ekspresjon av hver prøve ble subtrahert fra alle genekspresjon for den prøven. Dataene ble analysert ved hjelp av
BRB ArrayTools
, en microarray-data statistisk analyseverktøy (https://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html) [7]. Gener uttrykt av mindre enn 50% av prøvene ble filtrert ut og en univariat to-utvalgs t-test ble utført for å bestemme gener som var signifikant forskjellig mellom IGROV-en og IGROVCDDP basert på en p. 0,01 cutoff
Epirubicin Akkumulering Assay
Celler ble sådd ut ved en tetthet på 2,5 x 10
5 i en ikke-ventilert T25-kolbe. Den neste dag ble mediet fjernet, og cellene ble behandlet med 1 pM epirubicin i 2 timer i nærvær eller fravær av 0,25 uM elacridar, 0,67 uM, 3,33 uM eller 33,3 uM cisplatin. Cellene ble vasket med 4 ml kald PBS og trypsinisert. Cellene ble sentrifugert og resuspendert i 1 ml PBS og en celletelling gjennomført (9 ul). De gjenværende celler ble sentrifugert, supernatanten ble fjernet og pelleten lagret ved -20 ° C før analyse. Total epirubicin ble deretter kvantifisert ved LC-MS følge en væske-væske-ekstraksjon prøvepreparering, i henhold til metoden i veggen
et al
. 2007 [8].
totalt cellulært Glutathione Assay
Celler ble sådd ut ved en densitet på 1,25 x 10
6-celler i en 10 cm diameter tallerken og fikk feste seg over natten. Cellene ble stoffet behandlet i 24 timer, deretter trypsinisert og en celletelling gjennomført. Cellene ble vasket i 10 ml PBS, sentrifugert og supernatanten fjernet. Cellepelletene ble lagret ved -20 ° C før analyse. Total glutation ble bestemt ved hjelp av en modifikasjon av Suzakake
et al
. [9]. Cellepelletene ble lysert i 150 ul vann og ultralydbehandlet, 12,5 ul av 30% sulfosalicyclic syre ble tilsatt, og prøvene ble virvlet. Etter 30 minutter på isen, ble proteinfrie supernatanter samlet ved sentrifugering (12 000
g
i 5 minutter ved 4 ° C). Glutation-konsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av en reaksjonsblanding inneholdende 20 pl lysat eller standard, 90 mL av trietanolamin-buffer, pH 8,0 (0,2 M), 30 ul NADPH (4 mM) og 20 pl av DTNB (6 mM). Etter 2 minutter ved 30 ° C ble reaksjonen startet ved tilsetning av 0,3 enheter av glutation reduktase per brønn. Platene ble avlest ved 405 nM (forvarming til 30 ° C) med kinetisk måling av en plateleser synergi HT, Bio-Tek® (MASON Technology). Endringstakten av den kinetiske analysen ble deretter beregnet ved KC4 programvare
glutation reduktase (GSR) og Gamma-glutamyltransferase (GGT1) enzymanalyser
Cell kultur -. Celler (6,25 × 10
5 celler /10 cm parabol) ble belagt og lov til å feste natten. Cellene ble deretter behandlet med 0,67 uM cisplatin. Medikamentbehandlede celler og deres kontroller ble trypsinisert og en celletall utført. Cellene ble deretter vasket i 10 ml PBS, sentrifugert og supernatanten fjernet. Pelleten ble resuspendert i 400 ul kald enzymanalysebuffer (100 mM kaliumfosfat monobasiske, 100 mM EDTA; pH 7,5). 16 ul av 25 x Complete Protease Inhibitor (Roche, UK) ble tilsatt, og prøven ble sonikert. Etter sentrifugering (13 000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C) ble supernatanten oppsamlet og frosset ved -80 ° C før analyse
GSR -. GSR (Sigma) standarder ble laget opp i glutation reduktase fortynningsbuffer ( 100 mM kaliumfosfat monobasisk, 100 mM EDTA, 1 mg /ml BSA; pH 7,5) som strekker seg fra 0.3-0.0037 enheter /ml. 40 ul av hver prøve og standard ble analysert i duplikat i 96-brønners plater. Reaksjonsblandingen ble deretter tilsatt 160 ul totalvolum (2 mM oksidert glutation (100 ul), 3 mM DNTB (50 ul), 2 mM NADPH (10 ul)).
GGT1- Denne fremgangsmåten ble tilpasset fra metoden for Silber
et al
. [10]. GGT1 (Patricell, UK) standarder ble gjort opp i vann som strekker seg fra 1000-1.6 enheter /L. 30 ul av hver prøve og standard ble analysert i duplikat i 96-brønners plater. 100 pl reaksjonsblanding ble deretter tilsatt (60 mM gamma-glutamyl-p-nitroalinine (10 ul); 55,5 mM glyclglycine i 133,33 mM Tris-base pH 8,5 (90 ul)).
Analyse – Platene ble avlest ved 412 nM (forvarming til 30 ° C) og 405 nM (forvarming til 37 ° C) i GSR og GGT1 henholdsvis med kinetiske målinger av en plateleser som beskrevet for glutation analysen.
Western Blots
Cells (1,25 × 10
6 celler /10 cm skål) ble belagt og lov til å feste natten. Cellene ble deretter medikament-behandlet med cisplatin og dyrket i 3 dager. Celler ble resuspendert i 100 ul lyseringsbuffer (0,01 M Tris /HCl, pH 7,4) og sonikert. 20 ug protein ble fortynnet i Laemmli prøvebuffer, kokt i 3 minutter, avkjølt på is og fylt på 12% Tris /glycin geler med en 4% stabling gel. Prøver og molekylvektmarkørene ble deretter electrophoresised i 90 minutter ved 100 V. Gelene ble elektrooverført til 0,45 um nitrocellulosemembraner (Biorad) i 90 minutter ved 100 V ved hjelp av en våt overføringssystem (Biorad). Membranene ble blokkert med 5% fettfri skummet melk (Biorad) i PBS i 2 timer, deretter inkubert med det primære antistoff fremstilt i 3% skummet melk /0,1% Tween /PBS (tabell 1) over natten ved 4 ° C [11 ]. Membranene ble vasket i 0,3% Tween /PBS 3 x 10 minutter og deretter inkubert i 1 time med et HRP-konjugert sekundært antistoff (tabell 1). Membraner ble vasket igjen og utsatt for luminalen reagens (Santa Cruz) eller ECL avansert western blotting reagenser (GE Healthcare). Membranene ble deretter utsatt for autoradiografisk film. β-actin Blottene ble utviklet ved hjelp av en alkalisk fosfatase antistoff (tabell 1) og Sigma Fast BICP reagens. Tetthetsmåling på minimum n = 3 biologiske replikater ble utført ved anvendelse av Mengde One (Biorad), ved hjelp av lokale bakgrunnskorrigering. Overflod av protein ble normalisert til ponceau for hver prøve og deretter hver biologisk serien ble normalisert til IGROV-en.
Konfokalmikroskopi
Cells (1,5 × 10
5 celler /brønn) ble sådd ut i 8-brønn kammer lysbilder og lov til å feste natten. Alle vaskinger ble med PBS og alle inkubasjoner ble ved romtemperatur med mindre annet er angitt. Cellene ble vasket to ganger, og fiksert med 4% paraformaldehyd (Sigma) i PBS i 30 minutter ved 37 ° C. Cellene ble permabilised med 0,5% Triton-X-100 (Sigma) i 10 minutter og vasket to ganger. Celler ble farget med en 50 mikrogram /ml fluorescerende TRITC løsning i PBS i 40 minutter og deretter vasket to ganger. Cellene ble deretter inkubert med blokkeringsbuffer (0,02% BSA i PBS) i 30 minutter ved 37 ° C. Cellene ble deretter inkubert med primært antistoff (tabell 1) i 2 timer i en fuktig atmosfære. Cellene ble deretter vasket 3 ganger i 5 minutter og inkubert med sekundært antistoff (tabell 1) i 1 time. Cellene ble deretter vasket 3 ganger i 5 minutter. Cellene ble deretter coverslipped med festemateriale inneholdende DAPI (Sigma) og lagret ved 4 ° C før mikroskopi. Bilder ble tatt til fange på x63 forstørrelse og × en zoom. Skanner ble utført på 1 mikrometer intervall dypet gjennom de faste celler, og ett eller flettede bildene presenteres enten som XY enkelt fly gjennom midtpartiet av cellene eller ortogonale utsikt.
Statistical Analysis
Alle forsøkene ble utført ved minimum i tre eksemplarer. To-prøven, to tailed students t-tester ble benyttet for å bestemme signifikante forskjeller ved hjelp av p. 0,05 som en avskåret
Resultater
taxan Resistance i IGROVCDDP er mediert av P-glykoprotein
IGROV-1 og IGROVCDDP celler ble analysert for 380 gener assosiert med chemoresistance ved TLDA matrise for å karakterisere de mekanismer for platina og taxan motstand. 145 gener ble funnet å være signifikant forskjellig mellom IGROV-en og IGROVCDDP basert på en p 0,01 cutoff. Gener valgt for videre analyser var basert på den mest betydningsfulle ved p-verdi samt disse veiene tidligere forbundet med platina og taxan motstand (tabell 2). Alle gener som er oppført i tabellen to ble validert på proteinnivå ved western blot.
genuttrykket av P-glykoprotein (P-gp) er økt i IGROVCDDP (tabell 2), og det er en tilsvarende økning i proteinekspresjon (figur 1A). En 3-dagers behandling med lav dose cisplatin hadde en tendens til å øke P-gp-ekspresjon i både IGROV-1 og IGROVCDDP, men dette var ikke signifikant (figur 1A). P-gp ble også bekreftet å være funksjonelt aktiv i IGROVCDDP med epirubicin akkumulering analysen (figur 1B). De IGROVCDDP cellene har signifikant lavere nivåer av P-gp-substrat epirubicin etter en 2-timers eksponering sammenlignet med IGROV-1. Når IGROVCDDP ble behandlet med 0,25 pM av P-gp-inhibitor elacridar, som hindrer virkningen av medikamentet pumpen [12] akkumulert masse av epirubicin økt og var betydelig høyere enn for de overordnede IGROV-1-celler. Økningen over nivået for IGROV-1 er en interessant observasjon, og kan være på grunn av IGROVCDDP cellene å være så avhengig av P-glykoprotein for medikament-utløps; de lider mer akkumulering av medikament når det er sperret.
A) Western blot av P-glykoprotein, IGROV-1 (åpne søyler) og IGROVCDDP (grå søyler) med og uten behandling med 0,67 uM cisplatin i 72 timer (stripete barer). Representant bildet som vises. Grafen viser kvantifisering av n = 6 biologiske gjentar normalisert til p-aktin. * Indikerer signifikant forskjell fra IGROV-en p 0,05 t-test. B) Opphopning av epirubicin bestemmes av LC-MS. IGROV-en (åpne søyler) og IGROVCDDP (skraverte søyler). Celler ble behandlet med 1 pM epirubicin i 2 timer, 0,25 uM elacridar, 0,67 uM, 3,33 uM eller 33,3 uM cisplatin ble undersøkt som modulatorer av epirubicin akkumulering. Grafen viser kvantifisering av n = 3 biologiske gjentar normalisert til celle nummer. * Indikerer en betydelig forskjell mellom IGROV-en og IGROV-CDDP, Indikerer # en betydelig forskjell på tillegg av en modulator (p 0,05 studenter t-test). C) Cytotoksisitet av IGROV-en og IGROVCDDP til P-glykoprotein og ikke P-glykoprotein substrat.
IGROVCDDP celler ble screenet for deres reaksjon på en rekke kjemoterapeutika (figur 1C). IGROVCDDP celler er vesentlig motstandsdyktig til ikke-P-gp-substrat cisplatin og karboplatin [13]. IGROVCDDP er også betydelig motstandsdyktig mot P-gp-substrater [14]; taxaner, paclitaxel og TAXOTERE, antracyklin epirubicin og vinkaalkaloid vinblastin. I kontrast, er IGROVCDDP overfølsom for behandling med ikke-P-gp-substrat 5-FU [15]. IGROVCDDP er motstandsdyktig mot MRP1 substrat metotreksat [14], men ikke motstandsdyktige mot BCRP substrat SN-38 (figur 1C) [16]. Behandling med 0,25 uM elacridar vesentlig reverserer motstanden i IGROVCDDP celler til alle P-gp-substrater, men ikke motstanden mot cisplatin, karboplatin og metotreksat. IGROVCDDP celler er også mer følsomme overfor elacridar behandling enn IGROV-1 (tabell 3). IGROVCDDP cellene har redusert mRNA-ekspresjon av BCRP (tabell 2), og det er ikke påvises ved western blot (data ikke vist). Dette tyder på at reversering effektene sett med elacridar behandling er spesifikke for P-gp og ikke BCRP, som elacridar også hemmer.
Virkningen av ko- eller pre-behandling med cisplatin på paclitaxel cytotoksisitet ble undersøkt og ingen signifikant endring ble observert (data ikke vist). Tilsvarende ko- eller pre-behandling med paclitaxel ikke omvendt cisplatin motstand (data ikke vist).
Platinum motstand er assosiert med en intracellulær forskyvning av platina opptak transporter CTR1 ikke motstand mediert av MRP2.
A) Cytotoksisitet av IGROV-en og IGROVCDDP å CuSO
4. B) ATP7A western blot. Åpne barer er IGROV-en, fargede søylene er IGROVCDDP og stripete linjene viser behandling med 0,67 mikrometer cisplatin i 72 timer. Representant bildet som vises. Grafen viser kvantifisering av n = 4 biologiske gjentar normalisert til p-aktin. C) CTR1 western blot. Representant bildet som vises. Grafen viser kvantifisering av n = 3 biologiske gjentar normalisert til p-aktin. * Indikerer signifikant forskjell fra IGROV-en p 0,05 t-test. CTR1 konfokalmikroskopi i D) IGROV-1 og E) IGROVCDDP celler. XY flyene er vist for DAPI (blå), Golgi (rød) og CTR1 (grønn), et sammenslåtte bildet vises også.
MRP2, en transportør som kan utstrømming cisplatin konjugater, hadde redusert genekspresjon i IGROVCDDP (tabell 2), men var ikke påvisbart ved western blot i enten cellelinje (data ikke vist). Dette tyder på at det ikke er noen rolle platina effluks transport MRP2 i platinamotstands av IGROVCDDP. Kobber transportører kan også spille en rolle i platina opptak (CTR1) og utstrømning (ATP7A og ATP7B) [17]. En reduksjon i CTR1 ekspresjon eller økning i ATP7A eller ATP7B potensielt kan mediere platina motstand. De IGROVCDDP cellene er 2,26 ganger motstandsdyktig mot CuSO
4 (figur 2A) som tyder på at kobber metabolismen kan spille noen rolle i mekanismen av resistens. Det var ingen signifikant endring i mRNA uttrykk CTR1, ATP7A og ATP7B på TLDA array (data ikke vist). ATP7A proteinekspresjon hadde en tendens til å øke i IGROVCDDP i respons til cisplatin, men denne endringen er ikke signifikant (figur 2B). Imidlertid, var det en signifikant reduksjon i CTR1 ekspresjon, i respons til medikamentbehandling cisplatin i IGROVCDDP celler (figur 2C). CTR1 er til stede på cellemembranen i IGROV-1 og forskyver intracellulært til cytoplasma i IGROVCDDP (figur 2D, E). Det er noen sammenslutning av CTR1 med Golgi i IGROVCDDP men farging er konsistent gjennom cytoplasma.
Vogner som biomarkører av Platinum Opphopning Defect
En av de viktigste differensielt uttrykte gener i IGROVCDDP ble en nedgang i ekspresjon av Na
+ /K
+ pumpe (ATP1A1) (tabell 2), som tidligere har vært forbundet med platina akkumulering defekter [18]. Cisplatin er ikke transporteres ved ATP1A1 og endret membranpotensialet kan spille en rolle i passiv akkumulering av medikamentet. Det var en tilsvarende reduksjon i protein ekspresjon av ATP1A1 (figur 3A) og også en følsomhet overfor behandling med ATP1A1 inhibitoren ouabain [19] (Tabell 3). Men når 0,01 nM ouabain ble ko-inkubert i et cisplatin cytotoksisk analyse i stedet for å reversere resistens i IGROVCDDP det reduserte IC
50 av både de IGROV-1 og IGROVCDDP celler like, forble folden motstand mellom de to cellelinjene konstant (Tabell 3). IGROVCDDP var ikke motstandsdyktig mot NaCl eller KCl som enkle midler og tillegg av 40 mM av disse saltene ikke vesentlig endre cisplatin cytotoksisitet (data ikke vist).
Åpne barer er IGROV-en, fargede søylene er IGROVCDDP og stripete linjene viser behandling med 0,67 mikrometer cisplatin i 72 timer. A) ATP1A1 western blot. Representant bildet som vises. Grafen viser kvantifisering av n = 4 biologiske gjentar normalisert til p-aktin. B) MRP1 western blot. Representant bildet som vises. Grafen viser kvantifisering av n = 3 biologiske gjentar normalisert til p-aktin. * Indikerer signifikant forskjell fra IGROV-en p 0,05 t-test. MRP1 konfokalmikroskopi i C) IGROV-1 og D) IGROVCDDP celler. Ortogonale bilder vises for en sammenslått bilde av DAPI (blå) og MRP1 (grønn), piler på siden barer indikerer apikale (IGROV-1) og basolateral plassering av MRP1 (IGROVCDDP). FBP konfokalmikroskopi i E) IGROV-1 og F) IGROVCDDP celler. XY flyene er vist for DAPI (blå), aktin (rød) og FBP (grønn), et sammenslåtte bildet vises også.
Tidligere forskning har vist redusert uttrykk og en intracellulær forskyvning av membran proteiner MRP1 og FBP å være assosiert med en defekt i platina akkumulering i cisplatin-resistente cellelinjer [20]. Derfor undersøkte vi MRP1 og FBP som potensielle biomarkører av en defekt i platina akkumulering i IGROVCDDP. De IGROVCDDP celler har en reduksjon i mRNA-ekspresjonen av MRP1 (tabell 2), så vel som en liten reduksjon i MRP1 protein ekspresjon som reaksjon på behandling cisplatin (figur 3B). MRP1 fordeling ble undersøkt ved hjelp av konfokal mikroskopi (figur 3C, D). Beising i begge IGROV-1 og IGROVCDDP cellelinjer er tydelig i cytoplasma og perinukleære region med noen ansamlinger av MRP1 tydelig. I IGROV-1 er det flere MRP1 ovenfor og gjennom hele den blå linje på den ortogonale visningen som angir det er i den apikale og midtpartiet i cellene. Et flertall av flekker i IGROVCDDP er under den blå linjen det er basolaterally plassert. FBP er lokalisert i hovedsak i tilknytning til kjernen i løpet av diskrete sub-cellulær vesikler; lite cytoplasmatisk farge er innlysende (figur 3E, F). Det er ingen endring i cellulær distribusjon av FBP mellom IGROV-en og IGROVCDDP, men en nedgang i uttrykk for FBP i IGROVCDDP det fremgår av confocal bilder.
Åpne barer er IGROV-en, fargede søylene er IGROVCDDP og stripete linjene viser behandling med 0,67 mikrometer cisplatin. A) Total intracellulære glutation. Grafen viser n = 3 biologiske gjentar normalisert til celle nummer. B) γGCS western blot. Representant bildet som vises. Grafen viser kvantifisering av n = 4 biologiske gjentar normalisert til p-aktin. C) GSR western blot. Representant bildet som vises. Grafen viser kvantifisering av n = 3 biologiske gjentar normalisert til p-aktin. D) GSR enzym assay. Grafen viser n = 4 biologiske gjentar normalisert til celle nummer. E) GGT1 western blot. Representant bilde vist Grafen viser kvantifisering av n = 3 biologiske gjentar normalisert p-aktin. E) GGT1 enzym assay. Grafen viser n = 4 biologiske gjentar normalisert til celle nummer. * Indikerer signifikant forskjell fra IGROV-en p 0,05 t-test. # Indikerer signifikant forskjell fra IGROVCDDP ved tilsetning av cisplatin. G) Modulation av cisplatin cytotoksisitet av IGROV-en og IGROVCDDP med BSO.
Platinum Resistance i IGROVCDDP er assosiert med en økning i glutation Recycling ikke økt de novo syntese
mRNA uttrykk av glutation reduktase (GSR) og gamma-glutamyltransferase (GGT1) ble begge signifikant økt i IGROVCDDP (tabell 2). GSR funksjoner for å resirkulere oksiderte glutation i cellen [21], [22] og GGT1 resirkulerer glutation fra utsiden av cellemembranen [21], [22]. Proteinet uttrykk for GSR og GGT1 ble ikke økt i IGROVCDDP celler, ble GSR betydelig redusert i IGROVCDDP og det var ingen endring i GGT1. (Figur 4A og 4B). Imidlertid enzymaktiviteten av både GSR og GGT1 ble signifikant øket (figur 4C og figur 4D); som tyder på at glutation er resirkuleres mer innsiden og fra utsiden av cellen.
Åpne barer er IGROV-en, fargede søylene er IGROVCDDP og stripete linjene viser behandling med 0,67 mikrometer cisplatin i 72 timer. A) BRCA1 western blot. Representant bildet som vises. Grafen viser kvantifisering av n = 4 biologiske gjentar normalisert til p-aktin. * Indikerer signifikant forskjell fra IGROV-1 p. 0,05 t-test
IGROVCDDP cellene ikke har høyere nivåer av glutation, og nivåene er ikke økt med lavt nivå cisplatin behandling (figur 4E) . Nivåene av glutation var også mer variable i IGROVCDDP celler. Behandling med 12,5 uM butathione sulfoksiminforbindelser (BSO), en inhibitor av γGCS [23] signifikant redusert cellulær glutation i både IGROV-1 og IGROVCDDP-celler (data ikke vist). IGROV-1 og IGROVCDDP har også lignende protein ekspresjon av γGCS og det er ikke oppreguleres som respons på lavt nivå cisplatin behandling (figur 4F). BSO behandling også betydelig sensibilisert begge cellelinjene til cisplatin (figur 4G). Effekten var tilsvarende og cisplatin fold-resistens forble konstant (18,76 fold). De IGROVCDDP cellene tendens til å være mer følsomme for BSO behandling alene i en cytotoksisitet analysen, men dette var ikke signifikant (figur 4G).
IGROVCDDP har økt BRCA1 Expression
Økt uttrykk for DNA reparasjonsgenet BRCA1 har tidligere blitt assosiert med cisplatin motstand [24]. IGROVCDDP cellene har økt mRNA (tabell 2) og protein uttrykk for BRCA1 (figur 5A).
Diskusjoner
P-gp Overuttrykte er uvanlig i en modell av ervervet Cisplatin Resistance
Motstand mot paclitaxel i IGROVCDDP celler blir mediert av en overekspresjon av P-gp i genet (tabell 2) og proteinnivå (figur 1A). P-gp har vist seg å være funksjonelt aktiv ved cytotoksisitetsanalyser (figur 1C) og epirubicin akkumulering analyser (figur 1B). I motsetning til andre studier [25], ble kortvarig cisplatinbehandling ikke modulerer P-gp proteinekspresjon, aktivitet eller cytotoksisitet i taksan IGROVCDDP celler (figur 1A, 1B, data ikke vist). Det er uvanlig, men ikke enestående å se en modell av ervervet cisplatin motstand overuttrykke P-gp (tabell 4) [26] – [30]. Dette representerer sannsynligvis en generell stressrespons til langsiktig cisplatin behandling som cisplatin er ikke en P-gp-substrat [13]. P-gp kan være oppregulert som en del av en respons til økt reaktive oksygenarter (ROS) i en celle [31]. Dette kan være grunnen til at P-gp-ekspresjon ble indusert i IGROVCDDP som ROS blir også produsert i respons til cisplatin [32]. Men som IGROVCDDP cellene dyrkes uten cisplatin i media, synes det å være enten en annen stimulans favoriserer uttrykk for P-gp eller P-gp er å gi en selektiv fordel å IGROVCDDP celler.
Mange modeller av ervervet resistens vil ha overekspresjon av en transportør som effluxes stoffet som ble brukt til å utvikle modellen. Colchicine, en P-gp-substrat [33] valgt for P-gp overekspresjon i KB-8-5-11 celler [34] og epirubicin, en MRP1 substrat [35] indusert MRP1 uttrykk i CCRF-CEM /E1000 [36]. Imidlertid, metotreksat, fluoruracil, klorambucil, cisplatin, og hydroksyurea har alle vist seg å transient indusere ekspresjonen av P-gp i K562-leukemiceller når disse stoffene er ikke P-gp-substrat [15]. Deretter er det opp til naturlig seleksjon hvis cellene som forbigående uttrykker P-gp har andre overlevelsesfordel og blir en del av multiresistent cellelinje. I noen cisplatin-resistente modeller som overuttrykker P-gp, har P-gp ingen overlevelse fordel som ikke er funksjonelt aktiv (SNU-601 /Cis10 – Tabell 4) [29]. Innenfor cisplatin-motstandsdyktig P-gp-overekspresjon cellelinjer kan det også være heterogenitet; i SKOV3 /CIS P-gp positive og negative populasjoner ble opprettholdt etter behandling med cisplatin, noe som indikerer at P-gp har ingen overlevelse fordel for cisplatin behandling [27]. Imidlertid kan P-gp har anti-apoptotiske virkninger forskjellige fra de som er forbundet med transport av cytotoksiske medikamenter, og noen kan være mediert gjennom effluks av pro-apoptotiske glukosylceramid [37], [38]. Det er også mulig at noen xenobiotisk tilstede i FCS anvendt for å dyrke cellene kan bidra til å opprettholde P-gp-ekspresjon i IGROVCDDP.
IGROVCDDP er den eneste cisplatin-resistente modell utviklet fra IGROV-1 er kjent for å overuttrykke P-gp og dermed ha en platina /taxan-resistent fenotype. Cisplatin-resistente modeller IGROV-1 /Pt0.5 og IGROV-1 /Pt1 [39] har det inverse platina /taxan-resistente fenotype. Andre cisplatin-resistente IGROV-1 modeller har blitt utviklet (IGROV-R10, IGROV-1 /CP), men de ser ikke ut til å ha blitt undersøkt for resistens mot P-gp-substrater eller P-gp uttrykk. Imidlertid har P-gp ikke blitt identifisert som forskjellig uttrykt av genomisk eller proteomikk profilering [40] -. [44]
Platinum Resistance er Multifaktoriell
Platinum motstand i IGROVCDDP cellene er multifaktoriell og innebærer glutation sti og redusert akkumulering av stoffet. Dette kan resultere enten fra en kompleks regulatorisk sti som styrer mange forskjellige mekanismer for utviser resistens mot cisplatin, eller kan reflektere det faktum at cellene ble selektert i flere trinn, og kunne derfor ha akkumulert forskjellige mekanismer i hvert trinn.
IGROVCDDP celler er lavt nivå motstandsdyktig mot CuSO
4 foreslå en rolle av kobber transport i platina motstand (figur 2A).
