Abstract
Vav1 er et signal transduser protein som fungerer som en guanin nukleotid utveksling faktor for Rho /Rac GTPases i det hematopoetiske system hvor det er utelukkende uttrykt. Nylig Vav1 ble vist å være involvert i flere menneskerettighets maligniteter inkludert nevroblastom, lungekreft og bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDA). Selv om noen faktorer som påvirker
vav1
uttrykk er kjent, verken fysiologisk eller patologisk regulering av
VAV
en uttrykk er helt forstått. Vi viser her at mutasjoner i antatte transkripsjonsfaktor bindingsseter på
VAV
en promoter påvirke transkripsjon i celler av forskjellig histologisk opprinnelse. Blant disse områdene er en konsensus stedet for c-Myb, en blodkreft spesifikk transkripsjonsfaktor som også finnes i Vav1-uttrykke lunge kreft cellelinjer. Nedbryting av c-Myb bruker siRNA førte til en dramatisk reduksjon i
VAV
en uttrykk i disse cellene. I samsvar med dette, co-transfeksjon av c-Myb aktivert transkripsjon av en
vav1
promoter-luciferasereportergenet konstruere i lungekreftceller blottet for Vav1 uttrykk. Sammen utgjør disse resultatene indikerer at c-Myb er involvert i
VAV
en uttrykk i lungekreftceller. Vi har også utforsket metylering status for
VAV
en promoter. Bisulfite sekvensering viste at
VAV
en promoter var helt unmethylated i humane lymfocytter, men metylert i varierende grad i vev som normalt ikke uttrykker
VAV
1.
VAV
en promoter inneholder ikke CpG øyer i nærhet til transkripsjonsstartsetet; men viste vi at metylering av en CpG dinucleotide på en konsensus SP1 bindingssete i
VAV
en promoter forstyrrer proteinbinding
in vitro
. Våre data identifiserer to reguleringsmekanismer for
VAV
en uttrykk: binding av c-Myb og CpG metylering av 5 «regulatoriske sekvenser. Mutasjon av andre antatte transkripsjonsfaktor bindingssteder antyder at flere faktorer regulerer
vav1
uttrykk samt
Citation. Ilan L, Katzav S (2012) Menneskelig Vav1 uttrykk på Hematopoietic og kreft cellelinjer er regulert av c-Myb og av CpG Metylering. PLoS ONE 7 (1): e29939. doi: 10,1371 /journal.pone.0029939
Redaktør: Pierre-Antoine Defossez, Université Paris-Diderot, Frankrike
mottatt: 16 august 2011; Godkjent: 07.12.2011; Publisert: 11 januar 2012
Copyright: © 2012 Ilan, Katzav. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet med tilskudd fra Israel Academy of Sciences, Israel Cancer Research Foundation, den israelske Kreftforeningen og Hubert H. Humphrey senter for eksperimentell medisin og kreftforskning. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
spesifikasjon og vedlikehold av vev er en grunnleggende del av utviklingen, mediert delvis av hierarkiske nettverk av transkripsjonsfaktorer og
cis
regulatoriske elementer som styrer genuttrykk. I tillegg somatisk epigenetisk arv, særlig gjennom DNA metylering og kromatin remodeling, spiller en avgjørende rolle i å regulere utviklingen av flercellede eukaryote organismer [1].
hematopoiesis er en av de best studerte eksempler på utvikling og differensiering fra stamcelle vedlikehold til avstamning engasjement og differensiering [2].
Vav
1-ekspresjon, noe som er strengt begrenset til hematopoetiske system [3], blir oppregulert i aorta-gonade-mesonephros (AGM) region av embryoet i løpet av overgangen fra primitive til definitiv hematopoiesis [4] og deretter blir uttrykt bare i celler i det hematopoetiske system voksen [3]. Årsmøtet er en viktig intraembryonic kilde til blodkreft stamceller og utseendet på disse stamcellene korrelerer med oppregulering av
VAV
1 uttrykk. Definitive blodkreft stamceller synes å skille fra den ventrale hemogenic endotelet i dorsal aorta og angi utvikle sirkulasjonssystemet til frø fosterets lever [5], hvor erythrocytisk, myeloid og lymfoide linjene utvikle. Hos nyfødte og voksne mus,
vav
1 uttrykkes spesifikt i hematopoetiske celler fra thymus, lymfeknuter, benmarg, milt og [5]. Vav1 ble først identifisert i en skjerm for onkogener hvori NIH3T3-celler ble transfektert med DNA fra flere esophageal karsinomer [3]. Nukleotidsekvensanalyse avdekket at Vav1 onkogen ble aktivert
in vitro Hotell og det isolerte mutant formen var ikke til stede i den opprinnelige svulsten prøven [3].
Flere karakteristiske strukturelle motiver aktiver Vav1 signal svinger funksjon [6] – [8]. Det mest kjente funksjon av Vav1 er som et GDP /GTP-bytte faktor for Rho /Rac, en funksjon strengt kontrollert av tyrosinfosforylering [6] – [8]. Rho /Rac aktivering fører til cytoskeletal omleiring under aktivering av T-celler [6] – [8]. Det er også økende bevis som tyder på at Vav1 har andre effekter som er uavhengige av sine valutavirksomhet, herunder å modulere JNK, ERK, Ras, NF-kB, og NFAT veier. Disse effektene er sannsynligvis mediert av Vav1 sin modulære domener via interaksjon med andre proteiner, inkludert SHC, NCK, SLP-76, GRB2, og Crk [6] -. [8]
Vi i utgangspunktet preget
VAV
en promoter for 20 år siden [9]. Analyse av promoter-regionen bestemt transkripsjonen startsetene og indikerte at promoteren mangler identifiserbare kjerne promotorelementer slik som en TATA-boks eller en initiator. Men det gjør det inneholde flere konsensusbindingssteder for begge allestedsnærværende (f.eks SP1, AP-1, og AP-2) og vev-restricted (GATA, MYB, OCT, og ETS proteiner) transkripsjonsfaktorer [9]. Muse-promoteren ble klonet i ettertid [10], [11]. RNase beskyttelse eksperimenter ble utført på mRNA fra cellelinjer er representative for forskjellige hematopoietiske linjer. Alle disse RNA prøver ga et mønster av fragmenter som korresponderer til en klynge av store og små områder start 95-133 bp oppstrøms fra translasjons-initierings-kodonet, i nærheten av de flere startsider kartlagt for det humane
vav
en mRNA [10 ], [11]. Dermed vil en enkelt
VAV
en promoter ser ut til å være operativ i løpet av blodkreft rommet. Som forventet, arrangøren av
VAV
1 ble vist å drive transgene uttrykk i multipotente hematopoetiske stamceller bosatt i benmargen av voksne mus samt i ulike blodkreft organer [12] – [14]. For eksempel ble flere uavhengige linjer på menneske NPM-ALK transgene mus generert ved hjelp av blodkreft celle-spesifikke
VAV
en promoter. Denne nye transgene modellen leveres et system for å undersøke onkogene hendelser mediert av NPM-ALK in situ [14]. Også lentivirale vektorer som uttrykker den felles cytokin reseptor gamma-kjede under kontroll av den proksimale
vav
1-genpromoteren ble vist å være effektiv for korrigering av signaleringsfeil og X-bundet alvorlig kombinert immunsvikt (SCID-X1) sykdom fenotype i en musemodell [13].
Selv om
VAV
en promoter har blitt brukt til å kjøre spesifikke uttrykk i hematopoetiske system, lite er kjent om transkripsjonsfaktorer som regulerer sin aktivitet. I en serie av studier, Denkinger
et al.
Vist at PU.1 er avgjørende for transkripsjonen aktivitet av
vav
en promoter i myeloide celler, men ikke i andre hematopoetiske celler [15] . Videre Vav1 og PU.1 rekrutteres til CD11b promoter i APL-avledede promyelocytter, noe som tyder på at ATRA-indusert økning av Vav1 ekspresjon og tyrosinfosforylering kan være involvert i å rekruttere PU.1 til dens konsensus sekvens på CD11b promotoren og, slutt, i regulering CD11b uttrykk i de sene stadier av nøytrofile differensiering av APL-avledet promyelocytter [16].
Vav1 mutasjoner har ikke blitt oppdaget så langt i menneskelig kreft. Derfor, selv om forkortede versjoner av Vav1 mangler aminoenden transformere NIH3T3-fibroblaster [9], [17] og virke synergistisk med aktiv Ras i transformasjon [18], [19], deres rolle i human tumorgenese er omstridt [20]. En rekke grupper, inkludert våre, har oppdaget at ektopisk ekspresjon av Vav1 i neuroblastom [21], bukspyttkjertel ductal adenokarsinomer (PDA) [22] og lungekreft [23]. Disse funnene tyder på at ektopisk Vav1 uttrykk kan være et mer generelt fenomen som påvirker flere krefttyper. Bestemme hva som driver avvik Vav1 uttrykk i vev utenfor hematopoetiske system er viktig for å forstå Vav1 engasjement i menneskelig kreft.
Vår nåværende studie avslører involvering av blodkreft transkripsjonsfaktor c-Myb i uttrykket av
VAV
1 i lunge kreftceller. Vi viser også bidraget fra CpG dinucleotide metylering av
VAV
en promoter til uttrykk i blodkreft og kreft celler.
Materialer og metoder
Cellelinjer
Jurkat (akutt T-celle leukemi, bes gitt til oss av Dr. Weiss [24]), U937 (monocytter, histiocytisk lymfom [25]), H441 (lunge papillær adenokarsinom, bes gitt til oss av legene. Gazdar og Minna [ ,,,0],26]), H460 (stor celle lungekreft bes gitt til oss av legene. Gazdar og Minna [26]) og H358 (bronchioalveolar Non-Small lungekarsinom, bes gitt til oss av legene. Gazdar og Minna [26]) ble cellene dyrket i RPMI-medium. Panc1 (pankreasgang epithelioid karsinom, bes gitt til oss av Dr. Billadeau [22]) og A549 (lunge epithelial karsinom, bes gitt til oss av legene. Gazdar og Minna [26]) celler ble dyrket i DMEM medium (Sigma). Alt medium ble supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS), penicillin-streptomycin og L-glutamin (Biological Industries, Israel), og cellene ble holdt ved 37 ° C med 5% CO
2.
Arrangøren-reporter konstruerer og seterettet mutagenese
ildflue luciferase vektor pGL3-grunnleggende og
Renilla
luciferase vektor PRL-CMV (Promega, USA) ble brukt i denne studien. Den proksimale 5 «region av human
vav
1-genet [-287 til 301 i forhold til transkripsjons-startsetet (TSS)] ble klonet med primere lil30 og lil32 (tabell 1) og er satt inn i leseramme inn i pGL3 -Grunnleggende reporter vektor hjelp SacI og Xhol restriksjonssetene for å skape konstruere LE2. LE2 ble deretter anvendt som templat for å generere en serie av punktmutasjoner og delesjoner (tabell 1). PCR-reaksjonene ble utført ved anvendelse av Pfu-polymerase X (Jena Bioscience, Tyskland) under de følgende betingelser: 94 ° C, 5 min; 35 sykluser av (94 ° C i 15 sekunder, og 55-62 ° C i 30 sekunder, 72 ° C i 1 min for lil30 og lil31, og i 4 minutter for de andre primerparene som beskrevet i tabell 1). PCR-produktene ble renset fra 1% agarosegel ved hjelp av veiviseren SV Gel og PCR Clean-Up System (Promega, USA). Den lil30-32 fragment ble spaltet med SacI og Xhol restriksjonsenzymer og ligert inn i pGL3-vektoren ved bruk av Fast-Link DNA-ligeringssett (Epicentre, USA). PCR-produkter på nettstedet-retning mutagenese ble selv ligert.
Forbigående transfections og luciferase reporter analysen
celler ble sådd og transfektert etter 24 timer under forhold som er vist i Tabell 2. Celler ble høstes 24 eller 48 timer etter transfeksjon. Luciferase reporter-analyser ble utført med Dual-luciferase reporter System (Promega, USA) ved anvendelse av Luminometer Mithrassystemet (Berthold Technologies, Tyskland). For de c-Myb overekspresjon eksperimenter, 1 mikrogram av c-Myb uttrykker plasmid (Åpne Biosystems, USA # 6069320) ble ko-transfektert med LE2 reporter konstruere og
Renilla
inn H460 celler. Cellene ble høstet 24 timer etter transfeksjon. Metylert LE2 plasmid ble fremstilt ved bruk CpG metyltransferase (M.SssI) (New England Biolabs, USA).
Bisulfite sekvense
DNA fra normale menneskelige vev ble hentet fra BioChain (USA) . Bisulfitt Reaksjonen ble utført ved anvendelse av EZ DNA Metylering-Direct Kit (Zymo Research, USA). Sekvensene av interesse ble amplifisert ved PCR med primere lil11 (ACACACCTAAACCCCATC) og lil53 (GGGTTGGATTAGATAGAGGA) ved anvendelse av 2 ul av 10 ul samlet volum av bisulfitization reaksjonen, Tm = 55 ° C, 35 sykluser. PCR-produktene ble renset og klonet inn i pGEMT plasmid (Promega, USA). Ligerte plasmider ble brukt til å transformere DH5a-kompetente celler. PCR ble deretter utført på bakteriekolonier med standard primere for T7 og SP6 arrangører. PCR-produkter av riktig lengde ble sekvensert ved Macrogen (Korea).
Elektro mobilitet shift analyse (EMSA)
Nuclear ekstrakter ble isolert som beskrevet [15]. For å oppnå korte dobbelt-trådede DNA-prober, ble enkelt-trådede oligonukleotider (IDT, USA) (tabell 3) glødet og deretter merket med Digoxigenin Oligonukleotid 3′-ende Labeling Kit (Roche, Sveits). Den lange villtype LE2 probe ble laget ved PCR med Digoxigenin merkede primere lil46 (5′-GCTGCAGGTGCTCC-3 «) og lil47 (5′-CCTGCTCGCCTGTG-3») ved hjelp av LE2 plasmid som et DNA-templat. For sonder som inneholder mutasjoner, ble samme primere anvendt og tilsvarende mutert plasmid ble brukt som en mal. DNA-protein-bindingsreaksjoner ble utført ved romtemperatur i 15 minutter i et totalvolum på 20 ul. Reaksjonsblandingen inneholdt 60 fmole merket DNA-probe, 4 ug kjerneekstrakt, 2 ug poly (dI • dC) og bindingsbuffer (1 mM Tris pH 7,5, 7,5 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1 mM DTT, 0,7% glyserol). For konkurranseanalyser, 1- til 10-fold umerket dobbeltkjedet DNA ble tilsatt i reaksjonsblandingen 10 min før den merkede probe tilsetningen. Reaksjonsblandingene ble deretter separert på 4% ikke-denaturerende polyakrylamidgel. Elektroforese ble utført i 0,5 x TBE-buffer ved romtemperatur ved 60 volt i 1 time. DNA-proteinkomplekser ble overført til positivt ladet nylonmembran (Roche, Sveits), tverrbundet ved UV hjelp av UV Stratalinker 2400 (Stratagene, USA). Digoxigeninmerket DNA ble påvist med DIG Gel Shift Kit, 2
nd generasjon, ved hjelp av CDP-Star substrat (Roche, Sveits). Bilder ble eksponert for røntgenfilmer i 15-20 min.
Utglødning
Lyofiliserte komplementære oligonukleotider ble fortynnet til 100 uM, og deretter blandet i ekvimolare konsentrasjoner i sammensmeltningsbuffer (10 mM Tris, pH 7,5-8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) for endelig konsentrasjon på 3 pM hver. Annealing Blandingen ble oppvarmet til 100 ° C i 5 minutter og langsomt avkjølt til 30 ° C i løpet av 1 time.
RNA isolering og revers transkripsjon
RNA isolert med TRIzol-reagens (Invitrogen, USA). Total RNA (2 pg) ble reverstranskribert med M-MLV-polymerase og tilfeldig heksamer primer (Promega, USA) i et totalt reaksjonsvolum på 20 ul. PCR ble utført med GoTaq Grønn Master Mix (Promega, USA) og 1 pl av cDNA; for aktin påvisning cDNA ble fortynnet tidobbelt. Grunning for de ulike genene er oppført i Tabell 4.
Immun analysen
Jurkat, H441 og H460 cellelinjer ble behandlet for protein utvinning og Western blotting ved hjelp av standard prosedyrer. I korthet ble cellene vasket to ganger i PBS og lysert i lyseringsbuffer (50 mM Tris pH 7,6, 150 mM NaCl 5 mM EDTA, 0,5% NP40) inneholdende proteaseinhibitorer (0,1 mM fenyl-metyl-sulfonyl-fluorid; Halt Protease Inhibitor cocktail (Thermo Scientific), 5 mM EDTA), ble holdt ved 4 ° C i 15 minutter, sentrifugert i 10 minutter ved 12000 g og supernatantene ble samlet. Tjuefem mikrogram av proteinlysatene ble løst på 8% SDS-PAGE. Løst proteiner ble overført til nitrocellulosemembranen. Etter kort vasking i TBST (50 mM Tris * HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,2% Tween), ble membranene blokkert i 3% BSA i 1 time og deretter inkubert med primære antistoffer for c-Myb (Santa Cruz), Vav1 (Upstate Biotechnology Inc., USA), og β-aktin (Santa Cruz) (fortynnet i 1% BSA i TBST) over natten ved 4 ° C. Membranen ble deretter vasket (3 x 10 min) i TBST ved romtemperatur og probet med 1:10000 fortynnet pepperrot-peroksidase-konjugert anti-mus eller anti-kanin sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur og vasket 3 x 10 minutter med TBST . Signalet ble oppdaget med en ECL chemiluminescence kit (Pierce, USA).
Resultater
Den minimal promoter regionen av menneskelige vav1 og dens vev spesifikke uttrykk
Sekvensene av minimal promoter-regionen i menneskelige og murine
VAV
en har blitt publisert (Gene ID: 7409 og Gene ID: 22324, henholdsvis). Analyse av den menneskelige
VAV
en promoter med TESS (transkripsjon Element Search System; https://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess) avslører mange mulige bindingsseter for transkripsjonsfaktorer inkludert ETF, SP1, E2F, NF-e, c-Myb, TCFα, PU.1 og ELF-en (figur 1, eske). I tillegg inneholder arrangøren 8 potensielle CpG metylering områder (figur 1, uthevet i rødt og nummererte vilkårlig 1-8).
Bokser indikere mulige bindingssteder for ulike transkripsjonsfaktorer som spådd av bioinformatikk. Deres plassering er angitt i forhold til transkripsjonsstartsetet (1 stilling). Antatte nettsteder for CpG metylering er uthevet i rødt, er deres vilkårlige serienumre sirklet i grønt.
Tissue-spesifikke uttrykket av gener kan oppnås ved aktiviteten av vevs-spesifikke transkripsjonsfaktorer samt forskrift av affiniteten mellom DNA-bindende faktorer og promotersekvenser. Å identifisere regulatoriske sekvenser som kreves for den begrensede uttrykk for
VAV
en, vi generert en pGL3-
VAV
en reporter konstruksjon (LE2) som inneholder de minimale regulatoriske sekvenser av
VAV
1 proksimale promoter-regionen [fra nukleotid (nt) -287 til 301 i forhold til transkripsjonsstartsetet (TSS)] oppstrøms en luciferasereportergenet. For å bekrefte at uttrykket av LE2 korresponderer med den endogene uttrykk for
VAV
1 i celler i ulike histologiske opprinnelse, ble plasmidet transfektert inn Jurkat T-celler og U937 monocytt celler der
VAV
1 uttrykkes fysiologisk, og inn i H441 lungekreftceller, hvor det er abnormt overuttrykt [23]. LE2 ble også transfektert inn
VAV
1-negative cellelinjer: lungekreftceller H460 og A549 [23]) og kreft i bukspyttkjertelen cellelinje Panc1 [22] (figur 2A).. Etter transfeksjon, ble luciferase uttrykt ved høye nivåer i Vav1-uttrykkende celler (Jurkat, U937 og H441), men uttrykket nivået var svært lavt i
VAV
1-negative cellelinjer (H460, A549 og Panc1 ) luciferase-ekspresjon i H441 lungekreftceller var enda høyere enn i Jurkat T-celler (fig. 2A).
(A) ekspresjon av vill-type (wt) luciferase reporter-gen (LE2) i cellelinjer fra forskjellige vev opprinnelse. LE2 ble transfektert inn i de cellelinjer som beskrevet i Materialer og Metoder, og luciferase-aktiviteten ble målt 24 timer senere. Data viser luciferase-aktivitet normalisert til
Renilla
transfeksjonseffektivitet kontroll og beregnet i forhold til den luciferaseaktivitet av en tom vektor uttrykk, pGL3. Eksperimentene ble gjentatt fem ganger. (B) Skjematisk kart over 5 «regulatorisk område av den menneskelige
VAV
1 genet. Tre antatte transkripsjonsfaktorbindingssteder er markert med bokser. De endringer som er gjort i disse regionene er som følger: nukleotidsubstitusjoner (rød) og slettinger (skjeve linjer). (C) Virkningen av disse mutasjonene /delesjoner ble analysert i Jurkat T-celler U937 myeloide celler og H441 lungekreftceller. Etter transfeksjon med plasmider inneholdende luciferase i henhold til vekt (LE2) eller mutert
vav
en promoter, luciferase-aktiviteten ble målt og brette induksjon av aktivitet ble beregnet i forhold til aktiviteten av LE2. Forsøkene ble gjentatt fem ganger. Statistikk ble utført ved hjelp av uparet student T test. (**) Angir p 0,05 verdi og (***) indikerer p. 0,01
For å karakterpromotorområdene som er involvert i
VAV
en uttrykk, skapte vi flere poeng mutasjoner og delesjoner i den forutsagte transkripsjonsfaktorbindingsseter (vist i figur 2B) og testet ekspresjon av reporter-konstruksjoner som bærer disse mutasjoner i forskjellige cellelinjer (figur 2C). Våre resultater viser klart at hver enkelt nukleotid substitusjon eller delesjon i antatte transkripsjonsfaktorbindingssekvenser reduserte aktiviteten av promoteren sammenlignet med villtype-konstruksjon, LE2 (Fig. 2C). For noen mutanter, vi også observert signifikante forskjeller mellom deres uttrykk i Jurkat, U937 og H441 celler. For eksempel er LE12, LE15 og LE17 bedre uttrykt i Jurkat T-celler enn i U937 celler, noe som viser at selv blant celler av hematopoietisk opprinnelse, er det forskjeller i reguleringen av
VAV
1 uttrykk. LE15 og LE17 bære mutasjoner i PU.1 bindingssetet, støtter behovet for PU.1 bindende i U937 celler. Dette er i overensstemmelse med tidligere rapporter om differensial krav til PU.1 til Vav1 ekspresjon i forskjellige hematopoetiske celler [15]. LE7 og LE12, som har basepar erstatninger i en antatt E2F /NF-e /c-Myb bindingssetet, utstillings betydelig redusert luciferaseekspresjon i hematopoetiske celler; imidlertid har disse mutasjonene har bare en liten virkning på luciferase-ekspresjon i H441 lungekreftceller. Delesjon av hele E2F /NF-e /c-Myb stedet (LE13) opphever luciferase-ekspresjon i alle cellelinjene som ble brukt i denne studien. En punktmutasjon i ETF /SP1 bindingssetet (LE19) har en mindre effekt på reporter genuttrykk i blodkreft cellelinjer enn i lungekreft cellelinje, men igjen, sletting av hele bindingssetet (Le20) opphever luciferase uttrykk i alle cellelinjer ble undersøkt i denne undersøkelsen. Mutagenese i TCFα /PU.1 /ELF-1-bindingssete (LE15 og LE17) avtar luciferase-ekspresjon i en tilsvarende måte i alle cellelinjer. Dermed våre resultater peker til involvering av flere transkripsjonsfaktorer i regulering Vav1 uttrykk i celler av forskjellig histologisk opprinnelse.
For å finne ut om disse mutasjonene endrer binding av kjerneproteiner til
VAV
en promoter utførte vi en elektromobilitet skift analysen (EMSA). Digoxigeninmerket dobbel-strandet oligonukleotider som omfatter nukleotider -98 til 25 (lil 46-47) av
VAV
en promoter (Fig. 3) ble brukt som prober i nærvær av kjernefysiske utdrag fra Jurkat og H441 celler. Villtype oligonukleotid og oligonukleotider med mutasjoner som korresponderer med mutasjoner i rapportør konstruksjonene (fig. 2B) ble anvendt. De proteinkomplekser som settes sammen på villtype DNA-sekvensen i det kjernefysiske ekstrakt vises som fem hovedbånd (merket 1-5) i begge cellelinjer; avviker imidlertid intensiteten av disse båndene mellom de to (fig. 3 nederst). Dermed bandet 5 utstillinger en høyere intensitet i kjerneekstrakt fra H441 celler enn i kjerneekstrakt fra Jurkat T-celler (19,2% vs. 4,9%). Binding av proteinet komplekset representert ved bånd 5 er delvis eller helt borte i noen av de muterte sekvensene anvendt i denne studien (Fig. 3). Dette båndet forsvant fullstendig i den GA AC og sletting (-25 til 38) mutanter i Jurkat T-celler, mens i H441 den forsvant bare i den -25 til 38 mutant sletting, og dermed potensielt tilsvarende tap av promoter-aktivitet av delesjonen mutasjon i H441-celler (fig. 2C). I tillegg er intensiteten av båndet 4 er lavere i den GA AC og sletting (-25 til 38) mutanter i Jurkat T-celler, mens den ikke endrer seg i H441-celler (Fig. 3). Disse resultatene indikerer klart at det er forskjeller i proteinkomplekser montert på den promoter-regionen i celler fra forskjellige opprinnelse. Våre data indikerer at regionen i
VAV
en promoter mellom -98 og +25 er kritisk for
VAV
en uttrykk i ulike cellelinjer og koder antatte bindingssteder for flere transkripsjonsfaktorer.
Elektroforetisk mobilitet skift analyse (EMSA) med Jurkat og H441 nukleære ekstrakter ble utført i nærvær av lil46-47 digoxigenin-merket probe (nukleotider -98 til +28 av
vav1
promoter). For å fremstille de mutante oligonukleotidene, de tilsvarende muterte plasmider (vist på Fig. 2B viser skjematisk) ble anvendt som templat for PCR. En skjematisk av
VAV
en 5 «regulatoriske sekvenser, ekson 1 og relativ oligonukleotid posisjon vises nederst. Bundet proteinkomplekser er nummerert fra 1 til 5. Pilen viser posisjonen av komplekset 5, den tyngste kompleks som er følsom for mutasjonene innført i oligonukleotidsekvensen. De nederste paneler av figuren skjematisk viser den relative intensiteten av båndene 1-5 av EMSA eksperiment som bestemmes av densitometry (ImageJ programvare).
c-Myb er involvert i reguleringen av vav1 uttrykk i blodkreft og lungekreftceller
PU.1 utstillinger spesifisitet for myeloid celle avstamning, som rapportert tidligere [27] – [29], de fleste av de andre transkripsjonsfaktorer synes å være ubikvitært uttrykt, men ved forskjellige nivåer. En transkripsjonsfaktor som kan påvirke nivået av
VAV
en uttrykk i lungekreftceller er c-Myb. c-Myb er sterkt uttrykt i umodne hematopoetiske celler og er nedregulert i løpet av differensiering [30], [31]. For å avgjøre om c-Myb bindingssetet i
VAV
en promoter deltar i produksjon av protein komplekser, vi brukte en dobbel oligonukleotid omfatter bindingssetene for transkripsjonsfaktorene E2F /NF1-e /c-Myb og TCFα /PU.1 /ELF1 (lil 157-158, tabell 3). Mutasjoner introdusert i den c-Myb bindingssetet (TT AA) påvirket affiniteten av Jurkat T-celler proteinkomplekset, som bestemt ved en konkurranseanalyse (figur 4A.), Mens effekten av en mutasjon i E2F-bindingssetet (GA AC ) hadde en mindre effekt (fig. 4A). Ved å bruke et kortere oligonukleotid som inneholder kun den c-Myb /E2F-bindende sete (tabell 3, lil87-88); Vi la merke til at bare ett proteinkompleks dannes med nukleære ekstrakter av Jurkat T-celler (Fig. 4B). Dette proteinkompleks er helt avbrutt når TT AA mutasjon (c-Myb bindingssetet) anvendes, mens GA AC-mutasjon (E2F-bindingssetet) fremdeles danner et tilsvarende bånd til villtype-oligonukleotid (WT), om enn i et lavere nivå (fig. 4B). I overensstemmelse med resultatene av figur 4A, mutasjon i c-Myb redusere evnen av proteinkomplekset til å binde DNA og GA AC substitusjon har en mindre, men signifikant effekt
(A) Elektroforetisk mobilitet shift assay. (EMSA) med Jurkat-nukleære ekstrakter ble utført i nærvær av digoxigenin-merket probe som spenner over nukleotidene -45 til 0 på
vav1
promoter og inneholdende E2F /NF-e /c-Myb og TCFα /PU.1 /ELF1 bindingssteder (lil157-158, Tabell 3). Den konkurranseanalyse ble utført med det merkede oligonukleotid og umerkede konkurrerende oligonukleotider med punktmutasjoner som angitt i tabell 3 i et molart forhold på 01:01 og 01:05. Pilen viser posisjonen av komplekset, som viser følsomheten til de innførte mutasjoner. (B) EMSA utført med merket oligonukleotid som bare inneholder E2F /NF-e /c-Myb bindingssete (lil 87-88, tabell 3).
For å kunne fastslå om c-
myb
er involvert i Vav1 uttrykk, analyserte vi til uttrykk i celler i ulike histologiske opprinnelse og fant at
c-myb
mRNA og protein er til stede i Jurkat T-celler og på lavere nivåer i H441 lungekreft celler, men er neppe synlig i H460 lungekreftceller som ikke uttrykker
VAV
1 (fig. 5A). For å undersøke hvorvidt c-Myb deltar i reguleringen av
vav
1-ekspresjon, vi ko-transfektert en c-Myb ekspresjonsvektor med enten tom vektor eller med LE2 inn i H460-celler (Fig. 5B). Co-trasnfection av
c-myb
med LE2 signifikant øker ekspresjonen av reportergenet i forhold til ekspresjon av LE2 alene (øvre panel). Vi bestemmer også nivået av
c-myb
mRNA og protein uttrykk i de transfekterte cellene (nedre panel). Nedregulering av
c-myb
ved transfeksjon av siRNA inn i H441 lungekreftceller signifikant redusert
vav
1-ekspresjon (fig. 5C). Til sammen tyder disse resultater på at c-Myb spiller en rolle i reguleringen av
vav
1-ekspresjon i epitel-lungekreftceller.
(A) Endogen uttrykk for
c-myb
mRNA i Jurkat T-celler, H441 (
VAV
1-positiv) og H460 (
VAV
1-negative) lungekreftcellelinjer ble oppdaget av RT-PCR og Western blotting. (B) tom vektor pGL3 eller LE2 vekt- reporter-konstruksjonen ble transfektert enten alene eller sammen med en c-Myb-uttrykkende plasmid inn i H460-lungekreftceller (som i Materialer og Metoder). Luciferase-aktiviteten ble målt 24 timer etter transfeksjon (øvre panel). Luciferase-aktivitet er uttrykt som gangers induksjon i forhold til basis pGL3 uttrykk. Verdiene er middelverdien for fem uavhengige eksperimenter; signifikans ble bestemt ved hjelp av uparet student T test. (***) Indikerer p 0,01. Den nederste panelet viser nivået på
c-myb Hotell og aktin mRNA og protein uttrykk i de transfekterte cellene som bestemmes av RT-PCR og Western blotting hhv. (C) H441 lungekreftceller ble transfektert med enten egge DNA (-) eller med siRNA mot c-Myb. Sytti-to timer senere, mRNA nivåer av
c-myb
,
vav1 Hotell og
aktin
ble oppdaget av RT-PCR.
Metylering av individuelle CpG-områdene i human vav1 promoter er viktig for regulering av dets ekspresjon
endringer i DNA tilgjengeligheten for DNA-bindende faktorer som også deltar i reguleringen av genekspresjon. En mekanisme som påvirker DNA tilgjengelighet er metylering av CpG dinukleotider på bestemte proteinbindingsseter [32]. Det har blitt vist at epigenetiske modifikasjoner, inkludert metylering, spiller en viktig rolle i avvikende
VAV
en uttrykk i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer [22]. Men denne studien ikke tyde mekanisme i dybden. For å begynne å vurdere hvilken rolle metylering i reguleringen av Vav1 uttrykk, analyserte vi metylering av
VAV
en promoter i prøver fra forskjellige normale menneskelige vev (tabell 5). Om 600 bp av
VAV
1 promotersekvenser oppstrøms og nedstrøms av TSS ble analysert ved bisulfite sekvensering. Påfallende, i lymfocytter, observerte vi ingen metylering av en hvilken som helst av de antatte CpG metylering områder sekvensert. I motsetning til i DNA fra vev som normalt ikke uttrykker Vav1, vi har oppdaget ulike grader av metylering på nettsteder i
VAV
en promoter (tabell 5). For eksempel, metylering nivå i bukspyttkjertelen er 48-100%, i lungene nivået er mellom 22-50%, mens i colon prosentandelen av metylering er meget lav (mellom 4 og 15 prosent).
