Abstract
Lungekreft er fortsatt den ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis, og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) representerer ca 80% av totalt antall lungekrefttilfeller. Bruken av ikke-toksiske diett fytokjemikalier kan betraktes som et kjemoterapeutisk strategi for styring av NSCLC. Her rapporterer vi at druekjerne proantocyanidiner (annonser i Gmail) indusere apoptose av NSCLC celler, A549 og H1299,
in vitro
som er formidlet gjennom økt uttrykk av pro-apoptotiske proteiner Bax, redusert uttrykk for anti-apoptotiske proteiner BCL2 og BCL-XL, forstyrrelse av mitokondriemembranen potensial, og aktivering av caspases 9, 3 og poly (ADP-ribose) polymerase (PARP). Forbehandling av A549 og H1299 celler med caspase-3-inhibitor (z-DEVD-FMK) vesentlig blokkert annonser i Gmail-indusert apoptose i disse celler bekreftet at annonser i Gmail-indusert apoptose er mediert gjennom aktivering av kaspaser-3. Behandlinger av A549 og H1299 celler med annonser i Gmail resulterte i en økning i G1 arrest. G0 /G1-fasen av cellesyklusen er kjent for å bli styrt av cyklinavhengige kinaser (Cdk), cyklin-avhengige kinase-inhibitorer (Cdki) og sykliner. Vår western blot-analyser viste at annonser i Gmail-indusert G1 cellesyklus-stans ble formidlet gjennom den økte ekspresjon av Cdki proteiner (Cip1 /p21 og Kip1 /P27), og en samtidig reduksjon i nivåene av Cdk2, Cdk4, CDK6 og sykliner. Videre kan administrering av 50, 100 eller 200 mg annonser i Gmail /kg kroppsvekt av mus ved oral føring (5 d /uke) markert hemmet veksten av
sc
A549 og H1299 lunge tumorxenografter i atymiske nakne mus, noe var assosiert med induksjonen av apoptotisk celledød, økt ekspresjon av Bax, redusert ekspresjon av anti-apoptotiske proteiner og aktiveringen av caspase-3 i tumor xenograft-celler. Basert på data oppnådd i dyrestudie, ble human tilsvarende dose av annonser i Gmail beregnet, noe som synes rimelig og oppnåelige. Sammen disse resultatene tyder på at annonser i Gmail kan representere en potensiell terapeutisk middel for ikke-småcellet lungekreft
Citation. Singh T, Sharma SD, katiyar SK (2011) Drue Proanthocyanidins indusere apoptose ved tap av mitokondriemembranen Potential of human ikke-småcellet lungekreft celler
In vitro Hotell og
In Vivo
. PLoS ONE 6 (11): e27444. doi: 10,1371 /journal.pone.0027444
Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 6 august 2011; Godkjent: 17 oktober 2011; Publisert: 08.11.2011
Copyright: © 2011 Singh et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av midler fra Veterans Administration Merit omtale Award (SKK). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er fortsatt den ledende årsak til kreft dødsfall i USA og på verdensbasis [1]. Ett av tre kreftrelaterte dødsfall skyldes lungekreft, og den dystre 5-års overlevelse på ca 14% har vist ingen forbedring i løpet av de siste tre tiårene [2], [3]. Små-celle lungekreft og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for 90% av alle lungekrefttilfellene. NSCLC utgjør ca 80% av alle typer lungekreft og inkluderer plateepitelkarsinom, adenokarsinomer og store cellekreft [4], [5]. Selv om en kombinasjon av kjemoterapi og strålebehandling kan forbedre overlevelse av pasienter, de fleste pasienter dør av sykdomsutvikling, ofte som følge av ervervet eller iboende motstand mot cellegifter [6]. Derfor vil leting og utvikling av mer effektive terapeutiske midler og terapier som kan målrette molekylene forbundet med tumorvekst og apoptoseresistens føre til bedre resultater hos pasienter med lungekreft.
Naturlig planteprodukter tilby lovende nye muligheter for utvikling av mer effektive kjemoterapeutiske strategier for kreft i ulike organer. Grape seed proantocyanidiner (GSPS) er lovende fytokjemikalier som har anti-inflammatorisk [7] og antioksidant egenskaper [8] – [10], og ser ut til å stille ut minimal toksisitet hos forsøksdyr [9], [10]. Annonser i Gmail kan lett ekstraheres fra drue-frø, et biprodukt av druesaft og vin industrien, og er en blanding av flere polyfenoliske komponenter, som utgjør dimerer, trimerer, tetramerer og oligomerer /polymerer av monomere katekiner og /eller (-) -epicatechins, som tidligere beskrevet [9], [10]. Vi tror at i det minste noen av bestanddelene som er tilstede i annonser i Gmail virker synergistisk og kan gi bedre kjemoterapeutiske effekt enn en enkelt bestanddel.
Vi har tidligere vist at kosttilskudd av annonser i Gmail med AIN76A kontroll diett resulterte i en dose avhengig hemming av veksten av A549 og H1299 NSCLC tumor xenograft i atymiske nakne mus, og den veksthemmende virkning av annonser i Gmail på NSCLC xenografttumorer var forbundet med forbedring av nivåene av insulin-lignende vekstfaktorbindende protein-3 og anti- angiogene virkninger i tumor microenvironments (11). I en annen studie, vi har også rapportert at annonser i Gmail hemme spredning og indusere apoptose av NSCLC celler
in vitro Hotell og
in vivo
tumorxenotransplantater, som ble knyttet til deres hemmende effekt på cyclooxygenase- 2 ekspresjon og produksjon av dets prostaglandin metabolitt, PGE
2 (12). I motsetning til dette ble en signifikant inhibering av celleproliferasjon og induksjon av apoptose i normale humane bronkiale epitel-celler etter behandling annonser i Gmail under identiske betingelser ikke observert [11], [12]. På tross av anti-kreftfremkallende virkninger av annonser i Gmail for NSCLC-celler, er en nøyaktig mekanisme av den hemmende virkning på cellevekst og NSCLC apoptose av annonser i Gmail ikke godt forstått. I denne henvendelsen, gjennomførte vi en omfattende undersøkelse på mekanismen ansvarlig for hemming av lungekreft celleproliferasjon og apoptose bruker A549 og H1299 cellelinjer som
in vitro
cellekultur modell og
in vivo
svulst xenograft modell. Å studere
in vivo
effekten av annonser i Gmail på tumor xenograft vekst, ble annonser i Gmail gitt til mus ved oral gavage 5 dager /uke. Vi rapporterer at annonser i Gmail-indusert celledød ved apoptose av NSCLC celler er mediert gjennom modulasjoner i uttrykket nivåer av pro- og anti-apoptotiske proteiner, tap av mitokondriemembranen potensial og caspase-3 aktiveringsveier. Annonser i Gmail også sjekket deregulert cellecyklusprogresjonen og tilhørende regulatoriske proteiner i NSCLC celler. Således våre studier gi innsikt i mekanismen som annonser i Gmail indusere apoptose i disse celler. I tillegg våre resultater gir en overbevisende begrunnelse for den farmakologiske aktiviteten av annonser i Gmail mot menneske ikke-småcellet lungekreft celler.
Materialer og metoder
reagenser, kjemikalier og antistoffer
de Annonser i Gmail brukt i denne studien ble innhentet fra Kikkoman Corporation (Noda, Japan). JC-1 mitokondriemembranen potensial Detection Kit, og Anti-OxPhos Complex IV subenheten IV (Cox IV) ble kjøpt fra Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). Celledød Detection ELISA kits ble hentet fra Roche Diagnostic Corporation (Indianapolis, IN). De primære antistoffer ble innkjøpt som følger: antistoffer for Bcl-2, Bcl-xl, Bax, ble caspase-9, spaltet caspase-9 og -3, anti-poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) og β-aktin kjøpt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA); antistoffer for cytokrom c, Smac /Diablo, Cyclin D1, Cyclin D2, Cyclin E, Cdk2, Cdk4, CDK6, Cip1 /p21, Kip1 /P27 og sekundære antistoffer, pepperrot peroksidase-lenkede-anti-immunoglobulin G og anti-kanin immunglobulin G var oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Caspase-3-spesifikk inhibitor (z-DEVD-FMK) ble anskaffet fra Calbiochem (San Diego, CA). ApoTarget sett er spesifikke for caspase-3-aktivitetsanalyse ble erholdt fra Biosource International, Inc. (San Diego, CA). Hams F-12, RPMI 1640, penicillin, streptomycin og trypsin /EDTA ble oppnådd fra Cellgro (Herndon, Virginia). De forbedrede Chemiluminescence vestlige blotting gjenkjenning reagenser ble kjøpt fra Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ).
cellekultur og cellelinjer
Menneske ikke-småcellet lungekreft cellelinjer, A549 og H1299, og normale humane bronkiale epitel-celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). De A549 og H1299 cellelinjer ble dyrket som monolag i Hams F-12 og RPMI 1640 kulturmedium, henholdsvis, supplert med 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, UT), 100 mikrogram /ml penicillin og 100 ug /mL streptomycin og holdt i en inkubator med en fuktig atmosfære med 95% luft og 5% CO
2 ved 37 ° C. De annonser i Gmail ble oppløst i en liten mengde dimetylsulfoksyd [DMSO, maksimumskonsentrasjon, 0,1% (v /v)], ble det deretter tilsatt for å fullcellekulturmediet før tilsetning til Subkonfluente celler (60-70% sammenflytende). Celler behandlet med bilen bare (DMSO, 0,1% i media) fungerte som kontroll.
Analyse av apoptotisk celledød ved ELISA
Celler ble behandlet med annonser i Gmail i 48 timer og deretter høstet. Annonser i Gmail-indusert apoptose ble bestemt ved bruk av celledød Detection ELISA Kit (Roche Diagnostics, Palo Alto, CA), som kvantifiserer cytoplasmatiske histon-assosierte DNA-fragmenter i form av mononucleosomes eller oligonucleosomes, etter produsentens anvisninger.
caspase-3 aktivitetsanalyse
aktiviteten av caspase-3 i cellelysatene ble målt ved hjelp av kolo protease analysen ApoTarget Kit (Biosource International, Inc., CA) etter produsentens protokoll. I korthet, A549 eller H1299-celler ble behandlet med annonser i Gmail (20, 40, 60 og 80 ug /ml) i 48 timer. Deretter ble cellene høstet ved hjelp av kort trypsinering og cellelysater fremstilt etter produsentens protokoll. Prøver av cellelysatene (100 ug protein per prøve) ble blandet med reaksjonsbuffer og 200 pmol /L substrat (DEVD-pNA for caspase-3) og inkubert i 3 timer ved 37 ° C i mørket. Absorbansen ble deretter målt ved 405 nm og prøveavlesninger beregnes ved å subtrahere absorbansen av blanke prøver.
DNA cellesyklusanalyse
av undersammenflytende celler (50-60%) ble behandlet med varierende konsentrasjoner av annonser i Gmail i komplett medium i 48 timer. Cellene ble deretter høstet, vasket med kald PBS, og behandlet for cellesyklusanalyse, som beskrevet tidligere [13], [14]. I korthet ble cellene (1 x 10
5) ble re-suspendert i 50 mL kald PBS hvortil 450 pl kald metanol ble tilsatt, og cellene ble deretter inkubert i 1 time ved 4 ° C. Cellene ble sentrifugert ved 1100 rpm i 5 minutter; pelleten ble vasket med kald PBS, resuspendert i 500 ul PBS, og inkubert med 5 ul RNase (20 pg /ml sluttkonsentrasjon) i 30 minutter. Cellene ble inkubert med propidiumjodid (50 ug /ml) på is i 1 time i mørke. Cellesyklus distribusjon av cellene ble deretter bestemt ved FACSCalibur instrument (BD Biosciences, San Jose, CA) utstyrt med Cellquest 3.3 programvare i fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) maskin på Core Facility av UAB Comprehensive Cancer Center.
Immunutfelling og western blot-analyse
Etter behandling av A549 og H1299 celler med annonser i Gmail, ble cellene høstet, vasket med kald PBS og lysert med iskald lyseringsbuffer supplert med protease-inhibitorer, som detaljert tidligere [12], [13]. For immunoblotting av cytokrom
c
, Smac /DIABLO og Cox IV, mitokondrielle og cytosoliske fraksjoner ble fremstilt fra cellene og proteinene ble løst i 10% Tris-glysingeler og overført på en nitrocellulosemembran. Etter blokkering av ikke-spesifikke bindingsseter, ble membranen inkubert med det ønskede primære antistoff ved 4 ° C over natten. Membranen ble deretter inkubert med passende peroksidase-konjugert sekundært antistoff og de immunoreaktive bånd ble visualisert ved hjelp av den forbedrede Chemiluminescence reagenser. Hver membran ble inndampet og re-probet med anti-β-actin-antistoff for å sikre lik protein lasting.
For Cdk inhibitor (Cdki) -Cdk bindingsanalyse, ble A549-cellene behandlet med bærer eller 60 pg /mL annonser i Gmail i 48 timer, vasket med iskald PBS, og hele cellelysater fremstilt som tidligere beskrevet [13]. Porsjoner inneholder 200 mikrogram av protein ble klarert med protein A /G-pluss agaroseperler (Santa Cruz, California). Cip1 /p21 og Kip1 /P27 proteiner ble immunopresipitert fra helcellelysater ved hjelp av spesifikke antistoffer etter inkubasjon i 8 timer fulgt av tilsetning av protein A /G-pluss agarose-perler (50 ul, Santa Cruz, CA), og videre inkubasjon over natten ved 4 ° C. Immunopresipitater ble vasket, og deretter underkastet Western blot-analyse ved bruk av Tris-glysingeler fulgt av immunoblotting ved å bruke Cdk2, Cdk4 og CDK6 antistoffer.
Analyse for mitokondriemembranpotensialet
Endringen i mitokondriemembranen potensial i lungekreftceller etter behandling med annonser i Gmail ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri ved bruk av det fluorescerende lipofile kationiske sonde JC-1 (5,5 «, 6,6′-tetraklor-1,1′, 3,3»-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine jodid) Deteksjon Kit følge instruksjonene fra produsenten, og som beskrevet av oss tidligere [13], [14]. JC-1 selektivt innen intakte mitokondriene å danne multimerprober J-aggregater emitting fluorescens lys ved 590 nm. Den monomere formen emitterer lys ved 527 nm etter eksitasjon ved 490 nm. Dermed kan fargen på fargestoff endres fra oransje til grønt, avhengig av mitokondriemembranen potensial, og analyseres ved FACS med grønn fluorescens i kanal 1 (FL1) og oransje utslipp i kanal 2 (FL2).
Dyr og tumor xenograft studie
Kvinne atymiske nakne mus (4-5 uker gamle) ble kjøpt fra National Cancer Institute (Frederick, MD), plassert i samsvar med Institutional Animal Care og bruk komité retningslinjer, og utstyrt med sterilisert AIN76A kosthold og vann
ad libitum
. Alle mus ble holdt under standardbetingelser i en 12-timers mørke /12-timers lys syklus, en temperatur på 24 ± 2 ° C og relativ fuktighet på 50 ± 10%. Dyret protokoll som brukes i denne studien ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Alabama i Birmingham, og godkjent Animal Protocol nummer er: 101109267.
For å bestemme
in vivo
effekt av annonser i Gmail mot krefttumorvekst xenograft human lunge, eksponentielt voksende A549 og H1299-celler (2 x 10
6) ble blandet ved en 1:01 forhold med Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA), og en 100 ul suspensjon som inneholder 2 × 10
6 celler ble injisert sc i den høyre flanken til hver mus. Etter 24 timer ble musene tilfeldig delt i fire grupper (n = 10). Forsøksdyr ble behandlet av oralt inntak med 50, 100 eller 200 mg annonser i Gmail /kg kroppsvekt /dag i 100 mL PBS fem dager i uken (mandag til fredag) begynner en dag etter tumorcelle implantasjon. Kontrollmus mottok et likt volum PBS. Forsøket ble avsluttet 58 dager etter tumorcelle-inokulering. Tumorvekst ble målt 2 ganger i uken. Kroppsvekt /mus og kosthold forbruk /mus ble registrert regelmessig gjennom hele forsøket. Dyrene ble også overvåket dersom de blir syke eller lidende (mangel normal grooming og unngåelsesatferd) under hele forsøket perioden. Ved avslutning av forsøket ble det hele tumormassen høstes, veiet, og en del av tumoren ble anvendt for fremstillingen av tumorlysatene for å analysere uttrykket nivåer av ulike proteiner av interesse, og resten ble brukt for immunhistokjemisk analyse.
Immunhistokjemisk påvisning av PCNA-positive og TUNEL-positive celler
Fem-mikrometer tykke tumorsnitt ble deparaffinized og rehydrert i graderte serier av alkoholer. Etter rehydrering, ble en antigen gjenfinningsprosess utføres ved å plassere objektglassene i 10 mM natriumcitratbuffer, pH 6,0 ved 95 ° C i 20 minutter etterfulgt av 20 minutter avkjøling. Seksjonene ble vasket i PBS og ikke-spesifikke bindingsseter ble blokkert med 1% BSA med 2% geiteserum i PBS før inkubasjon med anti-PCNA-antistoffer i 2 timer ved romtemperatur. Etter vasking, ble seksjonene inkubert med biotinylert sekundært antistoff i 45 minutter, etterfulgt av HRP-konjugert streptavidin, vasking i PBS, inkubering med diaminobenzidin substrat, og kontra med hematoksylin. Apoptotisk celledød i tumorvev ble oppdaget ved hjelp av terminal deoksynukleotidyltransferase-mediert dUTP nick-end merking (tunel) analyser. Tallene for PCNA-positive og TUNEL-positive celler ble detektert og tellet ved hjelp av et lysmikroskop. Resultatene er presentert som antall positive celler x 100 /totalt antall celler.
Statistisk analyse
Resultatene fra
in vivo
studiene er representative for minst 2-3 uavhengige forsøk. Den statistiske signifikans av forskjell mellom kontroll og annonser i Gmail-behandlede grupper ble beregnet ved Students t-test (Sigma Stat 2,03, Jandel Scientific, San Rafael, CA). Alle kvantitative data er vist som gjennomsnitt ± SD. I svulst xenograft studien, ble statistisk signifikans av forskjell mellom kontroll og annonser i Gmail-behandlede grupper bestemt av ANOVA etterfulgt av Bonferroni t-test, og i hvert fall P 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
NSCLC-celler som er følsomme for annonser i Gmail-indusert apoptose
Vi har vist at behandling av A549 og H1299 NSCLC-celler med forskjellige konsentrasjoner av annonser i Gmail hemmer veksten eller proliferasjonen potensialet av disse cellene i en dose- og tidsavhengig måte. Annonser i Gmail også indusert apoptotisk celledød av disse cellene på en konsentrasjonsavhengig måte, [11], [12]. Den annonser i Gmail-indusert apoptose av A549 og H1299-celler etter behandling i 48 timer ved bruk av FACS-analysen er oppsummert i figur 1A. Det er imidlertid en nøyaktig mekanisme av anti-apoptotiske virkninger av annonser i Gmail mot NSCLC-celler ikke klart forstått. Derfor ble studiene gjennomført for å fastslå den nøyaktige mekanismen involvert i apoptotisk celledød av NSCLC celler ved behandling med annonser i Gmail.
(A)
In vitro
behandling av A549 og H1299 celler med annonser i Gmail induserer apoptose i en doseavhengig måte. Apoptotisk celledød ble analysert ved hjelp av FACS analyse, og totale andelen av apoptotiske celler i A549 og H1299 celler er oppsummert som gjennomsnitt ± SD, n = 3. Betydelig forskjell versus ikke-annonser i Gmail-behandlede kontroller:
*
P
0,05;
¶
P
0,01;
†
P
0,001. (B) Behandling av A549 og H1299 celler med GSPS resulterer i en doseavhengig reduksjon i ekspresjon av anti-apoptotiske proteiner, Bcl-2 og Bcl-xl og samtidig øke ekspresjonen av de pro-apoptotiske protein, Bax, som bestemmes av western blot-analyse. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter med lignende resultater.
Annonser i Gmail redusere uttrykket av de anti-apoptotiske proteiner BCL-xl og BCL-2 samtidig øke uttrykket av pro-apoptotiske proteiner Bax i A549 og H1299 celler
proteiner av Bcl-2 familien spiller en viktig rolle i reguleringen av apoptose ved å fungere som arrangører (
f.eks
., Bax) eller hemmere (BCL-2 eller BCL-XL ) av celledød [15] – [17]. Ved hjelp av western blot-analyse, har vi funnet at behandling av A549 og H1299 celler med annonser i Gmail i 48 timer resulterte i en doseavhengig reduksjon i nivåer av anti-apoptotiske proteiner Bcl-xl og Bcl-2, og en økning i nivåene av den pro-apoptotiske protein, Bax, sammenlignet med vehikkelbehandlede kontrollceller (figur 1 B). Således kan behandling av disse lungekreftceller med annonser i Gmail forandre protein nivåene av visse medlemmer av Bcl-2-familien på en måte som begunstiger en økning i forholdet mellom Bax: Bcl-2, noe som kan bidra til mottakelighet av kreftceller til GSP-indusert apoptose [15].
Annonser i Gmail indusere tap av mitokondriemembranen potensial og en påfølgende økning av utslipp av cytokrom c og Smac /DIABLO hos NSCLC celler
tap av mitokondriemembranen potensial har vært knyttet til initiering og aktivering av apoptotiske prosess i celler [15], [16]. Frigjøringen av cytokrom c og Smac /DIABLO fra mitokondrier i cytosol bidrar til aktivering av kaspaser og senere fører til apoptotisk celledød. For å utforske effekten av annonser i Gmail på denne prosessen i A549 og H1299 celler, cytosoliske og mitokondrielle fraksjoner ble fremstilt fra celler som var blitt behandlet med annonser i Gmail i 48 timer. Resultatene av Western blot-analyse viste at behandling av annonser i Gmail resulterte i en doseavhengig økning i cytokrom c og Smac /DIABLO slipper inn i cytosol og en tilsvarende reduksjon i nivåene av cytokrom c og Smac /DIABLO i de mitokondrielle fraksjoner i begge A549 og H1299-celler (fig. 2A og 2B), for således å foreslå tapet av mitokondriemembranpotensialet på annonser i Gmail behandling i disse cellene. Blottene ble strippet og re-undersøkt med anti-COX IV antistoff for å utelukke muligheten for krysskontaminering av mitokondrielle og cytosoliske fraksjoner. Tilstedeværelsen av COX IV ble ikke oppdaget i cytosoliske fraksjoner
(A B). Immunoblotting for cytokrom
c Hotell og Smac /DIABLO hjelp cytosoliske og mitokondrielle fraksjoner fremstilt av A549 og H1299 celler etter behandling med indikerte konsentrasjoner av annonser i Gmail i 48 timer. Blottene ble strippet og re-probet med anti-COX IV-antistoff for å sikre lik mitokondrie protein laster, så vel som for å utelukke krysskontaminering av mitokondrielle og cytosoliske fraksjoner. (C) Behandling av A549 og H1299 celler med annonser i Gmail induserer tap av mitokondriemembranen potensial. Celler ble behandlet med angitte doser av annonser i Gmail i 48 timer. JC-1 fargestoff Farget cellen ble analysert ved strømningscytometri, som beskrevet i Materialer og Metoder. Dataene er representative for to separate eksperimenter med identiske observasjoner.
For å ytterligere bekrefte at GSPS indusere et tap av mitokondriell membranpotensiale, brukte vi det kationiske lipofile fargestoff, JC-1, som akkumuleres i mitokondriene i en potensiell-avhengig måte. På forstyrrelse av mitokondriemembranen potensial, fluorescensemisjonen fra JC-1 fargestoff endres fra rødt til grønt. Førtiåtte timer etter at tilsetningen av annonser i Gmail, det A549 og H1299 cellene ble høstet, inkubert med JC-1 fargestoff og fluorescensemisjonen analysert ved hjelp av strømningscytometri. Som vist i figur 2C, GSP behandling av A549 og H1299-celler resulterte i en doseavhengig økning i antallet grønn-fluorescens-positive celler, som vist i den nedre høyre (LR) kvadranten av FACS histogrammet. Sammen er disse studiene tyder på at annonser i Gmail behandling indusere apoptose av både A549 og H1299 lungekarsinom celler gjennom forstyrrelse av mitokondriemembranen potensial.
Annonser i Gmail indusere aktivering av caspases og PARP både A549 og H1299 celler
utgivelsen av cytokrom
c Hotell og Smac /DIABLO i cytosol aktiverer procaspase 9 i apoptosome og fører til aktiv caspase-9 spalting og kløyving av caspase-3 [18] – [20]. Aktivering av kaspase-3 fører deretter til apoptotisk celledød gjennom spaltning av et bredt spekter av target-proteiner, inkludert PARP. Derfor har vi fastslått hvorvidt induksjon av apoptose av A549 og H1299-celler ved annonser i Gmail er mediert gjennom aktivering av procaspase-9, caspase-3 og PARP-proteiner. Behandling av A549 og H1299 celler med annonser i Gmail i 48 timer resulterte i en doseavhengig reduksjon i nivåene av kaspase-9 samtidig øke spaltningen av caspaser-9, kaspase-3 og PARP-proteiner sammenlignet med den bærer-behandlede celler (figur 3A ). De annonser i Gmail-indusert aktivering av kaspase-3 i A549 og H1299-celler ble også bestemt ved anvendelse av en kolorimetrisk caspase-3 aktivitetsanalyse. Behandling av både A549 og H1299 lungekreftceller med annonser i Gmail i 48 timer førte til en signifikant høyere (p 0,05; p 0,001) caspase-3 aktivitet på en doseavhengig måte enn det som ble observert i de vehikkelbehandlede kontrollceller (figur 3B).
(A) Behandling av A549 og H1299 celler med annonser i Gmail reduserer nivået av caspase-9 mens øker aktivering /spalting av caspase-9, caspase-3 og PARP i en doseavhengig måte. Celler ble behandlet med varierende konsentrasjoner av annonser i Gmail (0, 20, 40, 60 og 80 ug /ml) i 48 timer, deretter ble cellene høstet, cellelysater fremstilt og utsatt for Western blot-analyse for å påvise nivåene av kaspase-9, spaltet caspase-9, caspase-3 og PARP. En representant blot er vist fra tre uavhengige eksperimenter med lignende resultater. (B) Den caspase-3 aktivitet i cellelysater fra prøver av panel A ble målt ved anvendelse av en kolorimetrisk assay protease (ApoTarget Kit). Annonser i Gmail behandling til A549 og H1299 celler øker aktiviteten av caspase-3 på doseavhengig måte. Signifikant forskjell versus ikke-annonser i Gmail behandlingsgruppen,
¶
P
0,01 og
*
P
0,001. (C) Effekten av annonser i Gmail (60 og 80 ug /ml) på apoptose av A549 og H1299-celler ble bestemt etter 48 timer i fravær eller nærvær av 60 umol /L av caspase-3-inhibitor (z-DEVD-FMK) . Innholdet av apoptotiske celler ble bestemt ved anvendelse av celledød deteksjon ELISA kit, som beskrevet i Materialer og Metoder. Cellene behandlet med z-DEVD-FMK blokkerte annonser i Gmail-indusert apoptose i A549 og H1299 celler. Prosentandelen av apoptotiske celler i forskjellige behandlingsgrupper ble sammenfattet og data er presentert som gjennomsnitt ± SD fra to gjentatte eksperimenter. Betydelig hemming av caspase-3 hemmer versus annonser i Gmail alene behandlede celler,
*
P
0,001. CI = caspase-3-hemmer, C = kontroll, uten noen behandling.
Behandling med caspase-3-inhibitor (z-DEVD-FMK) blokkerer annonser i Gmail-indusert apoptose av både A549 og H1299 celler
for ytterligere å bekrefte at GSPS-indusert aktivering av caspase-3 er involvert i induksjon av apoptotisk celledød av A549 og H1299 menneskelige lungekreft celler, bestemt vi om annonser i Gmail-indusert apoptose av A549 og H1299 celler ble påvirket ved tilsetning av caspase-3-spesifikk inhibitor (z-DEVD-FMK). A549 og H1299 celler som var blitt behandlet med annonser i Gmail med eller uten z-DEVD-FMK (60 umol /L) i 48 timer. Cellene ble høstet og celledød ble analysert ved hjelp av celledød Detection ELISA kit følge instruksjonene fra produsenten. Som vist i figur 3C (venstre panel), behandling av A549-celler med annonser i Gmail ved konsentrasjoner på 60 og 80 mikrogram /ml resulterte i 31% og 49% apoptose eller celledød henholdsvis sammenlignet med 6,5% i ikke-annonser i Gmail-behandlede kontrollceller . Behandlingen av A549-celler med annonser i Gmail (60 eller 80 ug /ml) i nærvær av z-DEVD-FMK resulterte i bare 14% og 17% apoptose, henholdsvis, som klart indikerte at tilstedeværelsen av caspase-3-spesifikk hemmer signifikant blokkert annonser i Gmail-indusert apoptotisk celler død (
P
0,001) i A549 celler. Lignende resultater ble funnet ved H1299-celler ble behandlet med annonser i Gmail i nærvær eller fravær av z-DEVD-FMK, som vist i figur 3C (høyre panel). Disse resultatene indikerer at annonser i Gmail-indusert apoptose av både A549 og H1299 humane lungekreftceller er assosiert med aktiveringen av caspase-3.
annonser i Gmail indusere G1 fasecellesyklusarrest i NSCLC-celler
Basert på den foreløpige undersøkelser hvor vi observerte en sterk veksthemmende virkning av annonser i Gmail på NSCLC-celler, deretter bestemt vi det mulig mekanisme av anti-proliferativ aktivitet av annonser i Gmail som kan føre til apoptotisk celledød. For dette formål effekten av annonser i Gmail på cellesyklusprogresjon i A549 og H1299-celler ble bestemt etter behandling med annonser i Gmail i 48 timer. Som oppsummert i figur 4, (paneler A-D), behandling av A549-celler med annonser i Gmail resulterte i en betydelig høyere antall celler i G1 fasen ved alle konsentrasjoner anvendes: 20 pg /ml (58,3%,
P
0,05), 40 pg /ml (67,9%,
P
0,001) og 60 mikrogram /ml (75,5%,
P
0,001) sammenlignet med den ikke- -GSPs behandlet kontroll (52,7%). Som angitt i figur 4 (venstre panel A-D), den doseavhengige effekt av annonser i Gmail på G1 arrest i A549-celler var i stor grad på bekostning av celler i S-fasen med en minimal endring i G2-M cellepopulasjon sammenlignet med ikke- -GSPs-behandlede kontroll-celler (panel A). Tilsvarende effekt av annonser i Gmail på G1 faserest ble også funnet i H1299-celler (figur 4, høyre panel A-D). Resultatene av cellesyklus distribusjon ved hver dose av annonser i Gmail er også oppsummert i Panel E, som indikerte betydelig arrestasjonen av A549 og H1299 celler i G0-G1 fasen etter annonser i Gmail behandling.
Celler ble behandlet enten med bil ( 0,1% DMSO i medium) eller 20, 40 og 60 ug /ml doser av annonser i Gmail i komplett medium. Etter 48 timers behandling, ble cellene høstet og spaltet med RNase. Cellulær DNA ble farget med propidiumjodid og strømningscytometrisk analyse ble utført for å analysere cellesyklusfordeling, som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. (A-D) cellesyklusfordelingen i A549 (venstre panel) og H1299 (høyre panel) celler med behandling av forskjellige konsentrasjoner av annonser i Gmail. (E) av data fra cellesyklusfordelingen ble oppsummert og presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. Statistisk signifikant versus ikke-annonser i Gmail behandlet kontrollgruppe,
¶
P
0,05 og
*
P
. 0,01
Annonser i Gmail redusere uttrykk for G1 regulatoriske proteiner av CDK og cykliner i NSCLC-celler
studier har vist at CDK og cykliner spiller avgjørende roller i regulering av cellesyklusutvikling [21], bestemmes derfor vi effekten av annonser i Gmail på protein nivåer av CDK og cykliner som er negativt regulert av Cdki (Cip1 /p21 og Kip1 /p27) under G1 fase cellesyklusprogresjon. Som vist i figur 5 (panel A), behandling av A549-celler med annonser i Gmail resulterte i en markert nedgang i ekspresjon av Cdk2, Cdk4 og CDK6 på en doseavhengig måte ved 48 timer etter annonser i Gmail behandling. En sterk reduksjon av CDK ble observert ved doser på 40-80 pg /ml konsentrasjoner av annonser i Gmail. Tilsvarende ble en markert reduksjon i ekspresjonen av cykliner D1, D2 og E observert i en doseavhengig måte. Identisk virkning av annonser i Gmail ble også funnet når H1299-celler ble behandlet med annonser i Gmail og under identiske betingelser (figur 5A, høyre panel).
Cellene ble behandlet enten med bærer (0,1% DMSO i medium) eller annonser i Gmail (20 , 40, 60 og 80 ug /ml) i 48 timer og deretter høstet, cellelysater fremstilt og deretter utsatt for SDS-PAGE, fulgt av Western blot-analyse, som beskrevet i Materialer og metoder.
