Abstract
Sonic pinnsvin (SHH) medulloblastoma (MB) subtype er drevet av en proliferativ CD15 + tumor spre celle (TPC), også vurdert i litteraturen som en antatt kreftstamcelle (CSC). Til tross for betydelig forskning, mye av biologien til denne TPC er fortsatt ukjent. Vi rapporterer bevis for at fosfatase og tensin homolog (PTEN) og phosphoinositide 3-kinase (PI-3K) spiller en avgjørende rolle i utbredelsen, overlevelse og potensiell respons på behandlingen i denne CD15 + CSC /TPC-drevet ondartet sykdom. Bruke ND2-
SmoA1
transgen musemodell for MB, mus genetikk og pasient avledet xenografter (PDXs), viser vi at CD15 + TPCs er 1) obligately kreves for SmoA1Tg drevet tumorigenicity 2) reguleres av PTEN og PI-3K signale 3) selektivt følsomme for den cytotoksiske effekten av pan PI-3K-hemmere
in vitro Hotell og
in vivo
men motstandsdyktig mot kjemoterapi 4) i SmoA1Tg musemodellen er genomisk lignende til SHH menneskelige MB undergruppe. Resultatene gir det første bevis på at PTEN spiller en rolle i signalisering MB TPC og biologi og at PI-3K-inhibitorer målet og undertrykke overlevelse og proliferasjon av celler i mus og humane CD15 + kreft stamcellelinjen. I motsetning til dette, CD15 + TPCs er resistente overfor cisplatina, temozolomid og SHH-inhibitor, NVP-LDE-225, Midlene som for tiden anvendes i behandling av medulloblastom. Disse studiene validere den terapeutiske effekt av panne PI-3K-inhibitorer ved behandling av CD15 + TPC avhengig medulloblastom og foreslå en sekvensiell kombinasjon av PI-3K-inhibitorer og kjemoterapi vil ha øket effektivitet ved behandling av denne sykdommen.
Citation : Singh AR, Joshi S, Zulcic M, Alcaraz M, garlich JR, Morales GA, et al. (2016) PI-3K hemmere Fortrinnsvis Target CD15 + Cancer Stem Cell Befolkning i SHH Driven medulloblastoma. PLoS ONE 11 (3): e0150836. doi: 10,1371 /journal.pone.0150836
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, SPANIA
mottatt: 13 oktober 2015; Godkjent: 19 februar 2016; Publisert: 03.03.2016
Copyright: © 2016 Singh et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Mikromatrise data har blitt deponert i GEO offentlig database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), med GEO tiltredelse antall GSE41717
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NIH stipend RO1 CA94233 -09 og FDA RO1 FD- 04385 til DLD og tilskudd fra Alex Lemonade Stand Foundation for Childhood Cancer (ALSF), (Springboard Grant) og Hyundai håp on Wheels Foundation, Hope Grant, Cricket Corporation og Olivia Hudson Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Joseph R. garlich og Guillermo A. Morales er ansatt SignalRx Pharmaceuticals. SignalRx Pharmaceuticals gitt støtte i form av lønn for forfattere JRG og GAM, men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. De spesifikke roller disse forfatterne er formulert i § «forfatter bidrag «
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser: Forfattere Joseph R. garlich og Guillermo A. Morales er ansatt SignalRx Pharmaceuticals. Dr. Durden avslører økonomisk interessekonflikt i SignalRx Pharmaceuticals og i SF1126 stoffet. Det er de følgende patentpublikasjoner som vedrører materiale relevant for denne artikkelen (PI-3-kinase inhibitor promedikamenter patent nr: 6949537). Forholdet mellom Dr. Durden og SignalRx har blitt internt gjennomgått og godkjent av University of California, San Diego i samsvar med sin konflikt av interesse politikk. Denne studien ble finansiert delvis av Cricket Corporation. Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer
Forkortelser. CSC, kreft stamcelle; TPC, tumor spre cellen; PI-3K, phosphoinositide 3-kinase; PTEN, fosfatase og tensin homolog; PDX, pasient-avledet xenograft
Innledning
medulloblastoma (MB) er en aggressiv lillehjernen svulst og den vanligste pediatric hjerne malignitet [1, 2]. Den nåværende behandlingen for medulloblastom omfatter reseksjon av tumoren, etterfulgt av stråling og kjemoterapi som omfatter cisplatina regimer. Selv om vaksinen er 50-80%, overlevende lider av alvorlige bivirkninger, inkludert veksthemming, endokrine lidelser, og merket nevrokognitive underskudd [3]. Dermed blir mer effektive og mindre giftige terapi for medulloblastoma presserende behov. Nylig har flere grupper [4-8] utført genuttrykk profilering og DNA-kopi-antall analyse av MB, og har identifisert minst fire store undergrupper av sykdommen: Wnt, Sonic pinnsvin (SHH), gruppe C, og gruppe D . Disse molekylære undergrupper har forskjellige egenskaper i form av genekspresjon, mutasjons profiler, epidemiologi og prognose. Blant molekylære undergrupper, er svulster assosiert med ukontrollert aktivering av SHH veien vanligvis definert som SHH MB. Den SHH veien er en viktig embryonale signalkaskade som regulerer stamcelle og stamfar-celledifferensiering i flere utviklingsprosesser [9]. Mutasjoner i SHH pathway Lyddemper
Lappet
eller endringer av andre Shh sti komponenter resultere i sin permanente aktivering og MB tumordannelse [10, 11]. Omtrent 30% av MB oppviser ukontrollert aktivering av SHH signalveien [11]. Selv om flere glattes (SMO) antagonister, også NVP-LDE225 GDC0449 blir nå evaluert i kliniske studier hos pasienter med medulloblastoma, det er rask utvikling av tumorresistens [12, 13]. En studie av Buonamici et al viste at NVP-LDE225 motstand i MB blir mediert av aktivering av fosfoinositid 3-kinase (PI3K) signalveien. [14]. Eksisterende litteratur tyder på at tumor suppressor, PTEN og målet PI-3K er viktig i patogenesen av SHH-assosiert MB [15-20]. Nyere genomisk analyse av medulloblastoma svulster viste at PI-3K mutasjon (PIK3CA, PTEN, PIK3C2G) er hyppig i Shh undergruppe svulster [21, 22]. I en av studiene, ut av 13 Hedgehog undergruppe svulster profilerte, 2 hadde tap-av-funksjon mutasjoner i
PTEN
, og en annen pasient hadde en aktiverende mutasjon i PIK3CA [22]. I en annen studie av 133 SHH MB tumorer profilerte, er PI-3K vei mutert i 5% av Shh MBs [21, 22]
Flere rapporter tyder på at MB er drevet av behandlingsresistent stamcelle. -lignende celler, kalt kreftstamceller /tumor spre celler (CSC /TPCs). Landemerke studier viser at tumorprøver hentet fra murine genetiske MB modeller, Sonic pinnsvin (
SHH-Lappet
) og fra menneske MB, er spredd av celler som uttrykker stamfar markør CD15 /SSEA [23, 24]. CD15 er et karbohydrat antigen som er uttrykt på begge progenitorceller og stamceller i embryonale og voksne sentralnervesystemet [25, 26] og mest spesielt er ansett som en viktig markør for TPCs i SHH undergruppe av medulloblastom [23].
TPCs anses å være proliferativ og en viktig bidragsyter til tumorresistens og tilbakefall [27-30]. Flere studier har vist en rolle for PI-3K /AKT sti i spredning og utbredelse av TPCs [31-33]. Rapporter har vist at blokkering av PI-3K aktivitet undertrykker proliferasjonen av TPCs i bryst, eggstokk og forskjellige andre cancere [34]. Hambardzumyan
et al
. antydet at PI-3K pathway aktivitet regulerer overlevelse av kreft stamceller følgende stråling i medulloblastoma
in vivo
. [35]. Dermed hypotese vi at målretting PTEN-PI-3K signale aksen i MB TPC rommet kan gi langsiktig tumorkontroll og /eller utrydding av medulloblastoma. Tidligere har vår gruppe rapporterte at heterozygositet av PTEN fremmer tumordannelse i både menneskelig og i
SmoA1
musemodell for medulloblastoma [15]. Vi har rapportert at 61% av humane medulloblastom tumorer har mistet ekspresjon av PTEN-proteinet, og dette tapet i PTEN er av prognostisk betydning i denne sykdommen (15). Heri, ved hjelp av
SmoA1Tg
musemodell og primære humane MB pasient xenograft tumorprøver (PDXs), observerte vi at tumor-formeringsmateriale kapasitet på CD15 + TPCs i SHH-drevet MB er regulert i det minste delvis av den PTEN- PI-3K signalveier, og at målretting denne aksen ved hjelp av PI-3K-hemmere kan blokkere
in vivo
forplantning av TPCs og indusere apoptose.
Materialer og metoder
Animal studier
ND2:
SmoA1 product: (
SmoA1
) transgene mus var en gave fra James Olson (University of Washington, Seattle, Washington) [36]. Mus ble opprettholdt i Moores Cancer Center vivarium ved University of California, San Diego, og alle forsøk ble utført ved hjelp av prosedyrer godkjent av University of California, San Diego IACUC komiteen.
stereotaxic implantasjon av tumorceller
stereotaksisk implantasjon av tumorceller ble utført som beskrevet tidligere [23, 37]. Nude
nu-nu
mus ble bedøvd ved hjelp av 60 mg /kg ketamin (Fort Dodge Animal Health) pluss 20 mg /kg xylazin (Ben Venue Laboratories), og plassert i en stereotaktisk ramme med en mus adapter (Kopf Instruments ). Et snitt ble gjort i midtlinjen av hodebunnen over lillehjernen, og et lite hull ble laget i kraniet (3 mm til høyre og 1 mm anterior til bregma) ved hjelp av en avfaset (skarp spiss) 25 G nål. En 30-gauge Hamilton-sprøyte fylt med celler som var montert på en mikromanipulator og innført gjennom hullet til overflaten av høyre frontal lobe, i en dybde på 4,5 mm. Fersk sortert CD15 +/- tumor (ukultur) celler ble injisert i løpet av 2 minutter, og nålen ble igjen på plass i fem minutter å unngå refluks. Til slutt, huden ble avsluttet med 6-0 rask absorberende vanlig gut sutur ved hjelp av en 3/8 PC-en cutting nål (Ethicon). Dyrene ble overvåket kontinuerlig under og etter operasjonen for å sikre at mus har gjenopprettet fra kirurgi og er ambulerende uten tegn på ubehag. Potensielle smertefulle og stressende virkningene av denne overlevelse kirurgi inkluderer: 1) dårlig foring, 2) vekttap, 3) rusket gran, 4) tap av mobilitet i bur, 5) tegn på infeksjon på operasjonsstedet. Den analgetiske buprenorfin (0,1 mg /kg) ble injisert i tilfelle av smerte eller ubehag. Absorberbare suturer og /eller stifter ble fjernet 10-14 dager etter operasjonen. Hvis sykelighet ikke er korrigert av våre intervensjoner, ble musene avlivet med CO2 fulgt ved halshugging
Cell isolasjon flowcytometri
Kreftceller ble isolert fra PDX samt 4-6 måneder gamle SmoA1Tg mus som følger. I korthet, ble tumorvevet skåret i små stykker, og inkubert ved 37 ° C i 30 minutter i fordøyelse buffer bestående av Dulbeccos PBS (DPBS, Life Technologies, Grand Island, NY) med 10 U /ml papain (Worthington, Lakewood, NJ) , 200 ug /ml L-cystein, og 250 U /ml DNase (Sigma, St. Louis, MO). Fordøyelsen Bufferen ble så fjernet og erstattet med DPBS inneholdende 8 mg /ml soyabønne trypsin-inhibitor (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 8 mg /ml bovint serum albumin (BSA, Sigma), og 250 U /ml DNase, etterfulgt av titrering av vev ved bruk av pipetter med synkende boringsdimensjon for å oppnå en enkel cellesuspensjon. Cellene ble sentrifugert ved romtemperatur og resuspendert i PBS inneholdende 200 ug /ml BSA (PBS /BSA) og føres gjennom en cellefilter (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) for å fjerne rusk. Denne suspensjonen ble sentrifugert gjennom en trinngradient på 35% og 65% Percol (Amersham Biosciences), og cellene ble høstet fra 35% -65% grensesnitt, vasket i PBS /BSA. For sortering av CD15 + og CD15- celler, tumorceller ble resuspendert i FACS-buffer (DPBS + 2% FBS) og farget i 30 minutter med CD15-antistoff (BD Biosciences, Cat no. 340850, primære antibodiy) ble vasket med FACS-buffer, farget i 30 minutter med sekundær antibodiy (FITC), og deretter analysert eller sortert ved hjelp av en FACSVantage SE strømningscytometer.
Cell spredning, BrdU innlemmelse, apoptose og cellesyklus analyse
Kreftceller celler~~POS=HEADCOMP ble isolert som tidligere beskrevet [23] fra menneskelige pasient avledet xenografter (PDX) samt 4-6 måneder gamle
SmoA1
PTEN + /+ mus viser fysiske og atferdsmessige tegn på medulloblastoma.
FACS sortert CD15 + og CD15- celler ble sådd ut ved 4 x 10
4 celler /brønn i ultralav binding 96-brønners plater i serumfritt medium inneholdende Neurobasal og B27 kosttilskudd. Celler ble inkubert over natten og behandlet med DMSO eller inhibitorer i 48 timer. Cellelevedyktighet Analysen ble utført ved bruk av AlamarBlue® (Roche) i henhold til produsentens protokoll. For BrdU-inkorporering studier ble tumorceller isolert fra Smo A1 Tg modell som er beskrevet ovenfor. 2 millioner tumorceller per brønn ble sådd ut i 24-brønners plater i serumfritt medium inneholdende Neurobasal og B27 kosttilskudd. Cellene ble pulset med BrdU i 30 minutter og deretter vasket med media for å fjerne eventuelle gjenværende BrdU. Celler ble samlet opp umiddelbart etter pulsen ( «30 minutter») og farget med CD15-antistoff som beskrevet ovenfor. Cellene ble deretter fiksert og farget med FITC-BrdU Flow Kit (BD Biosciences) og propidiumjodid (PI) i henhold til produsentens instruksjoner. Analysen ble utført ved hjelp av en FACS Calibur flowcytometer (BD Biosciences). For apoptose studier ble CD15 + og CD15- celler behandlet med inhibitor i 24 timer, etterfulgt av caspase-3 aktivitet ved benyttelse sett (Roche) eller farging med annexin V
FITC-antistoff og propidiumjodid (PI) i henhold til fabrikantens instruksjoner ( BD, Pharmingen, San Diego, California). For cellesyklus analyse DNA-innholdet ble analysert med FACS Calibur flowcytometer (BD Biosciences).
Western blot analyse
FACS sortert CD15 + eller CD15- celler ble behandlet med ulike konsentrasjoner av hemmere eller DMSO for 30 minutter og deretter stimulert med IGF 50 ng /ml i 30 minutter. Cellene ble lysert med RIPA lysebuffer (Pierce) som inneholder proteasehemmer cocktail. Proteiner ble kvantifisert ved BCA-proteinanalyse (Pierce) og like mengder av protein, ble løst ved polyakrylamidgeler, overført til nitrocellulosemembran og probet med følgende primære antistoffer: (. Kat 9271) p-AKT (Ser473), p-AKT ( Thr308) (kat. 9275), AKT (kat. 9272), p-p70S6K (Thr389) (kat. 9205), p70S6K (kat. 2708), p-4EBP1 (Thr37 /46) (kat. 2855), 4EBP1 (kat. 9452), perk (Thr202 /Tyr204) (kat. 9101), p-PRAS40 (Thr246) (kat. 2997), PRAS40 (kat. 2610), p27 Kip1 (kat . 2552), p-MDM2 (S166) (kat 3521), Bad (kat 9292) og PARP (kat 9542) (alle fra cellesignalisering Technologies)…; p21 Cip1 /Waf1 (sc-397), Bax (sc-493) og β-aktin (sc-47778) fra Santacruz.
Kvantitativ sanntids analyse
RNA ble ekstrahert fra CD15 + og CD15- celler ved hjelp RNeasy Kit (Qiagen, Germantown, MD) i henhold til produsentens instruksjoner. For rtPCR, ble cDNA fremstilt fra 1 ug RNA-prøve ved anvendelse av iscript cDNA syntese kit (Bio-Rad, Hercules, CA). cDNA ble amplifisert ved RT-PCR-reaksjoner med 1 x SYBR grønn SuperMix (Bio-Rad, Hercules, CA) i 96-brønners plater på et CFX96 Sanntid-system (Bio-Rad, Hercules, CA) ved bruk av forskjellige primere for human eller mus gener. Sekvensen av primerne er som beskrevet i tabell S1. Relative ekspresjonsnivåer ble normalisert til GAPDH-ekspresjon i henhold til formel; 2 ^ (Ct genet av interesse-Ct GAPDH) .
In-vivo
BKM120 behandling
For å studere effekten av BKM-120 på tumorvekst
in vivo
, CD15 + og CD15- TPC ble implantert intracranially inn i cerebella av sekundære NSG mus eller subkutant i nu-nu mus. For subkutane tumorer 20 dager etter transplantasjonen, ble musene tilfeldig delt inn i to grupper: Gruppe 1 fikk bærer (ubehandlet) og Gruppe 2 ble gitt 30 mg /kg BKM-120 ved oral tvangsforing en gang daglig i 21 dager. Tumor dimensjoner ble registrert hver tredje dag og tumorvolum ble målt ved hjelp av følgende formel: volum = 0,5 x lengde x (bredde)
2. For intrakranielle svulster, 40-50 dager etter implantering, ble svulster sjekket av MR og delt inn i grupper og behandles som beskrevet for subkutane svulster. Måling av tumorvolumet for subkutant implantert tumor ble gjort av kalipere og for intrakranielle implantert tumor ble utført av Magnetic resonance imaging (MRI). MRI ble utført ved anvendelse av en 1,0-T MR. Mus ble bedøvet med 2% isofluorane og musene ble så fotografert med en Aspect M2 1.0-Tesla lite dyr scanner (Aspect Imaging, Shoham, Israel). T2-vektet, ble bilder oppnådd ved hjelp av en repetisjonstid på 2500 ms, en ekkotid på 60 ms, en skive tykkelse på 1 mm, synsfelt på 35 mm og en matrisestørrelse på 184 x 184 (i planet oppløsning av 35 /184 = 0,19 mm). For MR imaging studier, ble tumorvolum målt ved manuelt å segmentere svulster ved hjelp av enten Varian Image Browser-programvaren eller den offentlige sfæren program ImageJ Image (https://rsb.info.nih.gov/ij). T2-vektede bilder ble noen ganger brukt til å bidra til å avklare tumoravgrensninger.
Menneskelig svulst isolasjon og forplantning
Menneskelig MB vev for pasient avledet xenografter ble innhentet fra kirurgisk fjerning av svulster på Rady Children Hospital ( San Diego, CA). Alle prosedyrer ved hjelp av menneskelig vev ble godkjent av Institutional Review styrene Rady Children Hospital. Ved gjenvinning, ble vevet mekanisk dissosiert til en enkelt cellesuspensjon, deretter umiddelbart injisert i hjernen av NSG mus. Når musene ble symptomatisk, ble tumorene igjen dissosiert til enkeltcellesuspensjoner, og deretter på nytt transplantert tilbake inn i hjernen av naive verter for å etablere en formert linje for hver enkelt pasient-avledet xenograft.
Microarray analyse
SmoA1Tg
tumorceller ble sortert i CD15 + og CD15- populasjoner og brukes for RNA isolering hjelp RNeasy Kit (Qiagen, Germantown, MD). RNA integritet ble vurdert ved hjelp av en Agilent 2100 Bioanalyzer. Prøver som viser RNA integritet (RIN) som er større enn 8,0 ble anvendt for microarray analyse. RNA ble merket og hybridisert til Affymetrix Mouse Genome 1,0 ST arrays. Matrisen data ble behandlet av RMA programvare. Betydning Analyse av Microarray (SAM) programvare ble benyttet for å bestemme differensial uttrykk med en falsk oppdagelse hastighet (FDR) mindre enn 1% og et minimum-gangers forandring av to med mindre annet er angitt. Heatmaps ble generert ved hjelp av R-pakken. Genekspresjonsdata ble forvandlet til Z-score og hierarkisk clustering med en euklidsk avstand ble brukt til å generere rad- og kolonne dendrogrammer. Microarray data har blitt deponert i GEO offentlig database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), med GEO tiltredelse nummer er GSE41717.
Underklasse og SUBMAP analyse for å sammenligne murine CD15 + TPCs til menneske MB undergrupper
MB underklasse og SUBMAP analyse, som gir mulighet for kryss-plattform og kryss-arter sammenligning av microarray data basert på Kolmogorov-Smirnov statistikk (33), ble brukt til å sammenligne muse svulster til menneske MB prøver beskrevet i [4]. Den Underklasse Kartlegging modul i Gene mønster programvarepakken (www.broadinstitute.org/genepattern) ble anvendt for å sammenligne mus datasettet til et genekspresjon datasett som består av primære humane MB klassifiseres i undergrupper molekyl (C1-C6) som definert i et Cho al. og en serie av normale lillehjernen prøver og atypiske teratoid rhabdoid tumorer [4]. Resultater fra kartleggingen er representert som en underklasse forening (SA) matrise fylt med p-verdier for hver underklasse forening.
Gene sett berikelse analyse (GSEA)
GSEA ble utført som beskrevet i [ ,,,0],38]. Kort fortalt gener ble beordret basert på deres differensial uttrykk mellom to klasser (CD15 + vs. CD15-). En anrikning score (ES) ble så beregnet for hvert gen set. Gensettene med en nominell p-verdi 0.05 ble inkludert som vesentlig. For denne analysen ble kuratert gensettene (K2) fra MSigDB v.3.0 (https://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp) utnyttet. PCA analyse av de 22 ledende gener identifisert i SUBMAP evalueringen ble sammenlignet på tvers av artsbarrieren i CD15 +, CD15- og i menneskelig MB svulst genuttrykk database [4].
Resultater
PI- 3K signale er sterkt forhøyet i CD15 + TPCs isolert fra
SmoA1 Tg
medulloblastoma musemodell
Det er vel etablert at CD15 er en markør for kreft spre celler i Ptc +/- modell av SHH drevet Medulloblastomas [ ,,,0],23]. I denne studien,
ND2SmoA1
transgen musemodell ble brukt for å karakterisere signalveier som kreves for spredning av CD15 + TPCs. Først spilte vi setting i vår
SmoA1
modell for å validere at CD15 er en celleoverflaten markør for kreft spre celler i denne Shh drevet medulloblastoma modell. For dette formål ble en ortotopisk transplantasjon assay etablert i hvilke
SmoA1
PTEN + /+ tumor-celler ble sortert i CD15 + og CD15- fraksjoner, og 2 x 10
6-celler fra hver fraksjon ble stereotaksisk implantert i cerebellum av nakne /
nu-nu
mus. S1A Fig viser FACS data som validerer at rent CD15 + befolkningen er isolert fra svulster. Som vist i figur S1B, implantering av bare CD15 + TPCs ført til sekundære tumorer i løpet av 10-12 uker at histologisk lignet de primære tumorene fra hvilken cellene ble avledet (data ikke vist). I S1B figur viser vi Ki67 flekker bare i videregående svulster avledet fra CD15 + TPCs indikerer høyere proliferativ indeks av disse cellene i forhold til normal hjerne. Videre våre funn viser at bare CD15 + celler fra
SmoA1 PTEN + /+
medulloblastoma kan generere svulster
in vivo
. For ytterligere å evaluere stamcelle lignende egenskaper av CD15 + TPC, utførte vi sanntid PCR-analyse av et antall stamcellemarkører, og resultatene viser at enkelte stammecellemarkører, f.eks Oct4, klf4, sox2, CXCR4, pou5f1, Nanog, nestin og Musashi er høyanriket i CD15 + TPC rommet i
SmoA1
Tg musemodell (S1C fig). For å få ytterligere innsikt i svulsten spre egenskaper av CD15 + celler, utførte vi en rekke biokjemiske og genomiske analyser av CD15 + og CD15- celle populasjoner isolert fra
SmoA1
Tg svulster. Basert på denne analysen, fant vi at CD15 + befolkningen isolert fra Smo
A1
Tg mus modell skjema Neurosfærene (data ikke vist), viser en tydelig uttrykk mønster og er svært proliferativ som avsløres ved å øke levedyktige celler over tid (fig 1A, venstre panel) og høyere BrdU-inkorporering i CD15 + celler sammenlignet med CD15- celler fra samme tumor (figur 1A, høyre panel). Dette resultatet er også støttet av høyere H
3-tymidininkorporering (data ikke vist) i CD15 + celler sammenlignet med CD15- celler. Dataene som presenteres i S2 tabell og S2 figur viser at gener knyttet til spredning og celle overlevelse (S2A figur), SHH signalveien (S2B S2C figur) og angiogenese (S2D figur) er sterkt forhøyet i CD15 + befolkningen. Samlet indikerer disse dataene at tumoren utbredende kapasitet av CD15 + celler er assosiert med en øket kapasitet til å proliferere og en redusert tendens til å gjennomgå apoptose og differensiering.
CD15 + TPCs isolert fra
SmoA1
Tg medulloblastoma musemodell er svært proliferativ og viser forhøyet PI-3K signalering (A) Venstre panel viser spredning av CD15 + og CD15- celler isolert fra
Smo A1
svulster. FACS-sortert CD15 + og CD15- tumorceller (n = 4) ble dyrket i 48 timer i serumfritt medium, fulgt av tilsetning av AlamarBlue® og inkubering av platene ved 37 ° C i 5% CO
2 i 6 timer. Fluorescens signalene ble lest som utslipp på 590 nm etter eksitasjon ved 560 nm. Høyre panel viser BrdU innlemmelse i CD15 + og CD15- celler isolert fra Smo A1 Tg. CD15 + og CD15- fra SMO svulster ble pulset med BrdU som beskrevet i materialer og metoder. (B) FACS-sortert CD15 + og CD15- celler ble analysert for ekspresjon av PTEN og fosforylering av Akt, 4EBP1, P70S6K og Erk. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (C) Kvantitativ PCR-analyse av mRNA for ekspresjon av PTEN i FACS-sortert CD15 + og CD15- celler (n = 3). Relative ekspresjonsnivåer ble normalisert til GAPDH uttrykk. Eksperimentet ble gjentatt 3 ganger med lignende resultater.
PI-3K /AKT-reaksjonsveien har vist seg å være viktig for spredning av TPCs i både faste tumorer og leukemi [31-33]. For å undersøke potensialet mekanistiske rolle for PI-3K signalveien i TPC forplantning og overlevelse i medulloblastoma, bestemt vi den relative aktivering staten PI-3K /AKT i CD15 + TPCs vs. CD15- ikke-TPCs. Western blot analyse viste at CD15 + celler som har lavere basale nivåer av ekspresjon av PTEN, og har en aktivert PI-3K signaleringsaksen i forhold til CD15- celler, viser betydelig økning i fosfo-AKT, fosfo-S6 og fosfo-4EBP1 (figur 1B). Disse resultatene ble understøttet av de forstørrede nivåene av PTEN mRNA påvist i CD15- populasjon sammenlignet med de CD15 + celler (figur 1C). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at PTEN uttrykk er nedregulert og PI-3K signale er forhøyet i CD15 + TPC i forhold til CD15- befolkningen.
Fortrinnsrett målretting av TPC ved PI-3K-hemmere
in vitro
resultatene ovenfor viser at PI-3K signale oppregulert i CD15 + TPC som bestemmes av de lavere nivåene av PTEN og aktivering av AKT. Derfor hypotese vi at behandling av CD15 + celler med PI-3K-hemmere vil fortrinnsvis blokkere spredning av CD15 + TPCs. For dette ble et panel av PI-3K-hemmere, SF1126 [39], Bez-235 [40] (Selleck kjemikalier), PF4691502 [41] (Selleck kjemikalier) og BKM120 [42] (Novartis) brukes. Cisplatinaindusert, TMZ og NVP-LDE-225 ble kjøpt fra Selleck Chemicals. Resultatene i figur 2A viser at selv om PI-3K-hemmere avhengig av dose redusere spredning av både CD15 + og CD15- TPCs isolert fra
SmoA1
Tg mus modell, det var mer potent mot CD15 + befolkningen. IC
50 for BKM120, BEZ, PF4691502 og SF1126 er 0,156 mikrometer, 0,167 mikrometer, 2,6 mikrometer og 4,3 mikrometer for CD15 + celler og 6,17 mikrometer, 5,54 mikrometer, 4,8 mikrometer og 19,9 um eller CD15- celler, henholdsvis. Tidligere arbeid har foreslått at BKM120 har god blod-hjernebarrieren penetrasjon [42]. Derfor valgte vi BKM120 for våre
in vivo
studier. Eksisterende behandling for yngre barn med medulloblastom har omfattet bruk av multiagent kjemo-terapeutiske tilnærminger inkludert kjemoterapeutiske midler, temozolomid, cisplatina [43, 44] og NVP-LDE225, en Smo antagonist som er utviklet av Novartis [45]. Derfor, undersøkte vi den relative cytotoksisiteten av disse stoffene i CD15 + vs CD15- tumorceller. For disse eksperimentene, CD15 + og CD15- celler isolert fra Smo
A1
Tg modellen ble behandlet med BKM120, cisplatinaindusert, TMZ, NVP-LDE225 eller kombinasjon av BKM120 med cisplatinaindusert eller TMZ eller NVP-LDE225. Interessant, cisplatinaindusert (IC
50 11,4 mikrometer for CD15 + celler og 4,5 mikrometer for CD15- celler) og TMZ (IC
50 30 mikrometer for CD15 + celler og 20 mikrometer for CD15- celler) har ingen effekt, mens NVP- LDE-225 (IC
50 2,8 uM for CD15 + -celler og 2,5 uM for CD15- celler) har meget mindre effekt på overlevelsen av CD15 + celler (figur 2B), hvilket antyder at CSC /TPCs er resistente mot konvensjonell kjemoterapi. S3A og S3b figur viser doseavhengig effekt av cisplatin, og TMZ på CD15 + og CD15- celler. NVP-LDE-225 viste cytotoksiske effekter ved høye doser i CD15 + og CD15- celler, med ingen signifikant effekt på 100 nM kons. (S3A S3b figur) Interessant kombinasjon av BKM120 cisplatinaindusert og BKM120 TMZ førte ikke til økning av cytotoksisitet aktivitet i CD15 + celler (figur 2B). Men kombinasjonen av BKM120 og NVP-LDE225 viste synergi i CD15 + celler (fig 2B). Vi neste fastslått, hvis PI-3K-hemmere kan blokkere forhøyet PI-3K signalkaskade i CD15 + TPCs. Behandling av CD15 + celler med forskjellige doser av BKM120 i 30 minutter, hemmet fosforylering av AKT, nedstrøms mål PRAS40 og mTOR substrater PS6, p4EBP1 på en doseavhengig måte (figur 2C) som oppviser en dramatisk reduksjon på 2,0 uM og nesten fullstendig hemming hos 10,0 mikrometer. Real time PCR-analyse viste at to mikrometer konsentrasjon av BKM120 fullstendig undertrykt uttrykket av Shh pathway gener viz.,
gli1
,
gli2
,
N-myc
,
C-Myc
, og
cyclin-D1 plakater (figur 2D).
Fortrinnsrett målretting av TPCs av PI-3K-hemmere
in vitro product: (A) Effect av PI-3K-hemmere om spredning av CD15 + og CD15- celler. CD15 + og CD15- celler ble dyrket i serum-fritt medium som ikke inneholdt additiv, DMSO (kjøretøy), BKM-120, Bez-235, PF-04691502, og SF1126 ved forskjellig kons. Etter 48 timer ble AlamarBlue® tilsatt, og platene ble inkubert ved 37 ° C i 5% CO
2 til 6 timer. Fluorescens signalene ble lest som utslipp på 590 nm etter eksitasjon ved 560 nm. (B) CD15 + og CD15- celler ble behandlet med 100 nM kons. av cisplatina, TMZ, NVP-LDE-225, enten alene eller i kombinasjon med BKM 120 og analysert med hensyn til cellenes levedyktighet ved hjelp av Alamar blå. (C) CD15 + TPCs ble behandlet med BKM120 i 30 minutter etterfulgt av stimulering med IGF (50 ng /ml). Cellelysater ble analysert ved Western blot for fosforylering av substrater av PI-3K signalering. (D) Relativ uttrykk for Shh pathway gener i BKM120 behandlet (0,2, 2,0 mm) og ubehandlet CD15 + TPCs. Relative ekspresjonsnivåer ble normalisert til GAPDH. Grafer presentere gjennomsnitt ± SEM av 3-4 mus i hver gruppe for B og D. Statistisk signifikans er vurdert av to prøve
t
-test hvor * betegner
P
0,05, ** betegner henvisninger
P
0,01 og *** betegner
P
0,001. Forsøket ble gjentatt 4-5 ganger med samme resultat
Differensial følsomheten CD15 + vs CD15- celler til PI-3 kinase inhibitor.; Hemming av PI-3K vei undertrykker spredning ved å indusere cellesyklus arrest og indusere apoptose i CD15 + TPCs men ikke i CD15- celler
Vi neste undersøkt om PI-3K-hemmere kan forårsake cellesyklus arrest i CD15 + TPC rommet . For dette vi først evaluert grunnlinjen prosenter av CD15 + og CD15- celler i forskjellige faser av cellesyklusen, og funnet ut at 67% 26% av den CD15- TPCs var i G0-G1 versus henholdsvis S-fasen, mens CD15 + celler som utgjør 48% og 45% av cellene i G0-G1 i forhold til S-fasen, respektivt (figur 3A).
