Abstract
Bakgrunn
Topotecan produserer DNA-skader som induserer autofagi i kreftceller . I denne studien ble sensibiliserende topotekan til tykktarmskreftceller med ulik P53 status via modulering av autofagi undersøkt.
metodikk /hovedfunnene
DNA-skader indusert av topotekanbehandling resulterte i cytoprotective autofagi i tykktarm kreftceller med vill-type p53. Men i celler med mutert p53 eller p53 knockout, behandling med topotekan indusert autofagi-forbundet celledød. I villtype p53 kolon kreftceller, topotekanbehandling aktivert p53, oppregulert ekspresjon av sestrin 2, indusert fosforylering av den AMPKα subenheten ved Thr172, og inhiberte mTORC1 pathway. Videre er inhiberingen av autophagy forbedret anti-tumoreffekten til topotekanbehandling i villtype p53 colon cancerceller men lindres anti-tumoreffekten til topotekanbehandling i p53 knockout-celler in vivo.
Konklusjoner /Betydningen
Disse resultatene antyder at villtype p53-avhengig induksjon av cytobeskyttende autophagy er en av de cellulære responser som bestemmer celle følsomhet overfor DNA-ødeleggende medikament topotecan. Derfor vår studie gir en potensiell terapeutisk strategi som utnytter en kombinasjon av DNA-skadende midler og autofagi hemmere for behandling av tykktarmskreft med vill-type p53
Citation. Li DD, Sun T, Wu XQ, Chen SP, Deng R, Jiang S, et al. (2012) The Hemming av Autophagy sensitiviteten Colon kreft celler med vill-type p53 men ikke Mutant p53 til topotekanbehandling. PLoS ONE 7 (9): e45058. doi: 10,1371 /journal.pone.0045058
Redaktør: Gian Maria Fimia, Istituto Nazionale per le Malattie Infettive, Italia
mottatt: 13 februar 2012; Godkjent: 15 august 2012; Publisert: 14. september 2012 |
Copyright: © Li et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (30873085, 30972882, 81101670) (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default106.htm), Major Science and Technology prosjektet av National Grunnforskning program (973 program) Kina (2011CB504300) og Science Foundation Natural i Guangdong i Kina (S2011020002759). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Topotecan, en topoisomerase i-inhibitor som induserer DNA-skade, blir brukt til behandling av tykktarmskreft, eggstokk-kreft, lungekreft, og avansert kreft i livmorhalsen [1], [2]. Mens DNA-skadende midler har blitt benyttet i løpet av de siste 50 årene, på grunn av at noen pasienter viser ulike følelser for en DNA-skade stoffet er fortsatt uklart. Derfor, er innsikt i den cellulære responser utløst av DNA-skadende midler og mekanismene som bestemmer medikamentsensitivitet kritisk for å utvide anvendbarheten av DNA -damaging medikamenter for behandling av kreft.
Autophagy er en katabolsk mekanisme som er involvert i resirkulering og omsetning av cytoplasmatiske komponenter [3], [4]. Autophagy kan lette cellulær overlevelse eller død som respons på forskjellige stimuli spennings [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12]. Autophagy spiller også en viktig rolle i opprettholdelsen av genomisk stabilitet [13], [14], [15] ved å opprettholde forbrenningen og overlevelse under påkjenninger (f.eks DNA-skade) til fordel for celleoverlevelse [16]. Mange studier har vist at autofagi er assosiert med en rekke patologiske tilstander, inkludert kreft [10], infeksjonssykdommer, myopatier og neurodegenerative lidelser [17], [18], [19]. Fordi funksjonen av autophagy i kreftformer er komplisert og kan ha motstående konsekvenser [7], mange hypoteser har blitt foreslått når det gjelder rollen til autophagy i kreft. En av disse hypoteser antyder at rollen til autophagy avhenger av fasen av tumorutvikling [20]. På et tidlig stadium av svulst utvikling, genetisk bevis fast indikerer at autofagi undertrykker startfasen. Men overbevisende data antyder også at etablerte kreftceller, men ikke initiere kreftceller, krever autofagi som en avgjørende overlevelse sti ved fremskredne stadier av svulst utvikling. Svulster ofte befinner seg i et miljø ute av næringsstoffer, vekstfaktorer og oksygen. Således er autophagy lokalisert til de hypoksiske tumor områder som er mest fjerntliggende fra nærings-tilførsel blodkar hvor det oppretttumorcelleoverlevelse. En annen hypotese foreslår at autophagy regulerer kreft i et celle- og vev-spesifikk måte, [21], [22]. Mange kreftceller gjennomgå autophagic celledød etter kreft terapi; Men autofagi beskytter også noen kreftceller mot kreft behandlinger ved å blokkere apoptotiske sti.
p53 tumor suppressor er en viktig molekyl i respons til DNA-skader. Som svar på vanskelige forhold, inkludert gentoksisk, hypoksisk og /eller onkogene stress, p53 raskt gjennomgår reversible posttranslasjonelle modifikasjoner som letter sin stabilisering [23]. I kjernen, kan aktiv p53 bindes til promotorområdene og transactivate en mengde av målgener som er involvert i cellesyklusprogresjon, apoptose og /eller metabolisme [24]. p53 medierer også transkripsjons-uavhengig tumorhemmende funksjoner utsiden av kjernen [25]. For eksempel kan cytoplasmatiske p53 relocalise til mitokondriene og utløse mitokondriemembranen permeabilisation [26], [27].
I kreft, mange koblinger finnes mellom autofagi og p53 som ennå ikke er fullt ut forstått [28]. En studie rapporterte at P53 fremmet autofagi gjennom AMP-kinase (AMPK) aktivering og mammalian target of rapamycin (mTOR) hemming [29]. Imidlertid oppsamling av bevis indikerer at P53 tumor suppressor kan modulere autophagy på flere måter, avhengig av sin subcellulære lokalisering [25]. På den ene siden, er p53 en transkripsjonsfaktor som reagerer på cellulært stress og transaktiverer gener som for eksempel DRAM, sestrins1 og sestrins2 som induserer autofagi eller autophagic celledød [30], [31], [32]. Men på den annen side, kan cytoplasmisk men ikke atom p53 aktivere mTOR og undertrykke autofagi [33]. Videre kan p53 også indusere autofagi ved regulering av LC3 [34]. Men å forstå hvordan disse effektene oppnås fortsatt ukjent.
I denne studien rapporterer vi at villtype p53 kan aktivere AMPK, hemmer mTORC1 og fremme tykktarmskreftceller overlevelse ved at cytoprotective autofagi i respons til topotekanbehandling . Videre er inhiberingen av autophagy sensitiviteten tykktarmskreftceller med vill-type p53 til topotekanbehandling. I motsetning til inhibering av autophagy lindres anti-tumoreffekten til topotekanbehandling i p53 mutante eller utstansing tykktarmskreftceller både in vitro og in vivo. Derfor vår studie viser at en kombinasjon av DNA-skadende midler og autofagi hemmere kan potensielt tjene som en roman kjemoterapeutiske tilnærming til behandling av tykktarm kreft celler med vill-type p53.
Resultater
topotekanbehandling indusert autophagy i Colon Cancer Cell Lines
en punktat LC3 fargemønsteret har blitt identifisert som en biologisk markør for autofagi [35], [36]. For å undersøke om DNA-ødeleggende middel topotekan kan indusere autofagi, ble HCT116, LS-174T og HT29 celler som uttrykker LC3 smeltet til gul fluoriserende protein (YFP-LC3) opprettet. Som vist på fig. 1A, i de ubehandlede celler, YFP-LC3 ble jevnt fordelt i cytosol. Imidlertid topotekanbehandling induserte en kraftig akkumulering av YFP-LC3 foci i disse cellene. LC3 omdannes til lipidert LC3 (LC3-II) ved dannelse av en autophagosome, og LC3-II vandrer raskere i forhold til den nonlipidated LC3-I på en SDS /PAGE-gel [37]. Vi brukte denne forskjellen i migrasjon for ytterligere å overvåke LC3-II-nivåer etter topotekanbehandling og funnet at utseendet på LC3-II ble indusert ved et høyt nivå av topotekanbehandling i en rekke av tykktarmskreft cellelinjer (Fig. 1B og fig. S1). Modne auto-lysosomer utsettes for autophagic proteolyse, noe som fører til et redusert nivå av autophagic substrater, så vel som reduserte nivåer av autophagosome og auto-lysosomet komponenter, slik som p62 /SQSTM1 [38], [39]. For ytterligere å bekrefte at autophagic prosessen ble indusert av topotekanbehandling, vi har oppdaget at P62-proteinet ved Western blotting. Resultatene viste at P62 ble nedbrutt etter topotekanbehandling, noe som indikerer autophagy ble indusert i disse tykktarmskreftceller (Fig. 1B og fig. S1).
A. HCT116, LS-174T og HT29-celler ble transfektert i 24 timer med en ekspresjonskonstruksjon som koder LC3 kondensert til den gule fluorescerende protein (YFP-LC3). Deretter ble cellene behandlet med eller uten 1 mg /ml topotekan (TPT) i 24 timer og visualisert under et konfokalt mikroskop. B. De angitte celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av topotecan i 24 timer. Lysatene ble analysert ved immunoblotting med de LC3 og P62-antistoffer.
Den Hemming av Autophagy Økt følsomhet for menneske Colon kreft celler med vill-type p53, men ikke Mutant p53 eller p53 Knockout Cells til topotekanbehandling
for å studere topotekanindusert autofagi i større detalj, ble RNA interferens brukt til å tømme to kjente kjerne autofagi proteiner, beclin1 og ATG5 (fig. 2A og S2A fig.). Som vist på fig. 2B og fig. S2B, uttømming av beclin en eller ATG5 ved siRNA behandling effektivt blokkerte akkumulering av LC3-II etter topotecan behandling, noe som indikerer inhibering av autophagy. Videre er inhiberingen av autophagy ved uttømming av beclin en eller ATG5 øket topotekanindusert celledød i HCT116 og LS-174T cellelinjer, som er p53 villtype humane tarmkreftceller (Fig. 2C). Disse resultater ble også bekreftet ved SRB-analysen (fig. S3A). Disse resultater indikerer at topotekanbehandling indusert funksjonell og cytobeskyttende autophagy i disse p53 villtype-celler. For ytterligere å bekrefte resultatene våre, vi også hemmet autophagic vei med farmakologiske hemmere. Vi har funnet at en samtidig behandling av topotekan med klorokin (CQ), en inhibitor av lysosomal funksjon som hindrer gjennomføringen av autophagy ved sluttrinnet, effektivt blokkerte topotekanindusert nedbrytning av P62. Viktigere, inhibering av autophagy av CQ også lysfølsomt HCT116-celler til topotekan-indusert celledød (fig. 2D og S2C fig.).
A. Lysater fra HCT116-celler transfektert med beclin 1-siRNA eller Atg5- shRNA ble analysert ved immunblotting. B. En immunblotanalyse viste ingen akkumulering av LC3-II i autofagi-defekt (dvs., beclin 1-siRNA eller Atg5-shRNA behandlede) celler etter behandling med 1 mg /ml TPT. C. HCT116 og LS-174T kontroll-celler, sibeclin 1-celler, og shAtg5-celler ble dyrket ved 6000 celler per brønn i en 96-brønns plate og eksponert for forskjellige konsentrasjoner av topotekan (0,039 til 1,25 ug /ml) for 72 h. Nivået av veksthemning ble detektert ved anvendelse av MTT-analysen. Data i C er midler ± S.D. (
n
= 3).
P
0,05, Student t-test. D. HCT116-celler ble inkubert med 1 mg /ml topotekan og /eller 10 mikrogram /ml CQ i 24 timer. Lysatene ble analysert ved immunblotting med P62-antistoffer. HCT116-celler ble inkubert med de angitte konsentrasjoner av topotekan eller en kombinasjon av topotecan og 10 ug /mL CQ i 24 timer. Mengden av celledød ble kvantifisert ved bruk av PI farging analysen ved strømningscytometri. Data i D er midler ± S.D. (
n
= 3). *
P
0,05, **
P
. 0,01, Student
t
test
Interessant, i motsetning til celler med villtype p53, inhibering av autophagy ved CQ i p53-mutante celler blokkerte celledød indusert av topotekanbehandling (fig. 3A). Videre er det i celler hvor p53-genet var blitt slått ut somatisk (HCT116 p53
– /-), inhibering av autophagy ved behandling CQ også blokkert topotekan-indusert celledød (figur 3B.). Tilsvarende hadde inhibering av autophagy ved Atg5 uttømming ikke sensitivisere HCT116 p53 – /- celler overfor topotekan-indusert celledød (figur 3C og S3b fig..). I sammendraget, hemming av autofagi sensitivisert tykktarm kreft celler med vill-type p53 til topotekanbehandling; imidlertid, ble topotekan-indusert celledød mildnet i p53 knockout-celler ved hemning autofagi.
HT29, SW480, SW620 og cellene ble inkubert med de angitte konsentrasjoner av topotekan eller en kombinasjon av topotecan og 10 ug /mL CQ i 24 timer. Mengden av celledød ble kvantifisert ved bruk av PI farging analysen ved strømningscytometri. Data i A er midler ± S.D. (
n
= 3). *
P
0,05, **
P
0,01, Student
t
test B. HCT116 p53
+ /+ og HCT116 p53
– /- celler ble dyrket ved 6000 celler per brønn i en 96-brønns plate og eksponert for forskjellige konsentrasjoner av TPT (0,0625 til 2 mg /ml) og /eller 10 mikrogram /ml CQ i 72 timer. Nivået av veksthemning ble detektert ved anvendelse av MTT-analysen. C. Lysater fra HCT116 p53
– /- celler transfektert med vektoren eller Atg5 shRNA ble analysert ved immunblotting. MTT-assay ble anvendt for å analysere nivået av cellevekst inhibering. Dataene i B, C er middel ± S.D. (
n
= 3).
P
. 0,05, Student
t
test
topotekanindusert Autophagy ble formidlet av p53 Gjennom Aktivering av Sestrin 2 og AMPK i tykktarm kreft celler med Wild-type p53
p53 tumor suppressor aktiveres på flere typer DNA-skader og i sin tur hemmer celledeling gjennom induksjon av spesifikke målgener [40]. Dermed neste forsøkte vi å undersøke om P53 og dens målgener var involvert i topotekanindusert-autofagi. Som forventet, stimulert topotekanbehandling en økning i nivået av P53 på en doseavhengig måte i HCT116 og LS174T cellelinjer. Videre topotekanbehandling økte også ekspresjon av P53 målgen, sestrin 2. fosforylering av AMPK ble også særlig øket etter topotekan eksponering (fig. 4A og S4A fig.). I tillegg behandling med sirnas rettet mot p53 eller sestrin to effektivt avskaffet topotekanindusert AMPK aktivering og LC3-II akkumulering (Fig. 4B og Fig. S4B). Disse funnene tyder på at P53 formidler topotekanindusert autofagi gjennom aktivering av sestrin 2 og AMPK i tykktarm kreft celler med vill-type p53.
A. HCT116 og LS-174T-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av TPT i 24 timer. Nivåene av P53, sestrin2 og p-AMPK ble analysert ved immunblotting. B. HCT116-celler ble transfektert med p53 eller sestrin 2 sirnas i 24 timer, behandlet med eller uten 1 mg /ml TFT i ytterligere 24 timer, og de angitte proteiner ble deretter analysert ved immunblotting. C. HCT116-celler ble transfektert med LKB1 eller CaMKKβ sirnas, behandlet med eller uten 1 mg /ml TFT i ytterligere 24 timer, og de angitte proteiner ble påvist ved immunblotting.
Ca
2 + /kalmodulin-avhengig kinase β (CaMKKβ) kan fosforylere og aktivere AMPK i respons til økt kalsiumnivå [41], [42]. Studier har også vist at den LKB1 serin-treonin-kinase er nødvendig for aktivering av AMPK som reaksjon på stress [43]. AMPK kan fosforyleres av transformerende vekstfaktor-β-aktivert kinase 1 (TAK1), som aktiverer AMPK ved TRAIL behandling [14]. For å undersøke om disse kjente AMPK aktivatorer var involvert i denne prosessen, var uttrykk for LKB1 og CaMKKβ slått ned ved hjelp av siRNA. Resultatene viste at selv etter effektiv uttømming av LKB1 og CaMKKβ, verken topotekanindusert AMPK aktivering heller LC3-II akkumulering ble berørt (fig. 4C og S4C fig.).
topotekanbehandling Induced Autophagy Gjennom den AMPK-mediert hemming av mTORC1 i Wild-type p53 Colon kreft celler
AMPK spiller en nøkkelrolle i å opprettholde energi homeostase og autofagi aktivisering [44]. For å undersøke effekten av topotekanbehandling på AMPK aktivitet, ble HCT116 og LS-174T celler eksponert for topotekan i en dose- og tidsavhengig måte. Topotekanbehandling noteably aktivert AMPK i de to testede cellelinjer med vill-type p53, som ble vist ved fosforylering av AMPKα ved det aktive setet rest Thr172 (Fig. 5A og S5a fig.). Også topotekanbehandling induserte en rask og vedvarende aktivering av AMPK, som var tydelig av en økning i fosforylering av acetyl-CoA-karboksylase (ACC), et velkjent AMPK substrat, ved Ser79 (Fig. 5B Fig. S5b). Studier har vist at mTOR kan ane endringer i den cellulære energitilstand gjennom AMP-aktivert protein kinase (AMPK), og hemming av mTORC1 av AMPK kan øke autofagi [45]. I samsvar med disse resultatene, fant vi at topotekanbehandling hemmet mTORC1 sti, som var tydelig av en redusert fosforylering av ribosomalt protein S6 kinase 1 (p70S6K), en direkte mTORC1 substrat (Fig. 5A og Fig. S5a).
HCT116 og LS-174T-celler ble behandlet med TPT i 24 timer. Uttrykket nivåer av de angitte proteiner ble analysert ved immunblotting. B. HCT116-celler behandlet med 1 pg /ml TFT i de angitte tidsrom. Cellelysatene ble analysert ved immunblotting med fosfo-ACC-antistoffer. C. Cellene ble behandlet med 1 pg /ml TPT og /eller 20 pM Forbindelse C i 24 timer, og uttrykket nivåer av de angitte proteiner ble analysert ved immunblotting. D. HCT116-celler ble transfektert med kontroll eller AMPKα sirnas i 48 timer, behandlet med eller uten 1 mg /ml TPT, og nivået av de angitte proteiner ble deretter analysert ved immunblotting.
å bestemme hvorvidt AMPK aktivitet var avgjørende for topotekanindusert autofagi, hemmet vi aktiviteten til AMPK ved hjelp av en farmakologisk inhibitor eller RNA interferens. Den pre-behandling av kreft celler med 20 pM forbindelse C, er en potent og selektiv inhibitor AMPK, effektivt forhindret topotekanindusert AMPK aktivering. På samme tid, ble topotekanindusert LC3-II opphopning også blokkert av forbindelse C-behandling. Disse resultatene indikerer at autofagi ble inhibert ved AMPK-inhibering (Fig. 5C og S5C fig.). Uttømming av den katalytiske α1-subenheten av AMPK ved hjelp av siRNA også bekreftet disse resultatene. Inhiberingen av AMPK aktivitet faktisk blokkert induksjon av autophagy, som var tydelig ved nivået på LC3-II (fig. 5D og S5D fig.). Videre uttømming av AMPKα gjenopprettet p70S6K-aktivitet, noe som indikerer at inhibering av mTORC1 ble lettet (fig. 5D og fig. S5D). Disse dataene antyder at autofagi indusert av DNA-ødeleggende middel, topotekan, avhenger av AMPK-mediert hemming av mTORC1.
Den Hemming av AMPK aktivering Økt følsomhet for menneske Colon kreft celler med vill-type p53 men ikke mutant p53 til topotekanbehandling
for å bekrefte om AMPK aktivitet var avgjørende for celle levedyktighet etter topotekanbehandling i kreftceller med villtype eller mutant p53, menneskelige tykktarmskreftceller ble behandlet med ulike konsentrasjoner av topotekan i nærvær eller fravær av AMPK-inhibitoren, forbindelse C. Som vist på fig. 6, den kombinerte behandlingen av topotekan med sammensatte C resulterte i en økt grad av cytotoksisitet i humane tykktarm kreft celler med vill-type p53 (HCT116 og LS174-T-cellelinjer). Men gjorde sammensatte C behandling ikke bevisst celler med mutert p53 (HT29, SW480 og SW620 cellelinjer) til topotekanbehandling. Basert på disse funnene, konkluderte vi med at aktivering av AMPK fungerer som en sentral megler i induksjon av cytoprotective autofagi som svar på DNA-skade i tykktarm kreft celler som inneholder vill-type p53, men ikke mutant p53.
Forskjellige celler ble dyrket ved 6000-8000 celler pr brønn i en 96-brønns plate og eksponert for forskjellige konsentrasjoner av TPT (0,15 til 2,5 ug /mL) og /eller 10 pM forbindelse C i 72 timer. Nivået av veksthemning ble detektert ved anvendelse av MTT-analysen. Dataene er midler ± S.D. (
n
= 3).
P
0,05, Student
t
test
The Anti-tumor aktivitet av topotekan i kombinasjon med Autophagy Inhibitor i en HCT116 Menneskelig Colon Cancer Xenotransplantat. modell
for å utforske in vivo effektiviteten av autofagi inhibitor CQ å bevisstvilltype p53 human tykktarm kreft celler til topotekanbehandling ble en xenograft modell i naken mus generert. Atymiske nakne mus ble injisert subkutant med 4 x 10
6 HCT116 p53
+ /+ og HCT116 p53
– /- kreftceller, og de resulterende tumorer fikk vokse i ca. 5 d for å frembringe et midlere tumorvolum på 40 mm
3 før medikamentbehandling. Den anti-tumor virkningene av topotecan, CQ, eller en kombinasjonsbehandling av de to stoffene ble evaluert i HCT116 p53
+ /+ og HCT116 p53
– /- xenografter. Topotecan ble administrert intraperitonealt en gang hvert 4 d (2 mg /kg), og CQ ble administrert intraperitonealt en gang daglig (10 mg /kg). Som vist på fig. 7, en forsinkelse i tumorvekst ble observert med topotekanbehandling alene, og kombinasjonen av CQ med topotekanbehandling økt anti-tumoreffekt i HCT116 p53
+ /+ xenograft modell. Imidlertid er anti-tumoreffekten til CQ ble ikke forbedret ved kombinasjonsbehandling med topotecan i HCT116 p53
– /- xenograft modell. Tvert imot, er kombinasjonen behandling syntes å forringe antitumoraktivitet av topotekan i denne modellen.
atymiske nakne mus ble injisert subkutant med 4 x 10
6 HCT116 p53
+ /+ eller HCT116 p53
– /- kreftceller. Seks mus ble gitt til hver av behandlingsgruppene. Tumorene fikk vokse i ca. 5 d for å frembringe et midlere tumorvolum på 40 mm
3 før medikamentbehandling. Topotecan ble administrert intraperitonealt en gang hvert 4 d (2 mg /kg), og CQ ble administrert intraperitonealt hver dag (10 mg /kg). Tumorvekst ble målt hver 4. dag i henhold til fremgangsmåten beskrevet i «Materialer og metoder» -delen. Resultater er presentert som gjennomsnitt ± S.D. (
n
= 6). *
P
. 0,05, Student
t
test
I tillegg effekten av AMPK inhibitor forbindelse C i kombinasjon med topotekan på xenograft modell var undersøkte. Etter å ha etablert effektiviteten in vitro for AMPK-hemmerindusert chemosensitization til topotekan i p53 villtype humane tarmkreftceller, ble xenograft modell i nakne mus som genereres for å utforske hvorvidt AMPK-inhibering var involvert i chemosensitization til topotekan in vivo. Som vist på fig. S6, spilte forbindelse C en lignende rolle som CQ i kombinasjon med topotekanbehandling. Forbindelse C kan øke antitumoreffekt i kombinasjon med topotecan i HCT116 p53 + /+, men ikke p53 – /-. Xenograft modell
resultat av våre resultater tyder på at inhibisjon av autophagy sensitiviteten tykktarmskreftceller med vill-type p53 til DNA-ødeleggende stoffer. Siden AMPK tjener som en sentral formidler i induksjon av cytobeskyttende autophagy i respons til DNA-skade, kan hemming av AMPK også forsterke effekten av DNA-ødeleggende medikamenter til kolon kreft celler med villtype p53.
diskusjon
Autophagy er en evolusjonært konservert lysosomal selv fordøyelsen. Effektene av autofagi i tumorigenesis og kreftbehandling er paradoksal. Det har blitt rapportert at autofagi er i stand til å undertrykke tumorgenesen gjennom å holde genomisk stabilitet og eliminering av p62. Men utnytte autofagi som cytoprotective mekanisme, kreftceller klarer å overleve i harde mikromiljø. Som svar på mange kreftterapi, er autophagy indusert som en pro-overlevelsesstrategi i humane kreftceller eller en medvirkende antitumor effekt. Derfor bør en stor innsats gjøres for å forsterke det som avgjør cellebeskyttende og cytocidale funksjoner av autofagi, som er avgjørende i målretting til rett autophagic signalveier som gjør kreftbehandling mer lovende. Heri, har vi funnet at villtype p53-mediert AMPK aktivering resulterte i cytobeskyttende autofagi i respons til DNA-ødeleggende medikament topotecan i humane tarmkreftceller. Hemming av autofagi sensitivisert tykktarm kreft celler med vill-type p53 til topotekanbehandling; imidlertid, autophagy inhibering dempet anti-tumoreffekten til topotekanbehandling i p53 mutante eller utstansing tykktarmskreftceller både in vitro og in vivo. Bortsett fra kjente mekanismer, foreslo vi at p53 kan modulere autofagi og foreslo at p53 status kunne bestemme celle skjebne etter DNA-skade stoffet topotekanindusert autofagi og å opprettholde autophagic homeostase.
Når det gjelder kreft, finnes mange linker mellom autofagi og p53. I foreliggende studie fokuserte vi på skjebnen til autophagic kreftceller i respons til en DNA-skader middel under forskjellige p53 status. Først, viser vi at flere tykktarmskreftcellelinjer, inkludert p53 villtype og mutert p53 /knockout humane tarmkreftceller, utstillings morfologiske og biokjemiske egenskaper karakteristisk for celler som gjennomgår autophagy etter behandling med DNA-ødeleggende medikament topotecan. Videre blokkering av autofagi av uttømming av Atg5 eller beclin en av RNA interferens eller klorokin behandling, men som lindres cytotoksisitet av topotekan til kreftceller med mutert p53 eller p53 knockout. Som vi kjent, bør topotekan ikke bare gjøre DNA-skader, men også arrestere celler til G1 /S arrest eller G2 /M arrest avhengig av forskjellige cellelinjer. For å undersøke om cellesyklus arrest er nok til å indusere forsterkes celledød etter hemming autofagi, brukte vi vinkristin (VCR) som en annen type anti-kreft narkotika for å bekrefte våre funn. VCR binder seg til tubulindimerer, hemme montering av mikrotubulidynamikk strukturer. Forstyrrelse av mikrotubuli arrestasjoner mitose i metafase. I vår studie, som sammenligner med VCR behandling bare, sammen med autofagi hemmer gjør ingen stor forskjell på tykktarmskreftceller uansett status for p53 (Fig. S7). Resultatene antydet at topotecan-mediert celledød og cytobeskyttende autofagi kan være assosiert med DNA-skade i tykktarmskreftceller. Våre tidligere undersøkelser har vist at autofagi bidrar til celledød i CNE2 celler med mutert p53 og Hep3B celler, som er p53 mangelfull [46], [47], [48]. Selv om det virker fornuftig å se p53 for sine proapoptotiske aktiviteter, vi viste at forlengelse av celleoverlevelse gjennom autofagi induksjon var også et iboende trekk av villtype p53. En slik cytobeskyttende funksjon kan være knyttet til rollen av villtype p53 og autophagy i å opprettholde metabolsk homeostase intracellulært. Men noen kreftceller med mutert p53 eller p53 knockout mistet denne prosurvival trekk ved autofagi. Faktisk kan blokkering av autofagi fremme kreft celledød i disse forholdene. Våre funn ble med et økende antall eksempler hva er funksjonen av autofagi i kreftbehandling og hva avgjør skjebnen til autophagic kreftceller.
De mekanismer der villtype p53 induserer cytoprotective autofagi ser ut til å først og fremst oppstå fra transkripsjons kontroll av mTOR pathway regulatorer. Faktisk flere p53 målgener som AMPK, TSC2, og PTEN, er alle kjente negative regulatorer av mTORC1. Bemerkelsesverdig, to p53 målgener, sestrin1 og sestrin2, har blitt identifisert som en kritisk kobling mellom p53-aktivering og mTORC1 aktivitet [31], [49], [50]. På bakgrunn av dette, vi hypoteser om at villtype p53 og dens mål, sestrin 2, kunne aktivere AMPK, hemmer mTORC1 og fremme celle overlevelse ved å muliggjøre en cytoprotective autofagi i respons til topotekan. Basert på data vist i denne studien, synes denne hypotesen riktig. Men to kjente AMPK aktivatorer, LKB1 og CaMKKβ, var ikke ansvarlig for topotekanindusert aktivering av AMPK og den resulterende autofagi. Som forventet ble AMPK aktivering og fosfor-p70S6K hemming ikke observert etter topotekanbehandling i p53 mutante celler (Fig. S8). Videre våre data viser at inhiberingen av AMPK økt cellulær følsomhet til topotekanbehandling i p53 villtype kreftceller, men ikke på p53-mutante celler. Våre resultater tyder på at i vill-type p53 kolon kreftceller, men ikke muterte p53-celler, aktiverte p53-AMPK tjener som en sentral formidler i induksjon av cytobeskyttende autophagy i respons til DNA-skade.
Sammen utgjør skjebnen til autophagic kreftceller skiller sannsynlig blant celler med forskjellig p53 status. I tilfelle av kreftceller med vill-type p53, p53 fremmer overlevelsen faktor AMPK. Som et resultat, kan aktiv AMPK fremme autofagi for å beskytte cancerceller for å motvirke cytotoksisiteten forårsaket av DNA-ødeleggende middel. Omvendt, p53 mutant eller tap kan ikke aktivere AMPK, men kan fremme andre «stress aktivert protein kinase» som c-Jun NH2-terminal kinaser, tvinge en høy autofagi priser, og til slutt føre til autophagic celledød. Videre bekrefter vi at hemming av autofagi sensitivisert tykktarm kreft celler med villtype p53, som i motsetning hemmet antitumor effekt på de med p53 knockout til DNA-skader behandling vivo. Derfor vår studie gitt en potensiell behandlingsstrategi hvor kombinasjonen av DNA-skade midler med autofagi inhibitor ble anvendt i kreftceller med vill-type p53 er imidlertid kombinasjonen av DNA-ødeleggende medikamenter og Autophagy induktorer kan bli bygget inn i en nyttig strategi for å behandle kreft uttrykker mutant p53 eller p53 knockout.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien og eksperimentelle protokoller ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Sun Yat- Sen University med lisensnummer 11002A.
Cell Culture
HCT116, LS174-T, SW480, SW620 og HT29 celler ble dyrket i DMEM medium supplert med 10% FBS (varme inaktivert ved 56 ° C i 30 min), og de passende mengder av penicillin og streptomycin i en 37 ° C inkubator med en fuktig 5% CO
2 atmosfære. Den HCT116 p53
– /- cellelinjen ble vennlig levert av professor Jing Xuan Pan (Sun-Yat Sen University, Kina)
konfokalmikroskopi og Indirekte immunfluorescens
Cellene var. transient transfektert med en gul fluoriserende protein (YFP) -tagged LC3 ekspresjonsvektor hjelp Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019). Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med topotecan. Etter en 24 timer topotekanbehandling, ble cellene fiksert med 4% paraformaldehyde og undersøkt under en laserskanning confocal mikroskop (Olympus, FV-1000).
RNA interferens
Cellene ble transfektert
