Abstract
Bakgrunn
I de siste tiårene har en god del studier gitt muligheten for sirkulerende microRNAs (mirnas) som ikke-invasive biomarkører for kreftdiagnose. Målet med vår studie var å påvise nivåer av sirkulerende mirnas i vev og plasma av magekreft (GC) pasienter og evaluere diagnostisk verdi.
Metoder
Vevsprøver ble samlet inn fra 85 GC pasienter. Plasmaprøver ble samlet inn fra 285 GC pasienter og 285 matchede kontroller. Forskjellig uttrykt mirnas ble filtrert med av Agilent menneskelige miRNA microarray og TaqMan lav tetthet array (TLDA) med samleprøver, etterfulgt av den kvantitative revers transkripsjon polymerase chain reaction (QRT-PCR) validering. Receiver Operating karakteristiske (ROC) kurver ble strukturert for å evaluere den diagnostiske nøyaktigheten av miRNAs. Plasmanivået av MIR-26a i GC pasienter av ulike kliniske faser ble sammenlignet.
Resultater
Fire mirnas (MIR-26a, MIR-142-3p, MIR-148a, og speil 195) viste tilfeldigvis reduserte nivåer i vev og plasma av GC pasienter sammenlignet med kontroller, og ROC-kurver ble konstruert for å vise at MIR-26a hadde en høyeste område under ROC-kurven (AUC) på 0,882. Videre MIR-26a ble stabilt påvist i plasma hos GC pasienter med ulike kliniske kjennetegn.
Konklusjon
Plasma MIR-26a kan gi en ny og stabil markør for magekreft.
Citation: Qiu X, Zhang J, Shi W, Liu S, Kang M, Chu H, et al. (2016) Sirkulasjons mikroRNA-26a i plasma og dets potensial diagnostisk verdi i magekreft. PLoS ONE 11 (3): e0151345. doi: 10,1371 /journal.pone.0151345
Redaktør: Zheng Li, Peking Union Medical College Hospital, KINA
mottatt: 29 oktober 2015; Godkjent: 08.02.2016; Publisert: 24 mars 2016
Copyright: © 2016 Qiu et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble delvis støttet av National Natural Science Foundation of China (81230068, 81373091, 81302502, 81302490, og 81473049), Science Foundation i Jiangsu-provinsen Natural (BK2012842 og BK20130641), Key Program for grunnforskning av Jiangsu Provincial Department of Education (12KJA330002), Specialized forskningsfond for doktorgradsutdanning av høyere utdanning i Kina (20130092120063), Jiangsu Provincial treningsprogrammer for innovasjon og entreprenørskap for Studenter (201412682004Y ), Jiangsu-provinsen Science and Technology Innovation team, og Priority Academic Program Utvikling av Jiangsu høgskolerådet (Public Health og forebyggende medisin)
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er en av de vanligste kreftformen i verden. Selv om den generelle forekomsten har gått ned i de siste årene, er det den fjerde vanligste kreftformen (989,000 tilfeller) og den nest største årsaken til kreft-dødsfall (738,000 dødsfall) over hele verden [1]. Mer enn 70% av tilfellene oppstår i utviklingsland [2]. Spesielt avansert stadium pasientene fortsatt demonstrere ekstremt dårlig overlevelse [3] .For dato, er diagnostisering av GC basert på kliniske symptomer, og det er noen testteknikker brukt som endoskopi, og barium måltid undersøkelse. Men alle disse metodene har vist noen feil ved deteksjon av GC. I tillegg er det noen serum tumormarkører for eksempel karsinoembryonisk antigen (CEA), karbohydrat antigen 19-9 (CA19-9) og karbohydratantigenet 72-4 (CA72-4), og det er noen begrensninger av sensitivitet og spesifisitet for GC screening [4]. Derfor betaler vi mer oppmerksomhet på å oppdage roman, pålitelig og ikke-invasiv biomarkører i GC.
microRNAs (mirnas) er en klasse av kort (20 ~ 25 nukleotider), ikke-kodende enkeltrådet RNA [5]. Det er allment antatt at mirnas kan delta i å regulere genuttrykket, gir opphav til mRNA stanse som mål cleavage, translasjonsforskning hemming, og mRNA forfall [6]. Samle bevis har indikert at mirnas var involvert i flere patofysiologiske prosesser og føre til grunnleggende endringer i flere sykdommer. Zhang
et al
. funnet at MIR-26a indusert endotel-apoptose og indikerte et terapeutisk potensial på MIR-26a for aterosklerose forbundet med apoptotisk celledød [7]. Leonov
et al
. beskrevet hemming av MIR-132 resulterte i høy
AGO2
uttrykk, som var involvert i angiogenese og betennelse under primær endotelceller aktivering [8]. Tallrike studier har indikert at de mirnas spille uunnværlige roller på tumorigenesis, opptrer enten som onkogener eller tumorsuppressorgener [9]. Flere mirnas har rapportert å være relatert til kreft av miRNA uttrykket profiler [10-12]. Dessverre, vevsprøver er vanskelig å skaffe. Oppdager mirnas i vev er ikke realistisk i klinisk anvendelse.
Dessuten har økende bevis vist at sirkulerende mirnas er resistente mot RNase fordøyelsen og stabilt påvises i plasma og serum med enkle målinger [13-14]. Tidligere studier har bekreftet at eksistensen av mirnas i blod og uttrykket assosiert med kreft, inkludert stor B-celle lymfom, tykktarmskreft, blærekreft og brystkreft [15-18]. Disse studiene gir samlet et grunnlag for sirkulering mirnas som virker som nye biomarkører for kreft screening.
Mange studier viser at ekspresjonsnivået av miRNA i plasma ikke er helt lik den i svulsten. MIR-378 ble betydelig redusert i GC vev og flere cellelinjer [19], men MIR-378 var menings oppregulert i GC pasientenes serum [20]. Som det samme som MIR-486, MIR-486 kan fungere som en tumor-suppressor miRNA i magetumor [21], som ble overuttrykt i GC pasientenes serum [22]. På det nåværende, kan flere serum /plasma mirnas skille fra GC pasienter med kontrollene, likevel dette kan ikke representere miRNA uttrykket i vev. Hvis vi kan finne ut mirnas både forskjellig uttrykt i magekreft vev og plasma, bør den ha mer klinisk betydning.
For å finne ut om de mirnas forskjellig uttrykt både i vev og plasma, brukte vi to mikromatriser til skjerm mirnas . I de to validerings etapper, fire kandidat mirnas var signifikant nedregulert i tumorvev og plasmaprøver ved QRT-PCR. Vår studie viste at Mir-26a ble betydelig redusert stabilt i plasma av mage kreftpasienter og kunne skille mage kreftpasienter fra kontroller, med god sensitivitet og spesifisitet. Det ble spådd å være en lovende sirkulerende biomarkør av magekreft i rutinemessig klinisk diagnose.
Materialer og metoder
Studiedesign og fag
Denne studien ble godkjent av Institutional Review styret i Nanjing Medical University, og hver deltaker ga signert skriftlig informert samtykke. Alle deltakerne ble rekruttert ved Yixin Cancer Hospital, Nantong Tumor Hospital, Huai-An Først Folkets sykehus og The Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University fra mars 2006 til mai 2013 i Jiangsu-provinsen, Kina.
Svulsten vev og normalt vev (plassert 5 cm fra tumor) ble innhentet fra 55 GC pasienter som gjennomgår kirurgi og snap-frosset i flytende nitrogen. Plasmaprøver ble tatt fra 285 GC pasienter, og 285 seksual og alderstilpassede plasma fra friske individer ble oppsamlet som kontrollene. Alle pasientene ble påvist histologisk diagnose av GC ved førstegangsdiagnose, og ingen av dem hadde fått terapeutiske prosedyrer, for eksempel cellegift eller strålebehandling. Vi klassifisert svulsten scenen i samsvar med tumor-node-metastaser (TNM) staging system of the Union for International Cancer Control (UICC). De kliniske kjennetegn deltagerne er presentert i tabell 1.
En flertrinns studie ble utformet for å identifisere plasma mirnas som biomarkører for GC pasienter (fig 1). I oppdagelsen scenen, ble forskjellig uttrykt mirnas vurderes i de sammenkoblede vevsprøver fra 5 GC pasienter (S1 Table) med Agilent Menneskelig miRNA microarray (V12.0, Agilent Technology, CA, USA). Plasmaprøver fra 5 GC pasienter (S2 Table) som kjønn, alder kliniske tilstander matchet med vevsprøver og 5 friske kontroller ble utsatt for TLDA (V2.0, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) for å identifisere de forskjellig uttrykt mirnas . I opplæringsfasen, ble betydelig endret mirnas først vurderes av QRT-PCR i 50 parvise vevsprøver og 80 GC serumprøver og 80 matchede kontroller. Deretter de forskjellig uttrykt mirnas mellom vev og serum ble videre undersøkt i ytterligere 400 deltakere, som omfattet 200 GC pasienter og 200 kontroller.
RNA isolert fra plasma og vev
Blood prøvene i separate vakuum kubene ble sentrifugert ved 3000 rpm i 10 min ved 4 ° C. Vi samlet supernatanten og lagres dem ved -80 ° C. Før du starter isoleringsprosedyren, la vi til en endelig konsentrasjon på 10
-4 pmol /ul syntetisk
C
.
elegans
MIR-39 (cel-MIR-39) (Takara, Japan) til hver prøve, for å kontrollere den biologiske variasjoner. RNA ble ekstrahert fra 100 ul plasma ved hjelp av QIAGEN miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). Den totale RNA av vev ble isolert ved hjelp TRIZOL reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
Mikromatriser og QRT-PCR
Profilering ble utført ved hjelp av Agilent Menneskelig miRNA microarray (V12.0 , Agilent Technology, CA, USA) og TaqMan low-density array (V2.0, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). For total RNA isolere fra vev, ble QRT-PCR utføres ved hjelp av SYBR (R) PrimeScript ™ RT-PCR Kit (Takara Bio). En detaljert beskrivelse av de eksperimentelle protokoller avsettes i S1 data.
Statistiske analyser
De sammenkoblede vevsprøver ble sammenliknet med en Wilcoxon rank sum test. Ikke-parametriske Mann-Whitney U-test ble utført for å bestemme signifikans i plasmanivåer mellom miRNA kreft gruppen og friske gruppe. Mottaker-operatør karakteristiske (ROC-kurver) og arealet under ROC-kurver (AUC) ble oppnådd for å bedømme GC påvisning av potensiell miRNAs. Statistiske analyser ble tosidig test, og
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle de statistiske analysene ble utført med SPSS programvareversjon 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Resultater
Funn av kandidat biomarkører ved mikromatriser
Vi brukte to microarray plattformer for mirnas å analysere og sammenligne miRNA uttrykk mønstre fra to forskjellige forhold. TLDA analyse ble gjennomført for å bekrefte kandidatens mirnas uttrykk nivåer. Totalt 142 miRNAs ble påvist i plasma. 65 av de totale miRNAs ble økt og 77 ble redusert i GC pasienter sammenlignet med kontroller
For å identifisere kandidat mirnas, uttrykk for miRNAs mellom pasienter og kontroller var nødvendig å korrespondere med to kriterier: (1). Uttrykket deregulering i tumorvev var i overensstemmelse med TLDA utfall [23]; og (2) plasma miRNA nivåer beviser ≥ 2 ganger forskjell mellom pasienter og kontroller. Til syvende og sist, fire nedregulert plasma mirnas (dvs. MIR-26a, MIR-142-3p, MIR-148a og MIR-195) ble valgt som kandidater til knyttneve-scenen validering (tabell 2).
bekreftelse av miRNAs av QRT-PCR
for det første ble resultatene av mikromatriser analyser bekreftet ved hjelp av de parede vev, GC plasma og matchet kontroller for disse fire mirnas ved QRT-PCR. Våre resultater viste at tendensen av resultatene av QRT-PCR var lik den mikromatriser analyser, enten i vev eller i plasma. Tomten viste at uttrykket nivåer av fire mirnas var statistisk signifikant i GC vev (
P
= 0,001,
P
= 0,002,
P
0,001 og
P
= 0,003 for MIR-26a, MIR-142-3p, MIR-148a og MIR-195, henholdsvis figurene 2A-2D). I mellomtiden, utførte vi QRT-PCR for å verifisere uttrykk for miRNAs ble nedregulert i en annen uavhengig sett av 80 GC plasmaprøver og 80 friske kontroller. Uttrykk for fire mirnas i GC plasma ble betydelig redusert sammenlignet med de i kontrollgruppen (alle
P
0,001, figur 2E-2 H). Uttrykkene nivåer av de fire mirnas i plasma var konsekvent redusert, sammenligner med vevsprøver.
(AD) Relative uttrykk nivåer av MIR-26a, MIR-142-3p, MIR-148a, MIR-195, i 50 parvise mage kreft vev og tilhørende noncancerous vev (log
10 skala på Y-aksen). (E-H) Plasma uttrykk nivåer av MIR-26a, MIR-142-3p, MIR-148a, MIR-195, i 80 GC pasienter og 80 friske kontroller. Linjene inne i boksene betegne medianer (log
10 skala på Y-aksen). Værhårene av boksplott. Min til Max
Storskala validering av plasma microRNAs i GC pasienter
For å validere stabiliteten av plasma uttrykk for mirnas, vi utførte QRT-PCR i en stor skala på 200 GC plasmaprøver og 200 passet kreft-frie kontroller. Accordant med resultatene av treningsfasen, er ekspresjonsnivåene av fire mirnas viste en betydelig nedregulering i plasma av GC pasienter (alle
P
0,001, figur 3), hvilket antyder at disse fire mirnas i plasma kan tjene som kandidat biomarkører for diagnostisering av GC.
Boksplott plott~~POS=HEADCOMP viste plasmanivået av MIR-26a (A), MIR-142-3p (B), MIR-148a (C) og Mir-195 ( D) i 200 magekreftpasienter og 200 alders- og kjønnstilpassede friske kontroller. Y-aksen representerer relative uttrykk for miRNAs normalisert til cel-MIR-39 (Log
10 relative nivå).
Evaluering av diagnostiske potensialet mirnas for GC
Å vurdere effektiviteten av ovennevnte fire mirnas som diagnostiske markører for GC deteksjon, utførte vi ROC kurve analyse på hver miRNA. Figur 4 viser at ROC kurver av fire kandidat mirnas demonstrerte plasma mirnas var av verdi å skille GC pasienter fra normale kontroller. Den grenseverdi på 0,651 var lik sensitivitet + spesifisitet-1 som var maksimal etter MIR-26a (relativ ekspresjon normalisert ved celle-39). For MIR-26a, var sensitiviteten 83,6% og spesifisiteten var 81,5% med en AUC på 0,882 (95% KI = 0,847 til 0,916) (figur 4A). Ved cut-off-verdi på 0,585 for MIR-142-3p, sensitiviteten var 74,4% og spesifisiteten var 84,1% med en AUC på 0,839 (95% CI = 0,800 til 0,879) (figur 4B). AUC var 0,842 (95% KI = 0,803 til 0,882) og 0,765 (95% KI = 0,717 til 0,812) for MIR-148a og MIR-195, henholdsvis. Sensitiviteten og spesifisiteten var 75,4% og 83,1% for MIR-148a, 69,2% og 75,4% for MIR-195, respektivt (figur 4C og 4D). Kombinasjonen ROC kurven analyse ga AUC verdien av 0,872 (95% KI = 0,836 til 0,908) (figur 4E).
ROC kurver ble konstruert for å vise AUC for Mir-26a (A), MIR-142- 3p (B), MIR-148a (C), MIR-195 (D) og kombinasjonen av fire mirnas (E).
for å bekrefte diagnosen verdien av verts miRNA for GC, vi kombineres en hvilken som helst av plasma mirnas og utført ROC-kurver som er vist på S1 og S2 fig. Disse data indikerte at MIR-26a som viste størst evne til å differensiere GC pasienter fra kontroller, kan fungere som et egnet biomarkør for påvisning av GC.
Diskusjoner
Til tross for en betydelig nedgang i GC dødelighet i det siste tiåret, er dødeligheten fortsatt høyere enn mange andre vanlige kreftformer [24]. I de senere år har kreft biomarkører for eksempel CEA, CA19-9, CA74-2 med begrenset sensitivitet og spesifisitet blitt mye brukt for diagnose, overvåking og prognose av GC [4]. Alt i alt, det er av stor betydning for diagnose av GC for å lete etter mer spesifikke og sensitive biomarkører.
Tissue mirnas som biomarkører for diagnose og prognose ble først foreslått. Bandres
et al
. avslørte at MIR-451 ble nedregulert i grunnskolen mage og kolorektal tumorer, og nedregulering av MIR-451 ble forbundet med lav DFS og lav total overlevelse [25]. Xiao
et al
. identifisert MIR-106a som en dramatisk oppregulert miRNA i GC [26]. De fant også at uttrykket av MIR-106a var signifikant relatert til tumor stadium, lymfatisk, fjernmetastaser og invasjon. Likevel har mange typer kreftpasienter ikke vært i stand til å gjennomgå en operasjon i klinisk praksis når de blir diagnostisert. Avhengigheten av kirurgisk seksjon og invasiv prosedyre for vevsprøve samling sterkt begrenset bruk av miRNAs i vev fra kreftdiagnose [27]. Den diagnostiske kvaliteten av disse metodene er ikke tilfredsstillende.
Emerging bevis også innebærer at sirkulerende mirnas er relatert til kreft [28-30]. Den nylig studie rapporterte at mirnas var synlig i plasma og stabile ved romtemperatur og /eller flere fryse-tineprosesser [31]. Tallrike rapporter hadde opplyst at nytten av sirkulerende mirnas som nye ikke-invasive biomarkører for kreft, for eksempel tykktarmskreft [32], brystkreft [33-34] og nyrecellekreft [35].
I vår studie, vi metodisk skjermet miRNA profilen i de sammenkoblede vev og i plasma fra GC pasienter og friske kontroller. Plasma oppnådd fra 5 tilfeller og 5 kontroller ble blandet sammen for å danne to samleprøver og ble anvendt for TLDA. Denne metoden for å samle prøver er en mye brukt teknikk som har vist seg å være pålitelig for profilering [36-38]. Sammenligning TLDA analyse og resultatet av vevet microarray ble fire mirnas (MIR-26a, MIR-142-3p, MIR-148a og MIR-195) redusert i GC valgt.
Deretter identifiserte vi fire kandidat mirnas ved QRT-PCR i to trinn, og fant uttrykket nivåer av fire mirnas falt i plasma hos GC pasienter som var i overensstemmelse med uttrykk i vev. ROC kurve, også kjent som følsomhet kurve, er anerkjent som en evalueringsmetode av diagnostisk test. Det er også en integrert indikator reflekterer sensitivitet og spesifisitet av kontinuerlige variabler. I denne studien, ROC-analyse viste at kombinasjonen av fire mirnas var ikke mer effektiv enn MIR-26a individuelt. MiR-26a alene kan oppnå en god diagnostisk effektivitet i sært GC pasienter fra friske kontroller med en AUC på 0,882 (følsomhet = 83,6% og spesifisitet = 81,5%). En tidligere studie av Schneider
et al
. vist serumnivåene av CEA, CA19-9 og CA72-4 i GC belyst en sensitivitet på 45,5% for CA19-9, 23,8% for CEA og 60,7% for CA72-4 [39]. Disse var langt mindre enn følsomheten av MIR-26a. Videre er ekspresjonsnivået av MIR-26a i plasma var signifikant lavere i de GC pasienter, og viser ikke noen betydning med progresjon av GC (S3 Fig). Derfor MIR-26a hadde stort potensiale som en diagnostisk plasma biomarkør for GC.
I de siste tiårene, gjorde tidligere studier ikke bekrefte at om miRNA uttrykket av plasma eller serum kan representere nivåene av vev. Sammenlignet med disse studiene, vår studie hadde egen funksjon på grunn av årsaker som følger. For det første valgte vi mirnas som uttrykkes differensielt både i vev og plasma, ved å sammenligne resultatene av to mikromatriser. Dette resulterte i en bedre mulighet til å identifisere mulige diagnostiske markører. Videre fant vi at MIR-26a uttrykk betydelig redusert i GC pasienter og holdt stabil i plasma (S3 figur).
Resultatene viste at plasma uttrykk for MIR-26a var betydelig lavere i GC pasienter sammenlignet med friske kontroller (
P
0,05), som viste stabilitet i GC pasienter med ulike kliniske status. Nedregulering av plasma MIR-26a uttrykk kan indikere sannsynligheten for diagnostisering av GC. Derfor kan MIR-26a være en beste valget for å tjene som potensiell biomarkør for GC. Deng
et al
. viste at MIR-26a-nivåer i GC-vev ble mer bemerkelsesverdig redusert enn de i ikke-tumorvev ved QRT-PCR [40]. De viste også at Mir-26a hemmet tumorvekst og metastase dels ved å målrette
FGF9
in vivo. Disse besto med våre resultater. Disse funnene bekreftet at miRNA-26a i plasma kan være en potensiell diagnostisk markør for GC.
Men begrensningene i vår studie er at prøvene for vevet microarray og for TLDA ikke var fra de samme pasientene, og våre utvalgsstørrelser for mikromatriser var relativt små. Videre analyse av mikromatriser for de samme pasienter og den forstørrede-prøven bekreftelse er nødvendig for å bli brukt som en ny screening-verktøy for GC i rutinemessig klinisk anvendelse. I tillegg har vi ikke velger de oppregulert mirnas på grunn av det faktum at det ikke var oppregulert mirnas som fold endringene var ≥ 2. Vi valgte kandidat mirnas som ble voldsomt uttrykk i plasma å være sikker på sannsynligheten for eksamen i klinisk praksis.
Konklusjoner
i sammendraget, vår studie avslørte fire nedregulert mirnas, MIR-148a, MIR-142-3p, MIR-26a, og MIR-195, i GC pasienter. Enda viktigere, plasma uttrykk for MIR-26a ble betydelig redusert og stabil hos pasienter med magekreft. Som et resultat, kan MIR-26a gi en ikke-invasiv og stabil biomarkør av magekreft diagnose og screening.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 data. Eksperimentelle protokoller Mikromatriser og QRT-PCR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0151345.s001 plakater (DOC)
S1 Fig. ROC kurve analyse av kombinasjonen av to mirnas blant de fire kandidat mirnas.
Kombinasjonen av MIR-26a og MIR-142-3p (A), kombinasjonen av MIR-26a og MIR-148a (B), kombinasjonen av MIR-26a og MIR-195 (C), og kombinasjonen av MIR-142-3p og MIR-148a (D), kombinasjonen av MIR-142-3p og MIR-195 (E) og kombinasjonen av speil 148a og MIR-195 (F) ga de største AUC
doi:. 10,1371 /journal.pone.0151345.s002 plakater (DOC)
S2 fig. ROC kurve analyse av kombinasjonen av tre mirnas blant de fire kandidat mirnas.
Kombinasjonen av MIR-26a, MIR-142-3p og MIR-148a (A), kombinasjonen av MIR-26a, MIR-142-3p og MIR-195 (B), kombinasjonen av MIR-26a, MIR-148a og MIR-195 (C) og kombinasjonen av MIR-142-3p, MIR-148a og MIR-195 (D) ga de største AUC.
doi: 10,1371 /journal.pone.0151345.s003 plakater (docx)
S3 fig. . plasmanivået av MIR-26a i mage kreftpasienter stratifisert ved kliniske status Boksplott
viste plasmanivået av MIR-26a i 200 friske kontroller og 200 mage kreftpasienter ved ulike kliniske status
doi:. 10,1371 /journal.pone.0151345.s004 product: (docx)
S1 Table. Kliniske karakteristika vev fag screening av Agilent Menneskelig miRNA microarray
doi:. 10,1371 /journal.pone.0151345.s005 plakater (DOC)
S2 Table. Kliniske kjennetegn ved plasma fag screening av TLDA
doi:. 10,1371 /journal.pone.0151345.s006 plakater (DOC)
Takk
Vi er dypt takknemlige for deltakelse alle fag som bidrar til denne forskningen.
