Abstract
En reduksjon i nesten femti prosent dødelighet av kreft i munnhulen er nødvendig snarest . Forbedringer i tidlig diagnose og mer effektive forebyggende behandlinger kan påvirke en slik reduksjon. Mot dette formål, vi foretok for første gang en grundig massespektrometri-baserte kvantitativ hagle proteomikk studie av ikke-invasiv innsamlede muntlige pensel biopsier. Proteiner isolert fra pensel biopsier fra normalt, friskt vev, muntlige premaligne lesjon vev (OPMLs), muntlig plateepitelkarsinom (OSCC) og matchet kontrollgruppe vev ble sammenlignet. I replikert proteomikk datasett, sto sekretoriske leukocytter proteasehemmer (SLPI) protein ut basert på sin nedgang i overflod i begge OPML og OSCC lesjon vev i forhold til normalt, friskt vev. Western blotting i flere børstet biopsiprøver bekreftet en trend med gradvis avtagende SLPI overflod mellom sunn normal og OPML vev, med en større nedgang i OSCC lesjon vev. En lignende SLPI nedgang ble observert
in vitro
sammenligne modellen OPML og OSCC cellelinjer. I tillegg ekspandert muntlig cellene i pasientens hele spytt viste et underskudd på SLPI korrelert med oral cancer progresjon. Disse resultatene, kombinert med proteomikk data indikerer en nedgang i SLPI i matchet sunn kontroll vev fra OSCC pasienter sammenlignet med vev fra normalt, friskt vev, foreslo en systemisk reduksjon av SLPI i muntlige celler korrelerte med oral cancer utvikling. Til slutt,
in-vitro
eksperimenter viste at behandling med SLPI signifikant redusert NF-kB aktivitet i en OPML cellelinje. Funnene tyder på anti-inflammatorisk aktivitet i OPML, støtter en mekanistisk rolle SLPI i OSCC progresjon og foreslå dens potensial for forebyggende behandling av utsatte munnsår. Samlet våre resultater viser for første gang potensialet for SLPI som en mekanisme-basert, non-invasiv biomarkør for kreft i munnhulen progresjon med potensial i forebyggende behandling
Citation. Yang Y, Rhodus NL, Ondrey FG, Wuertz BRK, Chen X, Zhu Y, et al. (2014) Kvantitativ proteomikk Analyse av Oral Brush Biopsi Identifiserer Sekretorisk Leukocytt proteasehemmer som en lovende, mekanismebasert Oral Cancer Biomarker. PLoS ONE 9 (4): e95389. doi: 10,1371 /journal.pone.0095389
Redaktør: John M. Koomen, Moffitt Cancer Center, USA
mottatt: 03.01.2014; Godkjent: 25 mars 2014; Publisert: 18 april 2014
Copyright: © 2014 Yang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av tilskudd 1R01DE017734 fra National Institutes of Health (US) til TJG og forsknings Grants 81000439 og 81271134 fra National Natural Science Foundation i Kina for å Y.Y. og Y.Z. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Dessverre, overlevelse for personer diagnostisert med kreft i munnhulen, hovedsakelig i form av muntlig plateepitelkarsinom (OSCC), er bare litt bedre enn 50% [1]. OSCC blir etterfulgt av forekomsten av en oral premaligne lesjoner, vanligvis leukoplaki, som forvandles til invasiv kreft i 5% til 17% av tilfellene [2], [3]. Hvis diagnosen tidlig, forebyggende behandlinger er mer effektive, øker overlevelsen til 80% eller bedre [4]. Dermed er det et stort behov for bedre måter å diagnostisere og behandle utsatte OPML og /eller tidlig stadium OSCC munnsår [2].
Invasive operasjonssåret biopsi fulgt av histopatologi er dagens gullstandard for oral kreftdiagnose [5]. Dessverre, det har mange begrensninger. Den invasiv og kostbare natur fører til mindre hyppig testing av mistenkelige lesjoner, og følgelig en forsinket diagnose av OSCC [6], [7]. En retrospektiv studie fant bare om en 14% oppfølging sats for skalpell biopsier innenfor en tre års periode [2]. I tillegg er skalpell biopsi utsatt for under-prøvetaking av lesjoner [8], [9], og dermed føre til feil i diagnosen.
Gitt disse begrensningene skalpell biopsi, mye oppmerksomhet har blitt gitt til å identifisere molekylære biomarkører veiledende av sykdom i en ikke-invasiv innsamlede pasientprøver [10]. En lovende ikke-invasiv utvalgsmetode er bruken av børste biopsier [11], [12]. Her blir en forholdsvis stiv børste brukes til å forsiktig samle inn en prøve av trans-epitelceller direkte fra munn lesjon, eller tilpasset oral mucosa. Denne samlingen er enkel og billig, med minimalt ubehag for pasienten. Viktigst av alt gir en potensielt informasjonsrikt prøvetaking av celler direkte fra lesjon som kan bli ytterligere analysert [11], [12].
For å utvikle ikke-invasiv innsamlede molekylære biomarkører fra pensel biopsier, lovende kandidatmolekyler innenfor disse prøvene må først bli identifisert. Storskala teknologier for molekylær profilering (f.eks genomikk, proteomikk) kan identifisere slike kandidater. Spesielt kan analyse ved hjelp av massespektrometri baserte proteomforskning gir ikke bare fører videre handlingsprotein biomarkører fra disse prøver, men også underliggende kunnskap om kreft progresjons mekanismer og mulige mål for behandling. Imidlertid har proteomikk analyse av muntlige pensel biopsier via MS-baserte proteomikk sett begrenset oppmerksomhet [13], [14], spesielt ved hjelp av de mest moderne teknologier i feltet. Til dags dato har ingen søkt kvantitative hagle MS-baserte proteomikk, uten tvil den mest allsidige og dyptgående metode for å karakterisere proteom [15], til oral børste biopsi analyse.
I denne studien har vi brukt kvantitativ hagle MS-baserte proteomics til analyse av børste biopsier oppsamlet fra friske, normale vev, OPML- og OSCC. Blant en rekke replikert proteiner som viser overflod forskjeller, viste den sekretoriske leukocytter proteasehemmer (SLPI) protein dramatisk nedgang i forhold til normalt vev korrelerte med trinnene til munnhulekreft progresjon. Dette reduserte overflod av SLPI ble bekreftet via western blotting i pensel biopsiprøver, og ble også observert i ekspandert celler i hele spytt fra OPML og OSCC pasienter. I samsvar med pasientresultater, modell cellelinjer OPML og OSCC viste også en nedgang i SLPI. I tillegg er behandling av en modell OPML- cellelinje med SLPI viste en inhibering av NF-kB aktivitet, en transkripsjonsfaktor kjent for å spille en rolle i inflammatoriske mekanismene bak munnkreftutvikling. Samlet våre resultater viser for første gang et progressivt tap av SLPI overflod i overgangen fra OPML til OSCC, og foreslå en ny rolle for SLPI som en mekanisme bundet, non-invasiv biomarkør for kreft i munnhulen, med potensial som en OPML behandling agent.
Materialer og metoder
Pasienter og Prøvene
undersøkelsen ble gjort med informert skriftlig samtykke fra alle prøve givere benytter et menneske protokoll godkjent av Institutional Review Board på University of Minnesota (IRB studie nummer 0001M34501). Alle spytt samlingene ble gjort uten stimulering via passiv siklende, i løpet av dagen mellom klokken 09:00 og 05:00. Hele spytt og pensel biopsier ble samlet fra 11 pasienter diagnostisert med en dysplastic OPML og 11 pasienter med OSCC ved University of Minnesota Øre klinikken. For hver pasient, ble spyttprøver først samlet inn, etterfulgt av samling av børste biopsier fra lesjonen og sunn slimhinnene i tilsvarende motsatt område, ved hjelp av Rovers Orcellex børster (Rovers Medical Devices B.V., Nederland). Brush biopsier fra munnslimhinnen, og hele spytt ble også samlet inn fra 10 friske frivillige. De friske frivillige hadde ingen store risikofaktorer for OSCC (ikke-røykere, moderat til lav bruk alkohol) og var fri for munnsår. Umiddelbart etter innsamling, Prøvene ble lagret ved -20 ° C, og deretter overført til -70 ° C inntil bruk. Videre informasjon om tobakk og alkoholbruk av pasientene ble samlet inn. Karakteristikken av studiepopulasjonen er oppsummert i tabell S1.
Cellelinjer
MSK Leuk1 celler [16], vokst fra munnslimhinnen som grenser til muntlig leukoplakimateriale lesjoner, var en gave fra Dr. Peter Poser, New York University. MSK Leuk1 celler ble dyrket i KGM-2 medium (Lonza Walkersville, MD) supplementert med bovint hypofyseekstrakt, rekombinant, human epidermal vekstfaktor, rekombinant humant insulin, hydrokortison, adrenalin, og transferrin ved 37 ° C i 5% CO
2 .
forvandlet humane epidermale keratinocytter (Rhek) udødeliggjort av Ad 12-SV40 virus [17] ble oppnådd fra Dr. Jhong S. Rhim ved National Cancer Institute, (Frederick, MD). Den OSCC cellelinje CA-9-22 [18], var en gave fra Toshio Kuroki, MD. Celler ble holdt i Eagles minimale essensielle medium supplert med 10% føtalt bovint serum, L-glutamin (5,8 mg /ml), og penicillin /streptomycin (50 ug /ml) ved 37 ° C i 5% CO
2 som adherent monolagskulturer.
Børstet Biopsi Prøvepreparering
For MS-baserte proteomikk funn studier og vestlige blot valideringsstudier, børste biopsiprøver fra fagene som faller i de to gruppene var forberedt identisk. For å maksimere utvinningen av peptider og minimalisere prøvehåndtering trinn anvendt en «on-børste» fordøyelse metode for å fremstille et peptid-løsning for MS-baserte proteomforskning analyse (se figur 1A i resultater avsnitt). Børstehodet ble neddykket og lysert i 50 mM Tris pH 8,0 med 2% SDS ved 95 ° C i 10 minutter med periodevis risting. Celleavfall ble fjernet ved sentrifugering ved 16 100 x g, og utvinning av supernatanten til en ren mikrosentrifugerør. Protein recovery ble målt ved anvendelse av BCA-analyse (Thermo Scientific). De utvunnede proteiner ble så spaltet og bearbeidet for senere massespektrometrianalyse eller brukes for western blot validering.
A. Pensle biopsi innsamling og prøveopparbeidelse protokollen. B. Eksperimentell design for kvantitative MS-baserte proteomikk eksperimenter. Ett eksperiment brukes matchet vev fra OPML pasienter, mens det andre eksperimentet brukt matchet vev fra OSCC pasienter.
isobariske Peptide Tagging og Prøvepreparering
Proteiner fra børstet celler ble redusert i DTT for 1 time ved 55 ° C og trypsin spaltet ved hjelp av en modifisert protokoll FASP [19]. Jodacetamid ble benyttet som cystein alkyleringsreagens. De resulterende peptider ble avsaltet ved fast-fase ekstraksjon patroner (tC18 Sep-Pak, Waters). Peptidene ble deretter oppløst i en produsent medfølgende buffer og merket med iTRAQ reagens (Applied Biosystems) ved romtemperatur i 1 time og avsaltet med Sep-Pak patron.
Prøvene ble fraksjonert ved siden av off-line semipreparativ HPLC. De kombinerte, iTRAQ-merkede peptider ble resuspendert i buffer A (10 mM ammoniumformiat pH 10 i 98:2 vann: acetonitril) og fraksjonert frakoblet ved høy pH, C18 revers fase (RP) kromatografi [20]. En MAGIC 2002 HPLC (Michrom bioressurser, Inc., Auburn, CA) ble anvendt med en C18 Gemini-NX-kolonne, 150 mm x 2 mm indre diameter, 5 um partikkel, 110 Å porestørrelse (Phenomenex, Torrence, CA). Buffer A var 10 mM ammoniumformiat, pH 10 i 98:2 vann: acetonitril og buffer B var 10 mM ammoniumformiat, pH 10 i 10:90 vann: acetonitril. Strømningshastigheten var 150 mL /min. med en gradient 0-35% buffer B i løpet av 60 min., etterfulgt av 35-60% i løpet av 5 min. Fraksjoner ble oppsamlet hvert 2. minutt og UV-absorbans ble overvåket ved 215 nm og 280 nm. Peptid-inneholdende fraksjoner ble delt i to like nummererte grupper, «tidlig» og «sen». Den første «tidlig» fraksjon ble slått sammen med den første «sent» fraksjon, og så videre. Sammenkjedede prøver ble tørket i vakuum, resuspendert i lastløsningsmiddel (98:2:0.01, vann: acetonitril: maursyre). Forut for massespektrometrisk analyse
Massespektrometrisk analyse
En lineær ionefelle -Orbitrap (LTQ-Orbitrap) Velos instrument (Thermo Fisher Scientific) [21] ble brukt for massespektrometri. Instrumentet ble operert i en topp-ti dataavhengig modus ansette undersøkelsen skanninger på 30.000 oppløsning 300-1800 m /z. Tandem MS (MS /MS) skanner ble kjøpt med en isolasjonsbredde 2 m /z og høyere energi collisional dissosiasjon (HCD) fragmentering modus. 40% normaliserte kollisjonsenergien ble brukt sammen med en 20 millisekunders varighet. De automatiske forsterkningskontrollinnstillingene var 3 × 10
5 ioner i ionefelle og 1 x 10
6 i Orbitrap. Dynamisk utelukkelse ble brukt med varighet på 15 sekunder og gjenta telling av 1.
Protein identifikasjon og kvantifisering
RAW-filer konvertert til mzXml hjelp msconvert (distribuert som en del av ProteoWizard 1.6.1260) . MS /MS spektra ble søkt mot Uniprot menneskelig database inkludert egge sekvenser og felles forurensende proteiner (totalt 136,002 oppføringer) ved hjelp Sequest v27.0. Søke parametere inkludert en 1,6 amu (atommasseenhet) forløper og 0,8 amu fragment masse toleranse, to savnet skillelinjer, delvis trypsin spesifisitet, faste modifikasjoner av carbamidomethylated cystein, iTRAQ reagent modifikasjon på lysines og N-termini, og variabel modifisering av metionin oksidasjon. Søkeresultater ble filtrert til 99% protein sannsynlighet og 95% peptid sannsynlighet i Stillas (v3.3.1, Proteome programvare), produsere en falsk funnrate på 1%. Proteiner ble kvantifisert ved hjelp av tilpasset programvare utviklet in-house [22]. Bare proteiner identifisert fra to eller flere MS /MS-spektra stemmer overens med peptidene ble vurdert for kvantitativ analyse. P-verdier ble tilordnet til hvert protein kvantifiseres ved tre eller flere MS /MS-spektra, slik som beskrevet [22]. Tabell S2 viser all informasjon som for proteiner identifisert og kvantifisert i disse forsøkene.
western blotting eksperimenter
For western blotting eksperimenter, et uavhengig sett av prøver ble anvendt på grunn av mangel av prøvemateriale fra den innledende prøvesett som brukes i MS-baserte proteomikk eksperimenter. Tretti mikrogram (ug) av børsten biopsi protein fra hver enkelt gjenstand analysert i valideringsforsøk, eller femti ug protein fra cellelysater av cellelinjer, sammen med tretti ug positiv kontroll-protein, ble separert ved 12% SDS-PAGE. Proteiner ble så overført til en PVDF-membran (Millipore), og probet med polyklonalt kanin-anti-SLPI-antistoff (1:250; Abcam ab46763). Blottene ble merket med pepperrot-peroksidase-konjugerte sekundære antistoffer (1:10,000) og visualisert med et ECL-deteksjonssystem (Thermo Scientific).
I tilfelle av hele spytt, ustimulerte Prøver ble tatt fra et uavhengig sett av fag (4 friske frivillige, 5 pasienter med OPML og 5 pasienter med primær OSCC). Hele spytt ble sentrifugert ved 3000 x g ved 4 ° C, supernatanten som inneholdt den løselige fraksjon av spytt-proteiner ble oppsamlet, og cellepelletene ble vasket med PBS og lysert for å oppnå cellulære proteiner. Totalt protein ble kvantifisert ved hjelp av BCA assay (Thermo Pierce).
reportergenet Analyser
De cellelinjer ble platet med 50.000 celler /brønn i 12 brønners plater og forbigående kotransfektert via transitt Express reagens (MirusBio, Madison, WI) med en pIgκB-Luc reportergen plasmid 24 timer senere sammen med en pCMV Lac-Z reporter inneholdende CMV-promoteren og Lac-Z-genet i pcDNA3 for å justere for transfeksjonseffektivitet. Den pIgκB-Luc reporter konstruere inneholder tre immunglobulin G-κ kjeden NF-kB bindingsseter som driver luciferase genet og ble vennlig levert til oss av Dr. K. Brown (NIAID, NIH). Etter over natten transfeksjon, ble cellene behandlet med rekombinant humant SLPI (R 2 ganger) i vår studie. Interessant, bare tre av disse proteinene viste overflod endringer både vevstyper (OPML og OSCC) sammenlignet med sunn normal (fet tekst i tabell 1).
Av disse proteinene er vist i tabell 1, den Sekretorisk leukocytt proteasehemmer (SLPI), skilte seg ut basert på sin store nedgangen i både OPML og OSCC vev sammenlignet med friske normale (19,5 og 12,4 gjennomsnittlig overflod nedgang for OPML og OSCC vev, henholdsvis). Basert på disse funnene, og den kjente rollen SLPI som en proteasehemmer med forbindelser til munnhulekreft [26], valgte vi å ytterligere bekrefte og undersøke dette proteinet. For å oppnå dette må vi først videre avhørt de kvantitative proteomikk data på SLPI. Av notatet var resultatene fra den andre iTRAQ eksperiment som inkluderte matchet OSCC sunn kontroll vev. Resultatene viste at det ikke bare var SLPI ble redusert i OSCC lesjonen vev sammenlignet med friske normaler, men også den ble redusert i den samsvarende friskt vev sammenlignet med friske normale vev (figur 2). En relativt liten nedgang ble også observert i den første iTRAQ eksperiment mellom matchet vev fra OPML pasienter og friske normalt vev (Tabell S2).
Validating Cancer Progresjon-avhengige SLPI Overflod Dynamics i selvstendige Samples
for å validere den observerte overflod nedgang på SLPI i både OPML og OSCC vev, vi først forfulgt semi-kvantitative vestlige blotting eksperimenter i flere pensel biopsiprøver. Som vist i figur 3A, er Western blot bekreftet MS baserte resultater, som SLPI overflod viste en gradvis reduksjon mellom friskt normalt vev og OPML- vev, med en mer dramatisk reduksjon i OSCC vev. Figur S1 viser lasting kontrollresultatene via totale protein farging av membraner som brukes for resultatene vist i Figur 3. I tillegg samlet vi un-stimulert hele spyttprøver fra de samme pasientene som samtykket til å børste biopsier. Vi har isolert eksfolierte celler i disse prøvene via sentrifugering og probet de isolerte proteiner for SLPI etter cellelyse. Resultatene viste en lignende trend i overflod nedgang på SLPI mellom sunne normalt vev og både OPML og OSCC vev (Figur 3B). Analyse av de oppløselige proteiner som finnes i spytt supernatantene viste en mindre konsistent tendens (data ikke vist).
A. Verifikasjon av redusert SLPI i vev som er samlet med pensel biopsi. B. SLPI overflod nivåer målt i ekspandert celler fra hele spytt. C. SLPI overflod nivåer målt i modellen cellelinjer. Positiv kontroll er en normal sunn menneskelig spyttprøve; Rhek celler er fra en normal epitel cellelinje, er MSK en modell OPML cellelinje (MSK-Leuk1) og CA9-22 er en modell OSCC cellelinje.
Vi har også testet overflod av SLPI protein i modellen OPML og OSCC cellelinjer (figur 3C). Her har vi valgt å sammenligne oppløselige proteiner isolert fra helcellelysater fra kontroll RHEK celler, MSK-leuk1 celler (en modell cellelinje av OPML- [27]), og Ca9-22 celler (en modell cellelinje av OSCC [28]). I likhet med resultatene fra de pasientpensel biopsier, observerte vi en dramatisk nedgang i SLPI i MSK-leuk1 og Ca9-22 cellelinjer sammenlignet med friske kontrollceller.
Testing Potensielle Anti-inflammatoriske effekter av SLPI Behandling på OPMLs
rollen til NF-kB-aktivering og regulering av proinflammatoriske faktorer i mekanismen bak overgang fra OPML- til OSCC er velkjent [29], [30], [31]. Bevis eksisterer som viser at SLPI hemmer NF-kB [32], [33], selv om dette ikke har blitt vist i modeller av kreft i munnhulen. Gitt dette beviset, søkte vi å undersøke hvorvidt SLPI reduserer NF-kB aktivitet i MSK-Leuk1 celler, ved hjelp av et luciferase-baserte reporter analysen [34]. Vi har behandlet de transfekterte MSK Leuk1 celler med to forskjellige konsentrasjoner av ren SLPI peptid (20 pg /ml og 40 pg /ml), og målte NF-kB på forskjellige tidspunkter etter behandling (figur 4). Resultater for begge behandlinger var sammenlignbare, med både som viser omtrent en 40% nedgang i NF-kB etter 24 timers behandling SLPI. Behandling med en lavere mengde av SLPI (10 ug /ml) viste en mindre og mindre pålitelig reduksjon av NF-kB aktivitet (data ikke vist).
Fold-forandring av en NF-kB-rapportørgenet analysen i forhold til kjøretøykontroll er plottet ved ulike tidspunkt etter behandling.
Diskusjoner
Vi har gjennomført en første-av-sitt-slag, grundig kvantitativ hagle proteomikk analyse av ikke-invasiv innsamlede muntlige børste biopsiprøver, som søker å identifisere protein overflod endringer knyttet til munnhulekreft progresjon. Brush biopsier er godt kjent for sin verdi som en ikke-invasiv samlet celleprøve for oral cancer diagnostika [11], [12]. Imidlertid har MS-baserte proteomikk studier som utnytter disse potensielt informasjonsrike prøvene vært begrenset. Spesielt Driemel et al [13] brukes overflaten forbedret laser desorpsjon /ionisering (SELDI) MS å kvantitativt profil børste biopsiprøver og identifisere potensielle biomarkører for progresjon. Remmerbach et al [14] benyttes flere standard MALDI-MS for å analysere proteiner isolert fra pensel biopsier i tillegg. Selv om disse studiene hatt noen suksess, er begrenset til et delsett av forholdsvis små proteiner og /eller peptider i prøvene av interesse ved bruk av en SELDI eller MALDI-baserte metoder for kompleks blanding.
MS-baserte hagle proteomforskning på den annen side tilbyr et utvidet syn på børsten biopsi proteom, gitt sin evne til å identifisere og kvantifisere proteiner av alle molekylvektklasser [15]. Vår studie gir den første demonstrasjonen av hagle proteomikk brukes til muntlige børste biopsiprøver. Et spørsmål i begynnelsen av denne studien var om cellene innsamlet via pensel biopsi ville gi god total protein for en storstilt proteomikk analyse. Vi har funnet at en på-børste cellelyse måten bedre utbytte (i hvert fall titalls mikrogram av totalt protein) enn å forsøke å vaske cellene fri for børsten før lysis (data ikke vist). Våre funn bør åpne for ytterligere hagle proteomikk analyser av børste biopsier for karakterisering av munnsår i ulike sammenhenger.
Våre gjentatte analyser sammenligne sunt normalt vev til OPML og OSCC vev, samt matchet kontroller, avdekket en rekke interessante proteiner som viser endringer i overflod. Selv om andre kandidater verdig ytterligere validering ble identifisert, valgte vi å fokusere på SLPI, gitt sin store og reproduserbar reduksjon i overflod i begge OPML og OSCC vev i forhold til normalt, friskt vev. Forskere har tradisjonelt anerkjent rolle SLPI i inhibering av serinproteaser; Men kunnskap om dens funksjoner har fortsatt å utvide til å omfatte antimikrobiell, immunitet og anti-betennelse roller [35]. SLPI rolle i munnhulen progresjon er mindre kjent, men nylige resultater i biopsied vevssnitt viste en nedgang i SLPI i OSCC vev sammenlignet med friske, så vel som en mulig rolle i å inhibere invasivitet [26].
Vårt studien har avdekket flere nye funn om SLPI mulige rolle i kreft i munnhulen. For en våre resultater er de første til å vise en betydelig fall i SLPI i ikke-invasiv innsamlede orale børste biopsiprøver, så vel som den cellulære fraksjon av hel spytt. Disse funnene er i tråd med de siste resultatene viser en SLPI overflod nedgang i OSCC vevssnitt samlet inn via tradisjonell skalpell biopsi [26]. Viktigere vår studie er den første til å undersøke både OPML og OSCC vev, viser en progressiv tap av SLPI i pre-ondartet tilstand, etterfulgt av en mer dramatisk nedgang OSCC. Våre resultater tyder på en mulig rolle for SLPI som en ikke-invasiv samlet diagnostisk eller prognostisk biomarkør i enten OPML eller OSCC vev – et betydelig funn gitt det presserende behovet for enklere og billigere tester for kreft i munnhulen som omgår ulempene med skalpell biopsi [8] [9].
Våre resultater tyder også en mekanistisk rolle for SLPI i oral cancer progresjon. Nyere funn ved hjelp av
in vitro
cellekultur har antydet at SLPI hemmer invasivitet av orale kreftceller [26]. Forløpende disse funn tyder våre resultater en systemisk reduksjon i SLPI, i det minste i orale epitelceller hos pasienter utsatt for oral kreftutvikling. Denne påstanden ble støttet av om en 5-fold nedgang i SLPI i matchet friskt vev sammenlignet med friske normale kontroller, med en konkordant nedgang i sin overflod i ekspandert celler i hele spytt. Bestemme basis (f.eks genetisk, epigenetisk etc.) for samlet tap i SLPI overflod hos pasienter som utvikler OSCC vil ta mer etterforskning.
Våre resultater viser at SLPI hemmer NF-kB transkripsjonen aktivitet in vitro i OPML celler støtter videre sin mekanistiske rolle i oral cancer progresjon. Økt NF-kB transkripsjonen aktivitet, aktiverende ekspresjon av pro-inflammatoriske cytokiner, er et velkjent faktor i utvikling OSCC [29], [30], [31]. En reduksjon i SLPI overflod kan, i det minste delvis, være en medvirkende faktor til pro-inflammatorisk tilstand som fører til OSCC. Andre har vist en rolle for SLPI som en inhibitor av NF-kB aktivitet, og dette demonstrerer at den kan forstyrre signalveien som fører til NF-kB-aktivering [36] og /eller eventuelt konkurrerer om binding til DNA ved NF-kB reguleringsseter [32 ]. Vår undersøkelse er den første til å vise SLPI som en inhibitor av NF-kB i forbindelse med oral cancer, spesielt i en modell OPML- cellelinje. Forstå den eksakte mekanismen for hemming vil ta mer etterforskning. Vår observasjon åpner spennende muligheter for SLPI som et behandlingsalternativ for utsatte OPML lesjoner, som slike behandlinger er sterkt behov for å forebygge utvikling av invasiv OSCC. SLPI gir mulige fordeler ved en slik anvendelse, da det er et lite protein (ca. 11 kDa), som er kjent for å være fri for posttranslasjonelle modifiseringer, og er vist å bli tatt opp av cellene lett [32].
våre funn generere en rekke spennende hypoteser for testing i fremtiden. For en, kan muligheten for SLPI som en ikke-invasiv diagnostisk eller prognostisk oppsamlet biomarkør testes i større kullet OPML og OSCC pasienter. Dens rolle som en hemmer av NF-kB i OPML, med potensial for forebyggende behandling kan bli testet og undersøkt på en rekke måter. Eksperimenter undersøke naturen av hemming, for eksempel direkte bindende ved NF-kB områder, og effekter på gen- og proteinuttrykk ville være opplysende. Testing avkortede versjoner av SLPI kan også viser økt hemmende effekter på NF-kB på grunn av bedre cellulært opptak og /eller DNA-binding. På et endelig notat av interesse, nyere bevis antyder også en rolle for SLPI i å hemme human papilloma virus (HPV) infeksjon og påfølgende hode- og halskreft utvikling [37]. Undersøkelse om effekten av SLPI behandling til HPV + kreftceller vil være av stor interesse. Funnene vi presenterer her gir et utgangspunkt for slike fremtidige undersøkelser, som kan stivne SLPI som et svært verdifullt protein i diagnose, prognose og behandling av kreft i munnhulen.
massespektrometri proteomikk data har blitt avsatt til ProteomeXchange Consortium (https://proteomecentral.proteomexchange.org) via PRIDE partner depotet [38] med datasettet identifikator PXD000807 og DOI 10,6019 /PXD000807.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Coommassie farget bilder av total protein belastning (A) børstet muntlig cellsfrom pasienter; (B) ekspandert cellsfrom hele salivafrom pasienter; (C) Primære cellelinjer, inkludert RhEK keratinocytter, MSK oral leukoplaki celler, og CA-9-22 orale kreftceller. Disse membraner ble anvendt for Western blotting resultater som er vist i figur 3 av tekst
doi:. 10,1371 /journal.pone.0095389.s001 plakater (DOC)
tabell S1. .
Pasient egenskaper
doi: 10,1371 /journal.pone.0095389.s002 plakater (DOC)
Tabell S2.
Alle proteiner identifisert og kvantifisert i proteomikk analyser. Resultater fra to separate iTRAQ reagenvolumer-baser proteomikk analyser er vist i egne regneark
doi:. 10,1371 /journal.pone.0095389.s003 plakater (XLSX)
Takk
forfatterne er takknemlige for Senter for massespektrometri ved University of Minnesota, særlig LeeAnn Higgins og Todd Markowski, for å få hjelp med prøveopparbeidelse og instrumentell analyse. Forfatterne erkjenner også Minnesota Supercomputing Institutt for vedlikehold av programvare og maskinvare som brukes for dataanalyse.
