Abstract
Innledning
Kreft i bukspyttkjertelen (PCA) er en aggressiv svulst som assosierer med høy dødelighet. Flertallet av PCA pasienter blir diagnostisert vanligvis på slutten av kreft stadier når de terapeutiske alternativer er begrenset. MicroRNAs (miRNA) er involvert i tumorutvikling og blir ofte dysregulerte i PCA. Som et proof-of-prinsippet studien ønsket vi å evaluere potensialet for fekal mirnas som biomarkører for kreft i bukspyttkjertelen.
Materialer og metoder
Total RNA ble ekstrahert fra avføring ved hjelp av Qiagen sin miRNA Mini Kit . For miRNA uttrykket analyserer vi valgt en undergruppe av 7 mirnas som ofte feilregulert i PCA (MIR-21, -143, -155, -196a, -210, -216a, -375). Deretter ble uttrykk nivåer av disse mirnas bestemt i fekale prøver fra kontroller (n = 15), kronisk pankreatitt (n = 15) og PCA pasienter (n = 15) ved hjelp av kvantitative TaqMan-PCR-analyser.
Resultater
Alle valgte mirnas var påvises i avføringsprøver med høy reproduserbarhet. Fire av syv mirnas (MIR-216a, -196a, -143 und -155) ble påvist ved lavere konsentrasjoner i avføringen til PCA pasienter sammenlignet med kontroller (p 0,05). Analyse av fekal miRNA uttrykk i kontroller og pasienter med kronisk pankreatitt og PCA viste at uttrykket av MIR-216a, -196a, -143 und -155 var høyest i kontroller og lavest i PCA. Uttrykket av de resterende tre mirnas (MIR-21, -210 og -375) forble uendret blant kontroller og pasienter med kronisk pankreatitt eller PCA.
Konklusjon
Våre data gir romanen bevis for differensial uttrykk for miRNAs i avføringen til pasienter med PCA. Hvis vellykket validert i store prospektive studier, kan de fekale miRNA biomarkører tilby nye verktøy for PCA screening forskning
Citation. Link A, Becker V, Goel A, WEX T, Malfertheiner P (2012) Mulighetsstudie av fekal microRNAs som Novel Biomarkører for kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 7 (8): e42933. doi: 10,1371 /journal.pone.0042933
Redaktør: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland
mottatt: 9. januar 2012; Godkjent: 16 juli 2012; Publisert: 08.08.2012
Copyright: © Link et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen (PCA) er den nest største årsaken gastrointestinale kreftrelaterte dødsfall i Europa og USA [1], [2]. Til tross for intensiv grunnforskning og klinisk forskning median overlevelse av pasienter med PCA er fortsatt ca 6-10 måneder etter diagnose, som fremhever den aggressive tumorbiologi av denne sykdommen [3]. Flertallet av pasienter med PCA ( 80%) til stede med regional eller fjerne svulsten formidling ved diagnose som gjør dem kvalifisert for kirurgisk fjerning av svulster, som i dag er den eneste mulige kurative behandling for denne malignitet [1], [3]. Foruten potensielle kreftforebyggende livsstilsendringer (diett, mosjon, opphør av røyking etc.), screening og deteksjon av tidlig PCA er ansett som mest lovende strategi for å redusere PCA-assosiert dødelighet [4] – [6]. Nåværende klinisk screening og diagnostikk styring av PCA pasienter er basert på imaging teknikker som endoluminal ultralyd (EUS) eller kontrastforsterket multidetektor CT scan. Imidlertid, på grunn av deres invasive natur, bruk av stråling, og lav sensitivitet /spesifisitet, slike teknikker i beste fall bare kan anvendes for screening hos høyrisikopasienter (f.eks arvelig PCA, Peutz-Jeghers syndrom etc.) [6], [7]. Det er derfor et umiddelbart behov for identifisering og utvikling av nye biomarkører, fortrinnsvis ikke-invasive diagnostiske teknologier som kan forutsi utviklingen av PCA eller sin diagnose ved tidligste stadier.
Betydningen av slike ikke-invasive biomarkører har lenge vært anerkjent. Følgelig er blod, avføring eller andre kroppsvæsker i dag antas å være den beste veier for biomarkør forskning som innlemmer et bredt spekter av genetiske og /eller epigenetisk endringer i forbindelse med kreft [6], [8]. Basert på dette paradigmet, flere biomarkører som hTERT, CA72-4, osteopontin, REG4, MIC-1,
K-ras
,
p-53
eller avvikende metylering av CpG øyene de tumorsuppressorgener er for tiden under vurdering [3], [9] – [11]. Likevel, til dato, har bare karbohydrat antigen 19-9 (CA19-9) funnet sin kliniske nytten i tidlig deteksjon av tilbakevendende sykdom, etter kirurgisk behandling av PCA pasienter [12]. Imidlertid er bruken av CA19-9 for PCA-screening anbefales ikke på grunn av lav sensitivitet og spesifisitet [13].
microRNAs (mirnas), de små ikke-kodende transkripsjoner av ~22 nukleotider, har nylig blitt identifisert som en ny klasse av cellulære molekyler med betydelige diagnostiske, prognostiske og terapeutiske implikasjoner [14]. Mirnas spiller en viktig rolle i en rekke fysiologiske og patologiske prosesser [15]. I kraft av å regulere genekspresjon, er mirnas involvert i de tidligste trinnene i kreft patogenesen av flere kreft hos mennesker [15], [16]. I tillegg eksisterer unike miRNA uttrykk mønstre tillater identifikasjon av forskjellige typer og undertyper av kreft [17] – [19]. En av de mest spennende funksjonene i mirnas er deres biologiske stabilitet sammenlignet med DNA eller mRNA. Mirnas er bemerkelsesverdig beskyttet mot endogen og eksogen degradering på grunn av sin lille størrelse og exosomal nærvær i kroppsvæsker [20], [21]. Basert på dette paradigmet har flere forskningsgrupper uavhengig vist at potensialet for miRNA som blodbaserte biomarkører for PCA [21] – [23]. Mens blodbasert tilnærming er fortsatt et spørsmål om den intensive forskning, har det også blitt foreslått at gastrointestinal kreft-relaterte genetiske og epigenetiske endringer kan potensielt bli detektert i feces [8], [24]. Tatt i betraktning den høye volum (~1.5 l) av pankreatisk saft produksjon og utskillelse inn i tarmen, har det vært antatt at forstadier eller tidlig kreft-relaterte molekylære forandringer kan påvises i avføring og blod fra bukspyttkjertelen kreftpasienter, som gir en sterk begrunnelse for fekal biomarkør forskning [8].
Tatt i betraktning at PCA er forbundet med unike endring mønster av miRNA uttrykk, hypotese vi at miRNA uttrykket signatur kan være identifiserbar i avføringen til pasienter med bukspyttkjertel neoplasi. Følgelig, i den foreliggende undersøkelse, evaluerte vi potensialet av fecal miRNA uttrykk analyser for identifisering av PCA. Som et bevis på rektor, viser vi at flere fekal mirnas er uttrykt forskjellig hos pasienter med bukspyttkjertelsykdommer. Pilot analyser av avføringsprøver fra pasienter med kronisk pankreatitt og PCA foreslår en potensiell rolle for fekal mirnas som nye biomarkører i tidlig deteksjon av PCA.
Materialer og metoder
Kliniske prøver
studien ble utført på de arkiv fekale prøver fra påfølgende pasienter som har blitt samlet for kliniske analyser og prospektivt samlet inn avføring fra friske personer. Alle prospektivt rekruttert friske frivillige ga skriftlig informert samtykke og protokollen ble godkjent av Institutional Review Board ved Baylor University Medical Center [24]. De arkiverte fekale prøver ble avidentifisert, ettersom skriftlig informert samtykke ikke kunne oppnås på grunn av pasientens migrasjon eller død, og protokollen ble godkjent av Institutional Review Board of Otto-von-Guericke Universitetet Magdeburg (Magdeburg, Tyskland). Totalt 45 avføringsprøver, inkludert 15 kontroller, 15 pasienter med kronisk pankreatitt og 15 PCA pasienter ble inkludert i studien. Kontrollprøver ble tilfeldig valgt ut fra avføringsprøver innsamlet for påvisning av
Helicobacter pylori
i avføring fra pasienter med ikke-maligne GI-lidelser så som reflux eller gastritt. Prøver fra pasienter med kronisk pankreatitt og PCA ble valgt ut fra fortløpende pasienter med tilgjengelige frosne avføringsprøver, som ble samlet inn for analyse av fekal
elastase
nivåer som en rutinemessig diagnostisk test for eksokrin pankreas insuffisiens. Kliniske og demografiske data av pasientene er vist i Tabell 1.
Avføringsprøver samling
Alle prøver ble samlet inn og behandlet jevnt ved hjelp av avføring prøveinnsamlings rør (Sarstedt AG, Nümbrecht, Tyskland) som praktiseres i de rutinemessige kliniske settinger. Oppegående pasienter ble bedt om å samle avføringen hjemme og ta med avføring i løpet av neste presentasjon i avdelingen. Avføringsprøve fra stasjonære pasienter har blitt samlet inn i lignende måte. Før det når den laboratoriet ble prøvene enten lagret ved + 4 ° C eller ved romtemperatur. Etter at prøvene har nådd laboratoriet ble prøvene alikvotert og lagret fortløpende ved -30 ° C inntil videre anvendelse.
RNA isolering
Totalt RNA (inkludert mirnas) ble ekstrahert fra avføringsprøver ved bruk av Qiagen største miRNAeasy Mini Kit (Qiagen) som tidligere beskrevet [24]. I korthet, ble ca. 30-50 pl av frossen alikvotert krakk homogenisert med RNase-fritt vann til en total 150 ul og umiddelbart lysert med 800 pl av QIAzol lysis reagens (Qiagen, Hilden, Tyskland). Utfelling ble utført med kloroform og den vandige fase ble blandet med 1,5 volumer 100% etanol. Etter eluering ble RNA kvalitet vurdert ved A260 /A280-forhold ved hjelp av UV-spektroskopi og prøvene ble lagret ved -80 ° C inntil videre analyse.
mikroRNA kvantifisering av real-time PCR
Kvantitativ miRNA uttrykket analyser ble utført ved hjelp av enten TaqMan miRNA analyser (Applied Biosystems, CA, USA) eller SYBRgreen metode i henhold til produsentens instruksjoner som beskrevet tidligere [24]. Etter revers transkripsjon, ble prøvene kjøres ved hjelp iCycler IQ® Detection System (Bio-Rad, CA, USA). For å unngå en inter-plate skjevhet /variabilitet, analyser miRNA ekspresjon ble utført ved anvendelse av en enkelt 96-brønners plate i duplikater. Forskjellene mellom gruppene er presentert som ΔCt, som representerer forskjellen mellom den midlere Ct verdi av miRNA av interesse og den midlere Ct verdien av normaliserings miRNA. Vi brukte MIR-16 for fekal miRNA normaliseringen i alle prøver som det har vist seg å være mest konsistent uttrykt i forskjellige fekale prøver inkluderende prøver fra pasienter med kolorektal kreft som tidligere beskrevet [24]. Valg av microRNAs ble utført ved hjelp av følgende kriterier: a) rapportert som bukspyttkjertel-spesifikke mikroRNA (MIR-375) [25]; b) tidligere rapportert for mulig innblanding i bukspyttkjertelen kreftutvikling (MIR-21, -196a, -210, -143, -155, -375, -216a) [26] – [28]; c) differensial uttrykk for miRNAs har blitt rapportert for blod (MIR-21, -155, -196a, -210) [21] – [23] og /eller bukspyttkjertel væske (MIR-21, -155, tabell 2) [29 ]. Primer sekvenser for RT-PCR-analyser er oppført i tabell S1.
mikroRNA microarray uttrykk profilering og dataanalyse
mikroRNA microarray uttrykk profilering ble utført med sikte på å vurdere tilstedeværelse av utvalgte mirnas i feces som tidligere beskrevet [24]. I korthet, ble total RNA ekstrahert fra en enkelt avføringsprøve fra en frisk person ved å bruke Qiagen største miRNAeasy Mini Kit som beskrevet ovenfor. Forsterkning og hybridisering ble utført i henhold til produsentens instruksjoner (Illumina, Inc., San Diego, California). Microarray databehandling og analyse ble utført ved hjelp av Illumina er BeadStudio programvare. Normalisering er utført ved hjelp av Lumi Bioconductor programvarepakken skaper logge miRNA uttrykket verdier [30]. Etter konservativ sonde filtrering skritt, som utelukket sonder som ikke nådde en deteksjons verdi av P 0,05 analysene resulterte i pålitelig varsling for 630 prober
Statistisk analyse
Dataanalysene ble utført med. GraphPad Prism 4.0-programvaren (San Diego, California, USA) eller SPSS 17.0 (IBM Deutschland GmbH, München, Tyskland). Forskjellene mellom to gruppene ble analysert ved hjelp av t-test. Forskjellene mellom mer enn to gruppene ble analysert ved hjelp av Kruskal-Wallis metode med passende Dunn multippel sammenligning
post hoc
test. Korrelasjonsanalyser ble utført ved hjelp av Pearsons test. Når det er hensiktsmessig, ble logaritmisk regresjon anvendt for å beregne R «sup> 2 og for å skape ligningen av skråningen. En tosidig p-verdi. 0,05 ble ansett som vesentlig
Resultater
Valg av fekal mirnas
For å undersøke om PCA pasienter har påvisbare fekal miRNA uttrykk endringer, vi først utført systematiske analyser av litteratur med sikte på å velge flere mirnas med høyest bevis for miRNA deregulering i PCA pasienter. Basert på differensial miRNA ekspresjon i pankreas tumorvev [18], [26] – [28], endringer i bukspyttkjertelsaft [29] og i blod [21] – [23], som beskrevet ovenfor. Vi har senere valgt 5 oppregulert (MIR-21, -210, -143, -155, -196a) og 2 downregulated mirnas (MIR-216a og -375) for videre analyser. Tabell 2 gir en global oversikt over PCA-relaterte miRNA uttrykk endringer. For å få en samlet oversikt for detectability av de valgte miRNAs i avføring hos friske frivillige, ble fekal miRNA uttrykket profilering utføres ved hjelp av miRNA mikromatriser hjelp av en enkelt avføringsprøve fra friske frivillige. Som vist i figur 1A, var alle de valgte mirnas stede i avføringen ved påvisbare konsentrasjoner
(A) miRNA microarray uttrykk analyser ble utført ved hjelp av Illumina microarray for å vurdere tilstedeværelsen av utvalgte mirnas (MIR-16,. – 375, -196a, -216a, -21, -143, -155 og -210) i en enkelt avføringsprøve av den sunne emnet. Fecal miRNA uttrykket ble konvertert til å logge utfoldelse verdiene følgende Lumi Bioconductor normalisering. (B 0,1). (D) Normalisert MIR-196a uttrykk er sammenlignbare i kort og lang sikt lagrede prøver (p = 0,441). (E) Ettersom MIR-216a var tilstede i feces ved laveste konsentrasjoner, og dens ekspresjon ble analysert ved hjelp av to uavhengige kvantitativ RT-PCR løper for å evaluere reproduserbarheten av analysen (p 0,0001). Normalisering ble utført med hjelp av MIR-16 som intern normalizer.
reproduserbarhet av resultater for de mirnas med lav uttrykk
Blant alle analysert mirnas, MIR-216a var til stede i avføringen til lavest konsentrasjon (figur 1C). For å undersøke om selv miRNA med lav uttrykk kan være en pålitelig og reproduserbart analysert i avføring, utførte vi to uavhengige uttrykk målinger. Som vist i figur 2E, ble Mir-216a uttrykk reproduserbart påvist i avføring fra alle prøvene til tross for sin lave konsentrasjonen (R
2 = 0,761, p 0,0001)
Differensial uttrykk for fecal miRNAs i PCA pasienter.
For å vurdere om fekal miRNA uttrykket analyse tilnærming kan være nyttig i PCA diagnose, ble 45 fekale prøver evalueres. De kliniske karakteristika for pasientene er vist i tabell 1. Femten fekale prøver fra kontrollene ble sammenlignet med femten hver fra pasienter med PCA og kronisk pankreatitt. Alle 7 testet mirnas som er klinkende feilregulert i bukspyttkjertelkreft, var til stede i avføringen, men med spesifikke variasjoner i miRNA uttrykk. Fire av 7 mirnas (MIR-196a, -216a, -143 og -155) ble uttrykt til betydelig lavere nivåer i avføringsprøver fra pasienter med PCA sammenlignet med kontroller (Kruskal-Wallis med Dunn innlegg test p 0,05 for MIR-196a og MIR-216a og p 0,001 for MIR-143 og -155). Blant disse er det kun MIR-143 og -155 viser signifikante forskjeller mellom pasienter med kronisk pankreatitt og kontroller. Interessant, subgruppeanalyser blant de tre gruppene viste gradvis nedgang i
median
ΔCt for miRNA uttrykk i fekale prøver fra kontroller for å redusere uttrykk hos pasienter med kronisk pankreatitt og lavest hos pasienter med PCA (MIR-196a: -2,50 vs -3,00 vs -3,65; MIR-216a: -5,30 vs -9,10 vs -10,80; MIR-143: -5,20 vs -6,00 vs -7,35 og MIR-155: 0,15 vs -1,95 vs. -2,55 for kontroll vs. kronisk pankreatitt lignet med henholdsvis PCA) som vist i figur 3. det er verdt å nevne at til tross for den lavere miRNA ekspresjon i avføring fra pasienter med PCA og kronisk pankreatitt, miRNA ekspresjon forskjellene var ikke statistisk signifikante. Spesielt, MIR-21, -375 og -210, som ofte dysregulerte i bukspyttkjertel kreft, ble funnet å være uendret i avføring fra kontroller og pasienter med PCA og kronisk pankreatitt (figur 3).
Tall (A ) til (G) representerer ulike mirnas som ble valgt for studien er basert på endringer i PCA vev. * Representerer p 0,05, *** – p 0,001. Forkortelser: N-kontrollpersoner, cp kronisk pankreatitt, PCA- bukspyttkjertelkreft. Dataene er til stede som boks-og-værhår plott: øvre og nedre grense for boksene indikerer 75
th og 25
th percentil, linjene inni boksene – medianer, og øvre og nedre horisontale barer betegne 90
th og 10
th persentiler, henholdsvis.
En kombinasjon av miRNAs som diagnostisk verktøy for PCA
det ble tidligere rapportert at uttrykk mønster av flere mirnas snarere enn enkelt miRNA ville sannsynligvis resultere i høyere sensitivitet og spesifisitet for identifisering av humane cancere [28]. Basert på denne forutsetningen vi en hypotese om at kombinasjonen av 4 forskjellig uttrykt mirnas ville gi bedre diskriminering av pasienter med PCA sammenlignet med kontrollene. Ettersom alle 4 mirnas viste en gradvis reduksjon i miRNA uttrykk, oppsummert vi ΔCt-verdier av MIR-196a, -216a, -143 og -155 for hver prøve. Som vist i figur 4,
median
ΣΔCt-verdiene var: for kontroller -12.78 vs -21,45 for kronisk pankreatitt vs -23,25 for PCA (Kruskal-Wallis test p 0,0002, Dunns innlegg test kontroller vs kronisk pankreatitt eller PCA p 0,05 og 0,001, henholdsvis). Ved hjelp av denne kombinasjonen, oppnådde vi
median
ΔCt-verdi forskjell på 10.47 (eller 1418 ganger) mellom PCA og kontroller, mens ΔCt-verdi forskjell for MIR-143 alene var 2,15 (eller 4,4 ganger).
Oppsummering av ΔCt-verdiene av MIR-196a, -216a, -143 og -155 ble utført for å beregne Σ ΔCt-verdi. * – P 0,05, *** – p 0,001. Forkortelser: N-kontrollpersoner, cp kronisk pankreatitt, PCA- bukspyttkjertelkreft. Dataene er til stede som boks-og-værhår plott: øvre og nedre grense for boksene indikerer 75
th og 25
th percentil, linjene inni boksene – medianer, og øvre og nedre horisontale barer betegne 90
th og 10
th persentiler, henholdsvis.
Diskusjoner
i denne proof-of-prinsippet studier, vurderte vi muligheten for fekal miRNAs som potensielle biomarkører for påvisning av PCA. Ved hjelp av en undergruppe av miRNAs som ofte feilregulert i PCA, fant vi at MIR-196a, -216a, -143 og -155 er til stede på lavere nivåer i fekale prøver fra pasienter med PCA sammenlignet med kontrollene. I tillegg, viser vi at endringer i avførings miRNA ekspresjon kan også bli detektert i pasienter med kronisk pankreatitt. Endelig viser vi at en kombinasjon av en undergruppe av mirnas kan tilveiebringe en overlegen diagnostisk verdi med en høyere sensitivitet og spesifisitet for identifisering av pankreatisk neoplasi.
Bortsett fra bildeteknikker, er det et klart behov for alternative modaliteter for tidlig deteksjon av PCA. For eksempel kan invasiv samling av bukspyttkjertelen juice eller pankreasgang børsting synes potensielt lovende; Dette kan bare utføres i et begrenset antall pasienter på grunn av sin invasivitet og mangel på egnet for screeningformål. Blod-basert biomarkør forskning har alltid vært fokus, som det har et enormt potensial for å utvikle ikke-invasive screening tilnærminger. Imidlertid avføring er også blitt foreslått som lovende alternativ, spesielt for GI-relaterte maligniteter, på grunn av konstant avgivelse av eksfolierte celler og produksjon av pankreatisk fluid [8], [24]. Det antas at fekale markører kan ha høyere diagnostisk utbytte, ettersom molekylkreftrelaterte endringer i DNA, kan mRNA og mirnas påvises mye tidligere i feces. Nylig har vi og andre vist at påvisning av fecal mirnas er en mulig tilnærming som har en høy grad av reproduserbarhet, og at pasienter med tykktarm neoplasi viser ofte høyere ekspresjon av MIR-21 og -106a sammenlignet med kontroller [24], [31 ]
for øyeblikket finnes overbevisende bevis for vevsspesifikke endringer i miRNA uttrykket i PCA [21], [26] -. [28]. Disse mirnas har vært fokus for flere studier som viser komplekse interaksjoner med viktige veier og mål i bukspyttkjertelen kreftutvikling. Basert på eksisterende kunnskap for miRNA uttrykk mønstre i PCA, i denne studien valgte vi 7 PCA-forbundet mirnas som enten opp- (MIR-21, -155, -143, -210 og – 196a) eller nedregulert (MIR -375, -216a) for miRNA uttrykk analyser i avføring. I en pivotal studie Bloomston et al. demonstrert at PCA har tydelig miRNA uttrykk mønster med spesifikke endringer av 25 mirnas vs. godartede bukspyttkjertelen vev og 21 mirnas når du sammenligner til kronisk pankreatitt vev. Ved hjelp av denne miRNA uttrykket mønster forfatterne kunne skille PCA vev fra godartede og kronisk pankreatitt vev med nøyaktighet på mer enn 90% [26]. Deretter ble det vist at ekspresjon av MIR-21 og -196a var assosiert med høy proliferasjon (Ki67-indeks), tilstedeværelse av levermetastaser og prediksjon av dårlig overlevelse /prognose [19], [26]. Våre data bekrefter tidligere rapporter som viser bemerkelsesverdig stabilitet av fecal mirnas i feces, såvel som deres høye konsentrasjoner er til stede i fekale prøver [24], [32], [33]. Ved hjelp av target-basert tilnærming, fant vi differensial miRNA uttrykk for 4 av 7 mirnas (MIR-196a, -216a, -143 og -155) i avføring fra pasienter med PCA i forhold til kontroller, mens 3 mirnas (MIR-21, -375 og -210) ble uttrykt på lignende nivåer mellom ulike friske forsøkspersoner og pasienter. I denne proof-of-prinsippet studien var det noe overraskende å merke seg at fire av de forskjellig uttrykt mirnas i vår studie viste redusert miRNA uttrykk i avføringen til pasienter med PCA, mens tidligere studier har vist oppregulering av MIR-196a, -143 og – 155 i pankreas tumorvev hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen og nedregulering av MIR-216a [26] – [28]. Vi antok at årsaken til endringen i avføring vs. vev uttrykk av disse miRNAs kan være på grunn av endringer i bukspyttkjertelen væske strøm, noe som ofte er patologisk hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen og kan være delvis ansvarlig for denne avvikende observasjon. På grunn av den retrospektive karakter av studien, var vi ikke i stand til å samle inn data for status av galle /pankreasgang obstruksjon eller utføre sammen svulst og avføring miRNA analyser. Men vår hypotese gevinster støtte fra flere andre studier. Først ble det tidligere vist at utvalgte mirnas (MIR-21, -210, -155, -196a) ble oppregulert i plasma fra pasienter med PCA, noe som tyder på deres mekanistisk engasjement i bukspyttkjertel kreft [21], [22]. For det andre har en uavhengig studie viste økt uttrykk av MIR-155 i bukspyttkjertelen væske fra PCA pasienter [29], noe som ytterligere støtter vår observasjon. Tredje, vår egen observasjon for en gradvis gradvis reduksjon i uttrykket av utvalgte miRNAs i avføringen til pasienter med kronisk pankreatitt, sammenlignet med kontroller og PCA pasienter støtter dette argumentet. Likevel, vi fant ingen signifikante forskjeller i fekal miRNA uttrykket mellom PCA og pasienter med kronisk pankreatitt som kan gjenspeile enten høy risiko for PCA utvikling hos pasienter med CP fra en side eller kan foreslå et forhold til eksokrin eller endokrine bukspyttkjertelen insuffisiens .
i denne studien ble miRNA profilering utelukkende brukes til å få global oversikt for identifisering av miRNA uttrykk mønstre i fekale prøver fra bukspyttkjertelen kreftpasienter. Siden tilgjengelige prøvene ble retrospektivt samlet inn og lagret for langsiktig, vi bevisst unngått profilering av disse tumorvev for å unngå potensiell seleksjonsskjevhet ved hjelp av en høy gjennomstrømming microarray-baserte teknikk. Selv om utvalgte mirnas viste ubetydelige forskjeller mellom CP og PCA pasienter, tror vi at våre resultater er tankevekkende for PCA biomarkør forskning, og gi en overbevisende springbrett for å gjennomføre ytterligere prospektive studier i fremtiden for å systematisk vurdere potensielle forskjeller i mirnas som er unike for disse pasient undergrupper med hensyn til bukspyttkjertelen og galle duct status. Resultatene fra vår studie aktualiserer behovet for videre forskning på biologiske betydningen av deregulerte miRNAs i bukspyttkjertelen neoplasi. Som vist i tabell 2 er de fleste av mirnas analysert i vårt studium har flere, kreft-relaterte validert genet mål i humane kreftformer. For eksempel Giron et al. har vist at Mir-155 mål Tumor protein 53-induced kjernefysiske protein 1 (TP53INP1) forstyrre sin anti-tumoraktivitet i kreft i bukspyttkjertelen celler [34]. Flere grupper har vist at MIR-21 mål PTEN, Reck, PDCD4, som kan være ansvarlig for onkogen rolle MIR-21 [35], [36]. Likeledes MIR-143, som ofte deregulert i bukspyttkjertel kreft, har vist seg å samhandle med KRAS [37] og restitusjon av tumor suppressor miRNA kan hemme tumorvekst i xenograft bukspyttkjertelkreft modell ved hjelp nanovector levering av MIR-143/145 [38 ]. I tillegg MIR-196a og MIR-210 har vist seg å spille en onkogen rolle ved å målrette flere tumorsuppressorgener (ANXA1, KRT5, RAD52) påvirker spredning og hypoksisk stresset [39] – [42], mens MIR-375 og -216a , som ofte er nedregulert i kreft i bukspyttkjertelen, har vært implisert i insulinsekresjon og i regulering av celle overlevelse og proliferasjon ved å målrette flere onkogener som PDK1, JAK2, ATG7 [25], [43] – [46]. Disse dataene er tiltalende for videre intensiv forskning på biologiske betydningen av miRNAs som biologiske effekten av exosomal miRNA kan være utenfor mobilnettet eller lokale tumor effekter [47], [48].
Aktuelle data implisere at miRNA uttrykk mønstre, snarere enn en enkelt miRNA kan være nødvendig for bedre verktøy for en miRNA-basert diagnose tilnærming. For eksempel, i vår studie, utførte vi en enkel summering av ΔCt-verdier som mulig for oss å oppnå en bedre diskriminering av median ΔCt-verdier pasienter med PCA sammenlignet med kontroller. En slik tilnærming kan være av betydning hvis fekal miRNA uttrykk mønstre benyttes for screening av andre GI ondartede sykdommer. Dette er spesielt relevant fordi fekal analyse er viden implementert i klinisk praksis, f.eks fekal okkult blod tester for tykktarmskreft screening og for evaluering av bukspyttkjertelen elastase i avføringen som en biomarkør for eksokrin pankreas insuffisiens. Hvis validert i fremtiden kan visjonen om fekal miRNA basert tilnærming for identifikasjon av GI svulster lett oversettes til diagnostikken, en tilnærming som vil utvilsomt ha en overlegen pasient compliance i forhold til de tilgjengelige invasive diagnostiske tester.
Selv lovende, fekal miRNA basert tilnærming må videre intensiv etterforskning før klinisk anvendelse. Som anerkjent tidligere, på grunn av vår evne til å inkludere kun begrenset antall prøver i denne proof-of-prinsippet studier, gir den statistiske betydningen av våre resultater begrenset dokumentasjon for klinisk anvendelse og potensialet for fekal miRNA for diagnostisering av PCA pasienter i nærmeste fremtid. Likevel tror vi at våre funn er nye og fremtidige studier inkludert prospektive samling av prøvene med ulike kreft etapper med komplett biokjemisk og klinisk annotering for bukspyttkjertelen /galle duct obstruksjon er nødvendig på grunn av potensielle virkningen av bukspyttkjertelen duct obstruksjon på fekal miRNA uttrykk nivåer .
