Abstract
I våre studier av eggstokkreft celler vi har identifisert subpopulasjoner av celler som er i en overgangs E /M hybrid stadium, dvs. celler som samtidig uttrykker epitelceller og mesenchymale markører. E /M celler er ikke homogent, men
in vitro Hotell og
in vivo
, inneholder undergrupper som kan skilles på grunnlag av en rekke fenotypiske egenskaper, herunder subcellulære lokalisering av E-cadherin, og uttrykket nivåer av Tie2, CD133, og CD44. En cellulær undergruppe (E /M-MP) (membran E-cadherin
lav /cytoplasma E-cadherin
høy /CD133
høy, CD44
høy, Tie2
lav) er høyanriket for tumordannende celler og viser egenskaper som generelt er forbundet med kreft stamceller. Våre data antyder at E /M-MP-celler er i stand til å differensiere i forskjellige linjer under visse forhold, og har evne til selvfornyelse, dvs. for å opprettholde en undergruppe av udifferensiert E /M-MP-celler i løpet av differensiering. Trans-differensiering av E /M-MP celler inn mesenchymale eller epitelceller er assosiert med tap av stamcellemarkører og tumorigenicity.
In vivo
xenograft tumor Veksten er drevet av E /M-MP celler, som gir opphav til epitelial eggstokkreft celler. I motsetning til dette,
in vitro
, har vi funnet at E /M-MP-celler differensieres til mesenchymale celler, i en prosess som involverer reaksjonsveier forbundet med en epitelial-til-mesenchymale overgang. Vi har også oppdaget fenotypisk plastisitet som var avhengig av eksterne faktorer som stress skapt av sult eller kontakt med enten epitel eller mesenchymale celler i co-kulturer. Vår studie gir en bedre forståelse av den fenotypiske kompleksiteten av eggstokkreft og har implikasjoner for eggstokkreft terapi
Citation. Strauss R, Li Z-Y, Liu Y, Beyer jeg, Persson J, Sova P, et al. (2011) Analyse av Epithelial og Mesenchymale Markører i Eggstokkreft avslører Fenotypisk heterogenitet og plastisitet. PLoS ONE 6 (1): e16186. doi: 10,1371 /journal.pone.0016186
Redaktør: Donald Gullberg, Universitetet i Bergen, Norge
mottatt: 27 august 2010; Godkjent: 13 desember 2010; Publisert: 14 januar 2011
Copyright: © 2011 Strauss et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Arbeidet ble støttet av NIH tilskudd R01 CA080192, R01 HLA078836, og Pacific Ovarian Cancer Research Consortium /Specialized Program for fremragende forskning i Eggstokkreft Grant P50 CA83636. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
det er blitt foreslått at tumorettervekst, samt kjemoterapi resistens og metastase, er avhengig av en liten sub-populasjon av kreftceller i svulsten som er tenkt å representere kreft stamceller (cscs). Et definerende kjennetegn på stamceller, i både normal og ondartet vev, er evnen til å fornye seg selv, men samtidig gi opphav til dattercellene som er forpliktet til differensiering i fenotyper som ofte krysser linjene. For å oppnå dette, kan stamceller gjennomgå en asymmetrisk celledeling hvorved de segregere celle-determinanter fate inn i bare ett av de to datterceller [1]. Hos voksne pattedyr, stamceller har blitt karakterisert i en rekke vev, inkludert blodsystemet, sentralnervesystemet, muskel, tykktarm, bryst, og ben /brusk.
For kreft stamceller i faste tumorer, mye kan læres fra studier av hematopoetiske stamceller (HSC) for hvilken det har blitt vist at transplantasjon av en enkelt celle til en myeloablated mottakeren kan rekonstituere hele blodsystemet. Dette definitiv HSC gir opphav til et hierarki av pluripotente stamceller som blir gradvis begrenset i deres differensiering potensial. Leukemi er antatt å stamme enten fra HSCs at ervervet genetiske eller epigenetiske forandringer og ble delvis differensiert og tumorigent, eller fra forfedre som ervervet evnen til å fornye seg selv [2]. Eksistensen av stamceller for visse typer leukemi er sterkt støttet av lentiviral merking av menneskelige akutt myelogen leukemi celler og observasjon av individuelle kloner stede i NOD-SCID mus etter serie transplantasjon av de merkede cellene [3]. Studier av leukemi stamceller også indikert stor fenotypisk plastisitet avhengig av stadium av tumorvekst, svulstens mikromiljø, og ytre faktorer som stress opprettet av radio-eller kjemoterapi [2].
Tilstedeværelsen av cscs i solide svulster har vært foreslått for humane cancere så som bryst [4], hjerne [5], tykktarm [6], hode og hals [7], bukspyttkjertel [8], prostata [9], eggstokk [10], [11], [12 ], og hudkreft [13]. Solid tumor stamceller har blitt definert som «en liten undergruppe av kreftceller i løpet av en kreft som utgjør et reservoar av selvbærende celler med den eksklusive evnen til å fornye seg selv og for å bevirke at heterogene linjer av kreftceller som omfatter svulsten» [ ,,,0],14]. Mange celleoverflatemarkører, inkludert CD24, CD44, CD133, CD166, EpCAM, eller fargestoff efflux-analyser er blitt brukt for å sortere populasjoner av antatte kreft stamceller fra primærkulturer eller tumorcellesuspensjoner oppnådd fra tumor-biopsier. Etter transplantasjon inn i immunodefekte mus, svulster form fra flere hundre markør-positive celler, mens for markør-negative celler bestillinger av størrelser høyere tall er nødvendig for å oppnå den samme frekvens på tumordannelse (for en oversikt: se [15] nylig, ved hjelp av. en forbedret xenotransplantasjon teknikk, en studie med humane melanomceller viste tumordannelse etter inokulering av en svulst celle [16] og dermed et viktig skritt mot et bevis på CSC eksistens ble gjort.
for de fleste karsinomer, progresjon mot malignitet er ledsaget av tap av epitelial differensiering og en dreining mot en mesenchymale fenotype (EMT) [17]. EMT forverrer motilitet og invasivitet av mange celletyper og er ofte betraktet som en forutsetning for tumorinfiltrasjon og metastasering. EMT er preget av økt uttrykk av mesenchymale markører (vimentin, thrombospondin, N-cadherin, vitronectin), økt uttrykk av ekstracellulære matrise forbindelser (kollagen IV og fibronektin), redusert uttrykk av epiteliale markører (E-cadherin, Occludin, Desmoplakin, og Mucin1), endret plassering av transkripsjonsfaktorer ( β-catenin, sneglen, Slug, Twist, Sox 10 og NFkB) og aktivering av kinaser (ERK1, ERK2, og PI3K /AKT) [17]. Det finnes også mange eksempler på avanserte karsinomer som viser at mesenchymale celler kan gjenvinne karakteristikker av epitelceller, en prosess som kalles mesenchymale til epitel overgang (MET) [18]. Tilsynelatende, epiteliale fenotype av cancerceller, og evnen til å danne fysiske barrierer representere en mekanisme som begrenser tilgangen av legemidler, antistoffer eller immunceller til områder av tumorer. Det er blitt spekulert i at både EMT og MET involvere celler i en metastabil tilstand hybrid, f.eks celler med trekk fra begge epiteliale og mesenkymale celler [19].
Våre studier har fokusert på eggstokkreft. Eggstokkreft er den fjerde vanligste kreftformen hos kvinner og har den høyeste dødeligheten av alle kreft i kvinnelige reproduktive system. Omtrent 90% av menneskelig eggstokkreft oppstår fra eggstokkene overflaten epitel (OSE). Den mesodermally avledet normal OSE viser epiteliale og mesenkymale funksjoner, preget av uttrykket av både keratin og vimentin [20]. Interessant, bare lave nivåer av E-cadherin er fremtredende i OSE celler [21] og dens uttrykk er begrenset til inkludering cyster og dype kløfter, bemerkelsesverdig til områder hvor tidlig ondartede hendelser antas å inntreffe [22]. Integriteten OSE lag er i hovedsak opprettholdes av N-cadherin, noe som ytterligere høydepunkter epitel /mesenchymale fenotype i dette vevet [23], [24]. Det er antatt at OSE celler tilpasse seg endringer i den cellulære mikromiljøet ved overganger mellom epitel og mesenchymale stadier [20]. Slike evner er vanligvis begrenset til umoden, regenererende, eller neoplastisk epitel og derfor gjengi en unik fenotypisk plastisitet. Det er antatt at dette plastisitet ligger på opprinnelsen til eggstokkreft. Spesielt, ovariekarsinomer viser en unik egenskap sammenliknet med andre epiteliale kreftformer utledet. Mens den sistnevnte er karakterisert ved tapet av epitel-egenskaper i løpet av tumorprogresjon, er forhøyet ekspresjon av E-cadherin observert for primær neoplastisk eggstokk epitel [25]. Imidlertid synes denne første dreining mot et mer differensiert fenotype tidlig i tumorprogresjon deretter å bli etterfulgt av en reacquisition av mesenchymale funksjoner i mer avanserte ovarietumorer, med en sekundær tap av E-cadherin [26], [27], [28] . Interessant er det epiteliale /mesenkymale fenotype tydelig i OSE celler [29] også funnet i invasiv foran tykktarm [30] og brystkreft [31], og i normalt vev i løpet av epidermal sår reparasjon [32].
i denne studien, gir vi støtte data for en av de viktigste funksjonene i CSC, ved å demonstrere pluripotency, dvs. evnen til å gi opphav til fenotypisk heterogene datterceller. Våre data tyder på at i eggstokkreft celler disse funksjonene er egentlig knyttet til fenomener av EMT og MET.
Resultater
Primære eggstokkreft kulturer inneholder antatte cscs
Vi etablerte 51 eggstokkreft kulturer fra biopsier /ascites av klasse III og IV karsinom (Tabell S1). Etter spaltning av tumor-biopsier med kollagenase og trypsin, cellesuspensjoner ble dyrket i Mammary Epithelial Basal medium supplert med EGF, insulin, hydrokortison, bovint hypofyseekstrakt (MEGM) og 1-2% FBS i inntil fem dager. For å bekrefte deres karsinogent potensial og for å eliminere fibroblaster og leukocytter, ble primære celler injisert inn i melkefettpute av immunsvikt SCID-beige (C.B-Igh-1b /GbmsTac-Prkdcscid-Lystbg N7) mus. Ni primærkulturer dannet xenografttumorer etter transplantasjon av 1 × 10
6 celler (se tabell S1). Xenotransplantater ble deretter skåret ut, spaltet med proteaser og dyrket i MEGM med 10% FBS. For en kultur, ble sekundær- og tertiær xenografting utført. Profiler og suspensjoner av originale biopsier ble kåret OVC-biopsi, ovc805-biopsi, etc; primærkulturer avledet fra pasient biopsier ble kåret ovc316-PC, ovc805-PC, etc; seksjoner eller svulst suspensjoner fra xenografttumorer avledet fra primærkulturer ble kåret ovc316-X, ovc805-X, etc; kulturer som stammer fra xenotransplantater ble kåret ovc316-XC, ovc805-XC, etc.
Kulturer inneholdt ulike celletyper, med klart forskjellig undergrupper som uttrykker ulike kreftmarkører (f.eks CA-125 eller CEA), som var minner om heterogeniteten av tumorceller, sett fra analyse av deler av den opprinnelige tumor eller tumor xenograft (figur 1A, venstre tre paneler). Spesielt svulst celle heterogenitet var mindre uttalt i etablerte eggstokkreft cellelinjer som SKOV3-IP1 (figur 1A, panel til høyre).
A) Tumor biopsier og primærkulturer beis positivt for eggstokkreft markører CA-125 ( grønn) og CEA (rød) og viser høyere heterogenitet enn den etablerte cellelinje SKOV3-IP1. Vist er ovc316-biospy, ovc316-PC, og ovc316-X. Analyse av ovc1208-biopsi, ovc1208-PC, ovc0117-biopsi, ovc0117-PC, ovc100506-biopsi, og ovc100506-PC avslørte samme heterogenitet. B) Lys mikroskopi av eggstokkreft kultur ovc316-XC. Kulturen inneholder to distinkte populasjoner med hensyn til trypsin følsomhet. Venstre panel: en tidlig passasje kultur ubehandlet (venstre), etter 10 min trypsin behandling (i midten), og etter trypsin-sensitive celler ble fjernet (til høyre). Høyre panel: Tumor dannelse etter transplantasjon av trypsin-resistente (TR) og trypsin-sensitiv (TS) celler i SCID-beige mus. Tumordannelse ble evaluert 3 måneder etter inokulering. TIC TR: 1/185, TIC TS: 1/109. Chi-kvadrat = 0,0524. C) Immunofluorescensanalyse for en human-spesifikke mitokondriell (Mx) markør, markøren kreft CEA, epiteliale markør E-cadherin, og den mesenchymale markør laminin i klonale kulturer avledet fra ovc316-XC. Klonale kulturer inneholde humane kreftceller med enten epitel (øvre panel), mesenchymale (midten) eller begge fenotyper (E /M hybrid klone, lavere). D) Tumor dannende evner etter transplantasjon av 10
5 E, M, eller E /M celler i SCID-beige mus. Tumordannelse ble evaluert 4 måneder etter inokulering. E) xenografttumorer avledet fra E /M hybrid kloner. Det humane opprinnelse av tumorceller er vist ved farging for en human bestemt mitokondrier markør (grønn). Farging av epitel antigen AE1 /3 og tumorantigenet CEA viser fenotypisk heterogenitet i tumorer som er avledet fra klonal E /M-kulturer. Laminin-uttrykk er i stor grad begrenset til vaskulariserte regioner. F) H E farging av en xenograft avledet fra en ovc316-XC E /M klone og fra en pasient biopsi (ovc316-biopsi) som viser at xenografter fra likne histologi av humane tumorer
in situ
. Målestokken er 40μm.
Med tanke på fenotypiske heterogenitet av eggstokkreft, er målet med vår studie var å isolere ulike celle undergrupper av primær eggstokkreft kulturer og teste dem for parametere som har vært forbundet med kreft stamceller, inkludert spredning, pluripotency, og tumorgenisiteten. Lysmikroskopi analyse av xenograft kulturer (f.eks ovc316-XC) viste karakteristiske epiteliale undergrupper som inneholdt polymorfe legemer, som også blir uttrykt store mengder av den ekstracellulære matriks-protein laminin ved grenseflaten til omkringliggende ikke-epiteliale celler. I kulturen de epiteliale celle undergrupper viste høyere motstand mot trypsin behandling (figur 1B). Vi skilles cellene fra tidlig passasjer. (P 6) i to fraksjoner basert på trypsin motstand, og testet sine tumorigenicity i SCID-beige mus, men ingen forskjell i tumordannende evne ble observert (figur 1B, panel høyre)
som gjort tidligere i en tidligere studie som analyserte cellulære motstand mot onkolytiske adenovirus [33], etablerte vi 100 klonale cellekulturer som stammer fra tidlig passasje ovc316-XC-celler. Kloner ble ekspandert og analysert for human-spesifikke og kreftmarkører (for å utelukke tilstedeværelse av muse-stromale celler), så vel som epithelial og mesenkymale markører (figur 1C). I alt 20% av de resulterende kulturer ble begrenset til en epitelial fenotype (E-cadherin positiv; «epitelial klone»), mens 19% var mesenchymale (laminin positiv, «mesenchymale klone»). De resterende 61% av klonale kulturer inneholdt både epiteliale og mesenchymale celler, i tillegg til celler som var positive for begge epiteliale og mesenkymale markører (figur 1C). Vi kalte disse cellene epitelceller /mesenchymale (E /M) hybridceller. Klonale epiteliale og mesenkymale kulturer hadde begrenset langsiktig proliferativ potensial (20-25 passasjer mesenchymale, 20-40 passasjer epitelceller kulturer henholdsvis). Spesielt under aging, celler i en av de 20 epiteliale kloner tapt membran E-cadherin og claudin 7 og kjøpte mesenchymale transkripsjon variant av P120 catenin [33], noe som indikerer at det gjennomgikk en EMT (figur S1).
Viktigere, bare kulturer inneholdende E /M-celler var i stand til å danne svulster i SCID-beige mus innen 4 måneder ved 10
5-celler (passasje 6) ble injisert (figur 1D). Svulster vises fenotypiske heterogenitet, inneholdt tumor stroma og ble vaskularisert (figur 1E). Total, histologi av tumorer avledet fra transplanterte klonal E /M-celler var lik den til pasienten tumor (figur 1F). Seriell transplantasjon av celler avledet fra disse tumorene ga også opphav til nye tumorer (data ikke vist). Betydelig, viser denne undersøkelsen at en enkelt celle kan danne en klone som er deretter i stand til å danne en heterogen svulst. Dette indikerer at den opprinnelige cellen var et potensielt kreft stamcelle, med evnen til å differensiere, fornye seg selv, og danne en svulst. Til sammen viser disse data at primær eggstokkreft kulturer er fenotypisk heterogen og at tumor initiere celler ser ut til å ha egenskaper av mesenchymal og epitel (E /M-celler).
celler i periferien av trypsin-resistente delmengder inneholde epitelial-mesenchymale hybrid (E /M) celler som co-flekken med stamcellemarkører
Etter å ha funnet en potensiell kobling mellom tumorigent kreft stamcelleliknende og epitel /mesenchymale trekk på klonale kulturer fra ovc316-XC, vi utførte analyser immunfluorescens av de primære eggstokkreft kulturer (som stammer fra biopsier eller xenotransplantater) med et antall av epitelial og mesenkymale markører (figur 2). Vi fokuserte vår analyse på celler som ble isolert fra transplantater og hadde bare (passasje 0/1) eller nylig (passasjer 6-10) tilpasset vev kultur, og inneholdt store mengder av trypsin-resistente undergrupper. Disse undergrupper farget positivt for epitel-markører E-cadherin, claudin7 og EpCAM på sidecellemembraner (figur 2A, B). Cellene som omgir epiteliale undergrupper var negative for disse markørene på sine laterale membraner og farget for mesenchymale proteiner vimentin og laminin. Videre analyser for E-cadherin viste fenotypiske mangfoldet i ovc316-XC kulturer. Det ble observert to typer celler som lokaliserte E-cadherin til sine membraner, membran E-cadherin
høy og membran E-cadherin
lav (figur 2A, nedre panel, sett # 2 og 3 #). En tredje type av celler som grenser til membran E-cadherin
høy-celler inneholdt tydelig påvisbar E-cadherin i cytoplasma /kjernen (figur 2A, nedre panel, sett # 2). Cytoplasmatiske E-cadherin
høye celler også farget positivt for mesenchymale cellemarkører som laminin samt caldesmon-en (en myeloid markør), den endoteliale /endoteliale progenitor markører CD31, og VCAM-1 (figur S2A). E-cadherin
høy E /M-cellene uttrykte også høye nivåer av Angiopoietin reseptoren Tie2 (figur S2A, høyre panel). Spesielt, er Tie2 en markør for hematopoetiske stamceller som også er funnet på en rekke av epiteliale tumorer [34], [35].
A) Analyse av E-cadherin (grønn) og Laminin (rød) i eggstokkreft kulturer. Forstørrelse av merkede områdene vises nederst: A1) E-cadherin
negative celler uttrykker laminin. A2) epithelial /mesenchymale (E /M) hybrid celler: E-cadherin
lave celler viser hovedsakelig cytoplasma lokalisering av E-cadherin og høy uttrykk for laminin. E-cadherin
høye celler inneholder forhøyede membran E-cadherin nivåer og lavere mengder av laminin. A3) E-cadherin
positive celler har en økt cellestørrelse og opprettholde lavere nivåer av tydelig membran lokalisert E-cadherin enn E-cadherin
høye celler. Laminin uttrykk er nesten fraværende i E-cadherin
positive celler (øvre panel til høyre). B) Analyse for ytterligere epitel (grønn) og mesenchymale (rød) markører bekrefter eksistensen av E /M-hybridceller i ovc316-XC kulturer. Epitel markør
høye cellene er i umiddelbar nærhet til mesenchymale markør
høye celler og beis dobbel positiv i områder som inneholder kuler. I venstre og midtre panelet, merk at alle cellene er positive for vimentin og CD44. C) CD133 markerer områder som inneholder E-cadherin
høy og E-cadherin
lave celler. D) E-cadherin
høy og E-cadherin
lave cellene vise sterk co-merking med EMT-indusere Snail, Twist, og NGAL. Målestokken er 40μm. Vist er bilder fra ovc316-XC. Immunofluorescensanalyse av ovc0117-PC, ovc0122-PC, ovc100506-XC, og ovc100728-XC avslørt lignende resultater.
Kulturer ved passering 0/1 viste generelt høyere samlet uttrykk for epitel og mesenchymale markører enn kulturer i passasjer 6-10 og dannet 3-dimensjonal celle konglomerater /kuler som inneholder E /M hybridceller i svært proliferative områder (figur 2B). E /M hybrid stadium av celler (innen kuler) ble bekreftet ved dobbelt farging med andre epiteliale markører (EpCAM, claudin7) og mesenkymale markører (N-cadherin, vimentin). Videre kuler farget for EpCAM og mesenchymale stamceller markør CD44. Spesielt, de fleste celler farget for EpCAM, CD44, og vimentin (figur 2B), tyder på at EpCAM /CD44 signaler undervurdere den fenotypiske mangfoldet innen tidlig passasje eggstokkreft celler. Den beste diskriminering mellom forskjellige delmengder ble oppnådd med E-cadherin i kombinasjon med en mesenchymale markør eller CD44. Deretter brukte vi denne markøren kombinasjon for å karakterisere de fleste av de påfølgende forsøkene. Når analysert for E-cadherin og den antatte kreft stammen markør CD133, to subfractions av CD133-positive celler bli klart CD133
+ /E-cadherin
høy og CD133
+ /E-cadherin
lave celler (Figur 2C). Denne observasjonen ytterligere støtter rollen til E-cadherin som en potensiell diskriminerende markør for kreftcelleundergrupper. Cellene i E /M cellepopulasjon (spesielt E-cadherin
lave celler) uttrykte også andre markører som er karakteristisk for stamceller, inkludert Nanog, okt 4, og Sox2 (figur S2B). E /M celler, spesielt celler i kuler, var også svært positivt for EMT indusere sneglen, Twist og NGAL (figur 2D). Videre fant vi også at celler som var lav i membran claudin 7 overveiende lokalisere beta-catenin til cytoplasma /kjerne (figur S2C). Overgang av beta-catenin fra cellemembranen til kjernen er en tidlig hendelse i EMT
Totalt immunofluorescence studier indikerer at det finnes to CD133
+ fraksjoner.; i) membran E-cadherin
høy og ii) cytoplasmatiske E-cadherin
høy /membran E-cadherin
lave celler. Cytoplasmatiske E-cadherin
høy /membran E-cadherin
lave mene bærer trekk av andre celle linjer og derfor mest sannsynlig, representerer primitive stamceller eller stamceller.
Endring av fenotype, EMT og differensiering
in vitro
: flowcytometri studier
for å kvantifisere antall celler med epiteliale og mesenkymale fenotyper i dyrkede celler, ansatt vi flowcytometri og startet ved å overvåke celler for epitel markør EpCAM samt overvåking for vimentin eller CD44 merking celler med mesenchymale attributter. Videre, for å avgrense fenotypiske endringer overtid som initiering av EMT, analyserte vi forskjellige passasjer av ovc316-XC-celler (figur 3). Disse studiene viste en rekke interessante observasjoner. i) I tumorcellesuspensjoner som ble nylig isolerte fra xenografter, de fleste av cellene var enten E /M celler (EpCAM
høy /vimentin
høy, EpCAM
høy /CD44
høy) eller E -cellene (EpCAM
høy /vimentin
lav, EpCAM
høy /CD44
lav), men på passasjen 1 bare E /M celler kunne påvises, noe som indikerer at majoriteten av celler hentet fra xenografter som tilpasser seg vev kultur er E /M (figur 3A). Dette innebærer at selv ved tidlig passasje, kulturer ikke i tilstrekkelig grad reflekterer den cellulære sammensetning av tumoren
in situ
. Passage en inne EpCAM
høye /CD44
høy /vimentin
høye og EpCAM
høy /CD44
lave /vimentin
lave celler. ii) Viktigere under kultur av celler i MEGM inneholder vekstfaktorer /FBS (se passasjer 1, 5, 7, 20), både EpCAM
høy /CD44
høy /vimentin
høy eller EpCAM
høy /CD44
lav /vimentin
lave typer celleforsvant og ble erstattet av EpCAM
lav /CD44
høye /vimentin
høye celler. Dette viser at E /M celler differensieres til mesenchymale celler
in vitro
i en EMT-aktig måte. iii) Flertallet av CD133
+ celler er E /M hybridceller. Etter aging i kultur ovc316-XC-celler raskt miste CD133 uttrykk samtidig med tap av epitelceller funksjoner.
A) Triple-farge flowcytometri analyse av xenograft /biopsicellesuspensjoner og dyrkede celler
in vitro
på ulike passasjer. Venstre panel: EpCAM /CD44 /CD133. Høyre panel: EpCAM /vimentin /CD133. B) Passage 1 og 5-celler ble utsatt for 14 dagers vekstfaktor /FCS sult og deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri. Vist er data fra ovc316-X og ovc316-XC. Funnene ble bekreftet på cellesuspensjoner fra biopsier og primærkulturer (ovc100506-biopsi, ovc100506-PC, ovc100728-biopsi, og 100914). C) Immunofluorescensanalyse av passasjen 3 og 18 kulturer av ovc316-XC. Celler i tidlige passasjer (passage 3) har forhøyede nivåer av E-cadherin og laminin i forhold til passasjen 18. Cellene størrelser er økt og sfære-vekst i høy celletetthet blir markert redusert i høy passasjer. Andel side befolknings (SP) positive celler er vist nedenfor. Målestokken er 40μm. D) Svulstdannelse etter transplantasjon av ovc316-XC passasje 3 og 18 celler i SCID-beige mus (evaluert 4 måneder etter inokulering). TIC p3: 1/110, TIC p18: 1/744. Chi-kvadrat. 0.245
Vi fant også at for et antall passasjer sult kan stall differensiering og tap av epitel fenotype, mens nivåer av CD133 litt avta i løpet av denne prosessen (figur 3B). Total, vi fant at primær eggstokkreft kulturer vise mer sfære dannelse når de dyrkes uten vekstfaktorer (Figur S3).
Etter å ha identifisert E-cadherin som en markør i stand til å skille cellulære undergrupper, vi gjentok flowcytometri analyser med E -cadherin (Figur S3). Differensiering ble også gjenspeiles i en reduksjon i nivåene av E-cadherin og laminin etter passaging. Mens lav passasje kulturer inneholdt et høyt antall av kuler, E-cadherin
høy-celler, og for store mengder av laminin, viste høy gjennomgangsceller markert redusert sfære vekst og lave nivåer av disse proteiner, mens cellestørrelsen øket (figur 3C). Dette ble også bekreftet i flowcytometri studier av passasjer 1, 3, og 7 (fig S3A-C). Disse studiene viser at mesenchymale (E-cadherin
negative /lav) sub-fraksjonen øker under aging og samtidig EMT. CD133
+ celler var svært positive for CD44 (figur S3A). Vi har også analysert membran Tie2 i sammenheng med E-cadherin (figur S3b). Ved immunofluorescens-analyse, Tie2-celler har en epitelial fenotype og er lavere i CD44 enn CD133
+ -celler. Spesielt, er en sammenheng mellom E /M fenotype, CD133 /CD44-positivitet, og tumorgenisiteten også støttet av flowcytometri analyse av klonal kulturer (Figur S3C). Kun E /M-kloner inneholdt betydelige mengder CD133
+ celler med forhøyet uttrykk av CD44 (og som vist tidligere, bare E /M-kloner dannet svulster). Tapet av «stamcelle» funksjoner i løpet av aging gjenspeiles også ved reduksjon av den del av side populasjon (SP) celler fra 7,8 ± 0,5% ved passasje 3) til 2,1 ± 0,3% i passasjen 18 (figur 3C). SP-celle-fenotype er blitt forbundet med kreft stamceller i tidligere studier av eggstokkreft [36]. Endelig tap av CD133
+ og E /M-celler korrelerte med en redusert evne til å danne tumorer (figur 3D).
Totalt, ble det observert en slående forskjell fra fenotyper mellom cellene
in vivo
og
in vitro
. Celler som er tilpasset vev kultur var CD133
+ E /M celler. Etter aging E /M celler differensieres til mesenchymale celler i en EMT samme måte. Denne prosessen er ledsaget av en reduksjon av tumorigenitet.
Tilstedeværelse av E /M celle undergrupper
in situ
Tatt i betraktning at eggstokkreft kulturer, spesielt ved sene passasjer, bare dårlig reflektere fenotype av svulster
in situ
, vi fokusert vår immunfluorescens og flowcytometri analyser på deler av tumor biopsier eller xenografter, eller cellesuspensjoner innhentet av collagenase fordøyelsen av svulster (figur 4). Immunfluorescens-analyser av seksjoner fra xenotransplantater høstet ved uke 10 etter tumorcelletransplantasjon (figur 4) eller deler av pasientens biopsier (tabell S1, fig S4) viste at svulster
in situ
ha klynger av E /M-celler (EpCAM
+ /vimentin
+) samt klynger av epitelceller (E-cadherin
+ /vimentin
-) (Figur 4A). I xenotransplantater ble reder av E /M og epitelceller omgitt av lag av laminin. Vi har også observert costaining av E-cadherin og Tie2 (figur 4B). CD133
høye celler (blå) er Tie2
lav og E-cadherin
lav (figur 4B, nedre panel). Et interessant mønster ble observert når dobbelt farging med E-cadherin og CD133 som CD133-positive celler ble funnet på svulsten periferien, i områder med aktiv tumorvekst (figur S5a). Spesielt ikke alle CD133
+ celler var E /M celler. Innenfor CD133
+ celler, fant vi to undergrupper av E /M-celler som beskrevet tidligere for in vitro-studier (figur 4C, større forstørrelse i figur S5b). Interessant CD133
høy /membran E-cadherin
lav undergruppe
in situ
viste tilstedeværelse av E-cadherin innen cytoplasmatiske vesikler mer tilsynelatende enn
in vitro
. De oppnådde hjelp xenografttumorer resultatene var representative for farging av tumor seksjoner fra ni ulike pasienter (tabell S1, figur S4).
A) Eksistens av E /M hybridceller
in situ
. E-cadherin
+ /vimentin
+ celler er til stede biopsier og tumorxenotransplantater. Vist er bilder av ovc316-biopsi og ovc316-X. Lignende farging ble funnet for ovc100506-biopsi /ovc100506-X, ovc100728-biopsi /ovc100728-X, og ovc100914-biopsi /ovc100914-X. B) Korrelasjon av E-cadherin (grønn) og Tie2 (rød) positivitet i eggstokkreft biopsier. CD133
høye celler (blå) er Tie2
lav og E-cadherin
middels. Vist er bilder av ovc316-biopsi og ovc316-X. Lignende farging ble funnet for ovc100506-biopsi /ovc100506-X, ovc100728-biopsi /ovc100728-X, og ovc100914-biopsi /ovc100914-X. C) CD133
høye celler har lave nivåer av membran E-cadherin. E-cadherin
høye cellene vise punctated membran CD133 farging. Vist er bilder av ovc316-biopsi og ovc316-X. Lignende farging ble funnet for ovc100506-biopsi /ovc100506-X, ovc100728-biopsi /ovc100728-X, og ovc100914-biopsi /ovc100914-X. Målestokken er 40μm. D-F) Triple-farge strømningscytometri-analyse av ovc316-X for epitel-markører (x-akse), mesenchymale funksjoner (y-akse), og for kreftstamcellemarkør CD133 (histogram plott). D) xenotransplantater inneholde epitelceller, epitelial /mesenchymale (E /M) hybridceller og celler som er negative for alle markører. CD133
+ celler er nesten utelukkende i en E /M hybrid scenen basert på EpCAM /CD44 analyse. CD133
høye cellene er EpCAM
høy, CD44
høy og vimentin
lav. E) Utskifting av EpCAM med E-cadherin avslører høyere mangfold innen xenografter. CD44
høye celler er E-cadherin
lav /middels. CD133
+ celler er delt inn i to store sub-fraksjoner. Fraksjon 1: E-cadherin
lav /middels /CD44
høy og fraksjon 2: E-cadherin
høy /CD44
middels.
