Abstract
Bakgrunn
Achaete scute lignende 2 (Ascl2), en grunnleggende helix-loop-helix (bHLH) transkripsjonsfaktor, styrer skjebnen til tarm stamceller. Men rollen som Ascl2 i tykktarm kreft stamceller er fortsatt ukjent. Cellelinjen HT-29 (47,5 til 95% av CD133
+ befolkningen) og LS174T (0,45% av CD133
+ befolkningen) ble valgt for en undersøkelse av Ascl2 i tykktarm kreft stamceller etter genet knockdown av RNA interferens .
metodikk /hovedfunnene
Immunohistochemistry viste at Ascl2 ble betydelig økt i kolorektal adenokarsinomer. Nedregulering av Ascl2 bruker RNA interferens i dyrkede kolon adenokarsinom HT-29 og LS174T cellene redusert celleproliferasjon, kolonidannende evne, invasjon og migrasjon in vitro, og resulterte i veksten arrestasjonen av tumorxenotransplantater in vivo. Den Ascl2 protein nivå i CD133
+ HT-29 celler var betydelig høyere enn i CD133
– HT-29 celler. Ascl2 blokaden via shRNA forstyrrelser i HT-29 celler (shRNA-Ascl2 /HT-29 celler) resulterte i 26,2% av cellene flekker CD133
+, sammenlignet med 54,7% i kontroll shRNA-Ctr /HT-29 celler. Nivåene av «stemness» forbundet gener, så som CD133, Sox2, Oct4, Lgr5, Bmi1, og C-myc, ble signifikant redusert i shRNA-Ascl2 /HT-29 og shRNA-Ascl2 /LS174T celler in vitro, så vel som i den tilsvarende svulst xenograft (CD133 ble ikke utført i shRNA-Ascl2 /LS174T celler). Den shRNA-Ascl2 /HT-29 celler hadde hemmet evner å danne tumorspheres sammenlignet med kontrollgruppen. De mikroRNA (mirnas) mikromatriser, identifisert 26 oppregulert mirnas og 58 nedregulert mirnas i shRNA-Ascl2 /HT-29 celler. Expression nivåer av la-7b, miRNA-124, miRNA-125b, miRNA-17, miRNA-20a og miRNA-302b, er involvert i reguleringen av «stemness», ble kvantifisert med qPCR, som bekreftet sin identitet. Restaurering av miRNA-302b, via sin mimikk, førte til restaurering av shRNA-Ascl2 /HT-29 «stemness» egenskaper, inkludert tumorsphere dannelse og «stemness» forbundet gener nivåer, og utvinningen av mobilnettet atferd, inkludert kolonidannende evne , invasjon og migrasjon in vitro.
Konklusjon /Betydning
Ascl2 kan være et potensielt mål for hemming av tykktarmskreft stamceller, og funksjoner gjennom en MIR-302b-relatert mekanisme.
Citation: Zhu R, Yang Y, Tian Y, Bai J, Zhang X, Li X, et al. (2012) Ascl2 knockdown Resultater i tumorvekst Arrest av miRNA-302b-Related Hemming av Colon Cancer stamceller. PLoS ONE 7 (2): e32170. doi: 10,1371 /journal.pone.0032170
Redaktør: Ilya Ulasov, University of Chicago, USA
mottatt: 19 oktober 2011; Godkjent: 21 januar 2012; Publisert: 23 februar 2012
Copyright: © 2012 Zhu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av staten Foundation for naturvitenskap i Folkerepublikken Kina 81000154 (til YY) og Natural Science Foundation prosjekt CQ CSTC 2008BA5034 (til RW). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC), den tredje største dødsårsaken av kreft på verdensbasis og en ledende årsak til sykelighet og dødelighet i utviklede land [1], er en stor terapeutisk utfordring for kreft. Nylig har kreft stamcelle (CSC) hypotese er foreslått for å forklare den funksjonell heterogenitet og karsinogenese av kreft. Ifølge denne modellen, en subpopulasjon av kreftceller, som oppviser stammer lignende egenskaper, oppretttumordannelse, metastase, og resistens overfor terapi [2] – [5]. I denne forbindelse ville cscs forventes å ha en stamcelle-lignende /progenitor-fenotypen (vanligvis referert til som «stemness»). I tillegg har flere studier undersøkt proteinkodende gener og deres produkter som deltar i stemness vedlikehold og tumorigenicity av tykktarmskreft stamceller [6] – [8]. Det er derfor viktig å identifisere de reguleringsmekanismer og signalveier som er involvert i kreft i tykktarmen forløperceller for å utvikle nye reagenser for å målrette den ildfaste tykktarmskreft progenitorceller befolkning [9].
Achaete scute liknende 2 (Ascl2) en grunnleggende helix-loop-helix (bHLH) transkripsjonsfaktor, er et nedstrøms mål av Wnt signal i tarm stamceller. In situ hybridisering viste Ascl2 ekspresjon på basis av små og store tarm krypter, men en mangel på ekspresjon i andre normale vev, bortsett fra placenta [10]. De kombinerte resultatene fra disse gevinst-og tap-av-funksjon eksperimenter antyder at Ascl2 styrer skjebnen til tarm stamceller [11]. Flere grupper har vist at Ascl2 er overuttrykt i kolorektal kreft [10], [12], [13]. Videre Ascl2 over-ekspresjon har potensial til å forskyve hierarkiet av stamceller og forløperceller i levermetastaser som resulterer i selvfornyelse i stedet for differensiering, potensielt påvirker den kliniske adferd av disse svulstene [13]. Dermed kan Ascl2 være en regulerende faktor som styrer skjebnen til tykktarmskreftstamceller. I løpet av det siste tiåret, har en rekke utviklingsveier som regulerer cscs klarlagt [14] – [17]. Imidlertid gjen rolle Ascl2 i tykktarm kreft stamceller ukjent.
cellelinjen HT-29 har en CD133
+ befolkning på 47,5 til 95% i litteraturen [18], [19] og isolerte CD133
+ -celler fra HT-29 colon cancer-cellelinjen viste en høyere tumorfremkallende potensiale enn CD133
– celler in in vivo tumordannelse analyse ble [20]. Den CD133 protein ble først anerkjent som en overflatemarkør for hematopoietiske stamceller [21], senere ble det brukt til å gjenkjenne kreft stamceller i mange faste tumorer som oppstår i for eksempel bryst [22], bukspyttkjertel [23], lever [ ,,,0],24] og tykktarm [18], [19]. Den cellelinje LS174T har en CD133
+ populasjonen av 0,45% i litteraturen [20] og 0,1% i våre forsøk (data ikke vist). Dermed HT-29 og LS174T celler ble valgt for en undersøkelse av Ascl2 i tykktarm kreft stamceller etter genet knockdown av RNA-interferens.
microRNAs (mirnas) er viktig som post-transcriptional regulatorer av genuttrykk og delta i flere biologiske funksjoner, inkludert cellulær proliferasjon, differensiering og apoptose [25]. mirnas også bidra til å bevare stemness av embryonale stamceller og menneskelige cscs [26] – [28]. Undersøkelse av funksjon av Ascl2 på tykktarm kreft stamceller og miRNA uttrykk profiler er avgjørende for å belyse hva som kjennetegner tykktarm kreft stamceller, som vil være til nytte utvikling av nye medikamenter eller nye terapeutiske metoder som er rettet mot tykktarmskreft stamceller. Videre vil det gi ny innsikt i metoder for å utrydde tykktarmskreft på grunn av sannsynligheten for at utryddelsen av tykktarm kreft stamceller vil være et viktig skritt i å oppnå en kur for kreft i tykktarmen.
I denne rapporten viser vi selektiv blokade av Ascl2 i HT-29 og LS174T cellene kan hemme cellevekst, invasjon og migrasjon in vitro, og føre til vekst arrest in vivo, som er delvis relatert til miRNA-302b-relatert hemming av «stemness «av tykktarmskreft stamfar celler basert på eksperimenter av shRNA-Ascl2 /HT-29 transfektert med miRNA-302b ligne. Disse resultatene indikerer at Ascl2 kan være et potensielt mål i tykktarm kreft stamceller for utvikling av nye behandlingsformer for utrydding av tykktarm kreft.
Materialer og metoder
Cell kultur
Menneskelige kolon adenocarcinom-cellelinjene HT-29 og LS174T ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC) og ble opprettholdt i McCoys 5A medium (Sigma, USA) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS; HyClone, USA) ved 37 ° C og 5% CO
2, med mediet skiftet annenhver dag. Celler ble passert på 80% samløpet og sådd ved 30% samløpet for vedlikehold av optimale prolifererende forhold.
RNA interferens
sekvens, CCGCGTGAAGCTGGTGAAC, målretting Ascl2 (shRNA-Ascl2 /EGFP) [11 ] ble dannet fra dupleks DNA bestående av 5′-CACCGCCGCGTGAAGCTGGTGAACTTCAAGACGGTTCACCAGCTTCACGCGGTTTTTTG-3 «, 5′-AGCTCAAAAAACCGCGTGAAGCTGGTGAACCGTCTTGAAGTTCACCAGCTTCACGCGGC-3».
A pGenesil-1,1 ble anvendt uten innsats for kontroll (shRNA-Ctr /EGFP). Herdet DNA-duplekser ble klonet inn i plasmidet av pGenesil-1,1 spaltet med restriksjonsenzymet Eco31I. HT-29 og LS174T celler ble transfektert med shRNA-Ascl2 /EGFP eller shRNA-Ctr /EGFP vektor, og deretter valgt med 0,8 mg /ml G418 for HT-29 transfektert celler og 0,4 mg /ml G418 for LS174T transfekterte celler, som begynner 48 timer etter transfeksjon. To uker senere ble cellene opprettholdt i 0,4 mg /ml G418 for HT-29-transfekterte celler og 0,2 mg /ml G418 for LS174T celler transfektert inntil tre uavhengige stabilt transfekterte kloner ble etablert. RNA-interferens var stabil gjennom hele utstrekningen av forsøkene under seleksjonstrykk på 0,4 mg /ml G418 for HT-29-transfekterte celler og 0,2 mg /ml G418 for LS174T transfekterte celler i kulturmediet.
Proliferation Assay
Celleproliferasjon ble undersøkt på dagene 1, 2, 3 og 4. Isolerte celler ble sådd på en 10 x
4 celler /brønn i 96-brønners plater (Corning, USA) i et sluttvolum på 100 ul av kultur medium per brønn. På hvert tidspunkt ble 5 mg /ml MTT (Sigma, USA) tilsatt til kulturmediet (20 ul /brønn) og inkubert i ytterligere 4 timer ved 37 ° C i 5% CO
2 atmosfære for å tillate MTT til omdannes til formazankrystaller. Etter dette ble de formazankrystaller solubilisert med 150 ul DMSO (Sigma, USA) i 10 minutter. Absorbansen ble målt ved en bølgelengde på 490 nm med en mikroplateleser (Thermo, USA). Alle analyser ble gjentatt tre ganger.
Colony Forming Assay
Celler ble sådd ut i en tetthet på 1000 celler per plate (35 mm, Corning, USA), og deretter inkubert ved 37 ° C under 5 % CO
2. Mediet ble skiftet hver 3-4 dag. På dag 20 ble cellene farget med Giemsa og observert under en invertert mikroskop. Antallet kolonier på hver plate ble tellet. Eksperimentet ble kopiert tre ganger, og uttrykt som den gjennomsnittlige antall kolonier per plate.
In Vitro Assay Invasion
in vitro invasjon evne av cellene ble målt ved anvendelse av Transwell kamrene belagt med Matrigel (Corning, USA) assay. Celler ble sådd ut i 100 pl i en tetthet på 1 x 10
6 celler /ml med 1% FBS i det øvre kammer og det nedre kammer ble fylt med 600 ul av kulturmedium med 20% FBS som et kjemotiltrekkende. Transwells ble deretter inkubert ved 37 ° C under 5% CO
2 i 48 timer for å tillate cellene å invadere. Ved slutten av inkubasjonen ble cellene på oversiden av Matrigel-belagte filter fjernes ved å gni med en bomullspinne. Celler som hadde invadert gjennom Matrigel-belagte filter ble farget med krystallfiolett løsning. De invasive cellene som migrerte gjennom Matrigel-belagte filter til den nedre overflate ble tellet under et invertert mikroskop lys (Olympus, Japan), ved 200 x forstørrelse. Celler i fem randomiserte synsfelt på 200 × ble talt og uttrykt som gjennomsnittlig antall celler per synsfelt. Eksperimentet ble kopiert tre ganger.
Migration
HT-29, LS174T celler og deres transfektanter, til 90-100% konfluens i 6-brønners plater, ble dyrket over natten i serumfritt medium . Mediet ble byttet ut med PBS, og monolagene ble såret mekanisk ved hjelp av et sterilisert, enkel gjennomgang barberblad. Etter at såret ble cellene skylt to ganger med sterilisert PBS og inkubert i McCoys 5A medium inneholdende 10% FBS i 48 timer ved 37 ° C under 5% CO
2. Celler som hadde migrert fra såret kanten ble talt på 200 × forstørrelse ved hjelp av en omvendt lysmikroskop (Olympus, Japan). Celler i 5 tilfeldige synsfelt på 200 × og uttrykt som gjennomsnittlig antall celler per synsfelt. Eksperimentet ble kopiert tre ganger.
Tumorsphere-dannelsesanalyser
For tumorsphere formasjon, enkeltcellesuspensjoner ble suspendert i et Dulbeccos modifiserte Eagles medium /F12 (DMEM /F12, Hyclone, USA) supplert med B-27 (1 x, Gibco), 20 ng /ml epidermal vekstfaktor (EGF, Peprotech, USA), og 20 ng /ml basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF, Peprotech, USA), og deretter sådd ut i 24- brønn ultra-lav festeplater (Corning, USA) ved en konsentrasjon på 1000 celler per brønn. Platene ble analysert 7-10 dager senere for tumorsphere dannelse og ble kvantifisert ved hjelp av en invertert mikroskop (Olympus) 100 × og 400 × forstørrelser. For påfølgende kvantifisering av celle tall per tumorsphere, ble tumorspheres samlet inn med et 40 um sil (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) og disassociated med 0,25% trypsin /0,02% EDTA for å lage en enkelt celle suspensjon. De levedyktige celler ble deretter telt ved bruk av trypanblått eksklusjon.
In vivo tumorigenicity
Den shRNA-Ctr /HT-29, shRNA-Ascl2 /HT-29, shRNA-Ctr /LS174T og shRNA -Ascl2 /LS174T cellene ble resuspendert i 100 ul (1 × 10
6 celler) på 0,9% fysiologisk saltvann før injeksjon. Seks uker gamle BALB /c nakne hannmus ble kjøpt fra Animal Facility of Research Center of Third Military Medical University og vedlikeholdes under standardbetingelser. Alle forsøkene ble utført med godkjenning av dyrestudier Ethics Committee av Third Military Medical University (tillatelse Nummer: sw 20090713). Mus ble subkutant inokulert med 1 × 10
6 isolerte celler på begge flankene (venstre shRNA-Ascl2 /HT-29 eller shRNA-Ascl2 /LS174T celler og riktig med shRNA-Ctr /HT-29 eller shRNA-Ctr /LS174T celler, henholdsvis). Tumorstørrelsene ble målt ved hjelp av målepunktene. Tumor størrelser ble beregnet ved hjelp av formelen: (lengde × bredde
2) /2. Musene ble avlivet ved cervikal dislokasjon på dag 20 etter inokulering. Grafts ble fjernet, dokumentert ved fotografering og kreft vekter måles. Svulster ble delt inn i to grupper, og enten fast med 10% bufret formalin eller konservert i -80 ° C.
Flowcytometri celle sortering og flowcytometri analyse
Ved isolering av CD133
+ og CD133
– populasjoner i HT-29-celler, enkeltcellesuspensjoner ble inkubert med fykoerytrin (PE) -konjugert anti-humant CD133 antistoff (AC133 klon, Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA) og FcR-blokkerende reagens ( Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA) i fargeløsning inneholdende 0,5% BSA og 2 mM EDTA i 10 minutter ved 4 ° C. Isotype-matchet mus immunoglobulin G1 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA) tjente som en negativ kontroll. Celler ble analysert og sorteres med en fluorescens-aktivert cellesorterer (FACS) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). For positive og negative befolkning, topp 10,8% lyst farget celler eller de nederste 7,6% svakt fargede celler ble valgt, henholdsvis.
Immunhistokjemi
Immunhistokjemiske studier av Ascl2 ble utført på humant kolon mukosa (n = 11), colon carcinoma (n = 11) og tumorxenografter fra nakne mus (n = 6), den humane tykktarm mucosa og cancervev var fra samme pasient, og alle pasienter tilgjengelig informert samtykke. Parafin ble fjernet fra formalinfiksert, parafininnebygd vev; Prøvene ble så blokkert og inkubert med spesifikke antistoffer over natten ved 4 ° C. Antistoffet ble påvist ved SP9002 Histostain ™ -Plus Kits (Zymed Co., USA). Alle deler ble kontra med hematoksylin. Muse Ascl2 monoklonalt antistoff (tabell S1) ble anvendt ved en fortynning på 1:100. Alle forsøkene ble utført med godkjenning av studier Ethics Committee of Southwest Hospital, Third Military Medical University (tillatelse Nummer: sw 20090713).
immunfluorescens farging
HT-29 og LS174T celler, kultivert på steriliserte dekkglass, ble farget med Ascl2 primært antistoff (tabell S1), etterfulgt av inkubering med geite-anti-mus-IgG-R (Santa Cruz Biotechnology, Inc., California USA), kontra med DAPI, og endelig visualisert under en laser scanning konfokal fluorescerende mikroskop (Carl Zeiss, Inc. Tyskland).
real-time PCR-analyse
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Første kjede-cDNA ble syntetisert ved anvendelse av primeScript ™ RT enzym blande I, oligo dT-primere og tilfeldige heksamerer (Takara, Japan). For å bestemme fold endringer i hvert gen, ble real-time PCR utføres ved hjelp av den første cDNA, forover og bakover primere, og SYBR premix Ex Taq ™ Grønn II (Takara, Japan). Primersekvensene er oppsummert i Tabell S2. Reaksjon og signaldeteksjon ble målt ved real-time PCR system (BioRad, USA). Ekspresjonsnivåer ble beregnet som den relative uttrykk forhold sammenlignet med β-aktin. Disse sanntids PCR ble utført in triplo uavhengig av hverandre.
Western blot-assay
Cellelysater eller den homogeniserte vev fra tumorxenotransplantater oppløst i SDS-prøvebuffer ble separert ved SDS-PAGE og overført til nitrocellulose membran. Den β-aktin ble benyttet som en kontroll. Membranen ble probet med spesifikt primært antistoff over natten ved 4 ° C (de primære antistoffene er oppsummert i tabell S1), etterfulgt av inkubasjon med HRP-konjugert sekundært IgG (H + L) antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Inc., California USA) . Blottene ble behandlet med Immobilon ™ vestlig kjemiluminescerende HRP-substrat (Milipore, USA) og analysert ved gel-bildeanalysesystem (Bio-Rad, USA).
miRNA mikromatriseanalyse og mirnas kvantifisering ved hjelp av kvantitativ PCR
den sjette generasjonen av menneskelige miRNA mikromatriser (Exiqon, Danmark) ble brukt til å sammenligne miRNA uttrykket profiler mellom shRNA-Ctr /HT-29 og shRNA-Ascl2 /HT-29 celler. Den microarray inneholder mer enn 1891 oppfangingsprober, som dekker alle menneskelige, mus og rotte mirnas kommentert i miRBase 16.0. Total RNA ble ekstrahert fra 1 x 10
7 stabilt transfektert shRNA-Ctr /HT-29 og shRNA-Ascl2 /HT-29 celler ved anvendelse av TRIzol reagens (Invitrogen, USA). RNA isolering, kvalitetskontroll, merking og hybridisering ble utført ved Shanghai KANCHENG biochip selskapet i henhold til protokollene i miRNA microarray system. Arrays ble skannet med en microarray Scanner, og de skannede bildene ble deretter importert til GenePix Pro 6.0-programvare (Axon) for grid justering og data utvinning. Replikert mirnas ble gjennomsnitt og mirnas med intensiteter 50 i alle prøvene ble valgt for beregning av normaliseringsfaktor. Uttrykt data ble normalisert ved bruk av Median normalisering. Etter normalisering ble forskjellig uttrykt mirnas identifisert gjennom Fold Endre filtrering. Hierarkisk clustering ble utført ved hjelp av MEV programvare (v4.6, TIGR).
For mirnas qPCR validering, er primer sekvenser for mirnas oppsummert i tabell S3. RNA isolering, kvalitetskontroll, cDNA syntetisere og qPCR ble utført ved Shanghai KANCHENG biochip selskapet i henhold til protokollene. En t-test ble brukt til å identifisere forskjellig uttrykt mirnas mellom shRNA-Ctr /HT-29 og shRNA-Ascl2 /HT-29 sammenligninger.
Transfeksjon av miRNA etterligner eller miRNA hemmere i shRNA-Ascl2 /HT-29 cellene
shRNA-Ascl2 /HT-29-celler ble transfektert 24 timer etter å ha blitt sådd i 6-brønns plater. Mirna ligner (100 pmol) eller miRNA hemmere (200 pmol) (Guangzhou Ribobio Co, Ltd Guangzhou, PR Kina) i 250 mL serumfritt, antibiotika-free medium ble blandet med 5 mL av Lipofectamine 2000 transfeksjon reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) oppløst i 245 ul av det samme medium og tillatt å stå ved romtemperatur i 20 min. De resulterende 500 ul transfeksjon løsninger ble deretter tilsatt til hver brønn inneholdende 1,5 ml medium. Seks timer senere ble hver brønn erstattet med 2 ml friskt medium supplert med 10% FBS. De forbigående transfekterte cellene ble oppsamlet etter ytterligere 48 timers inkubering for videre eksperimenter, inklusive tumorsphere formasjonen, real-time PCR, western blot analyse, kolonidannelsesbestemmelsen, invasjon assay og migrasjonsanalyse. De forbigående transfekterte shRNA-Ascl2 /HT-29 celler ved anvendelse av miRNA ligne negativ kontroll (100 pmol) eller miRNA inhibitorer negativ kontroll (200 pmol) ble anvendt som en kontroll.
Statistical Analysis
For kontinuerlige variabler, dataene ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik. Forskjeller mellom grupper ble estimert ved t-test og gjentatt tiltak ANOVA analyse. Alle forskjeller ble ansett som signifikante ved et nivå på p 0,05, meget signifikant ved nivået for p 0,01. Statistiske analyser ble utført av SPSS 13.0 for Windows programvarepakken.
Resultater
Ascl2 er overuttrykt i tykktarmskreft og tykktarmskreft cellelinjer, og Ascl2 innblanding i HT-29 og LS174T celler bemerkelsesverdig redusert dets ekspresjon
Immunhistokjemisk farging ble anvendt for å bestemme hvorvidt Ascl2 protein ble uttrykt i humane tarmslimhinnen og tykktarmskreft. Det ble observert en økning i Ascl2 protein ekspresjon i kjernen av tykktarmskreftceller av humane tykktarmkreftformer (figur 1B) sammenlignet med den spesifikke farving av Ascl2 protein ved kjernen av krypten basis celler fra normal tykktarmsslimhinne (figur 1A). Cellene med Ascl2 positiv farging i kjernen ble separert ved negativ farging celle nøyaktig i den normale krypten base (figur 1A). Den immunfluorescens farging viste at Ascl2 ble uttrykt hovedsakelig i kjernen av HT-29 celler, og svakt uttrykt i cytoplasma, mens Ascl2 ble uttrykt hovedsakelig i cytoplasmaet til LS174T celler, og svakt uttrykt i kjernen. Dens uttrykk mønster av Ascl2 i HT-29 og LS174T celler var uharmoniske, med de fleste av HT-29 og LS174T cellene er relativt svak for uttrykk (figur 1C). Western blot analyse viste at Ascl2 var til stede i begge tykktarmskreft cellelinjer HT-29 og LS174T celler (20 kDa i begge), men fraværende i mhcc-97L, en leverkreft cellelinje (figur 1D).
Ascl2 uttrykk er spesielt lokalisert ved kjernen i krypten basis celler av normal menneskelig kolon slimhinne (pilspiss) (A), B viser at Ascl2 er spesielt uttrykt ved kjernen av menneskelige tykktarmskreftceller i menneske tykktarm kreft vev (Original forstørrelse på toppanelet av A og B: x 200; Original forstørrelse på lav panel av A og B: x 400). Den immunofluorescerende farging indikerer Ascl2 ligger hovedsakelig i kjernen av HT-29-celler og cytoplasma av LS174T celler (C) (original forstørrelse: x 200). Western blot-analyse viser Ascl2 er til stede i HT-29 og LS174T celler, men fraværende i mhcc-97L-celler (D). Ascl2 innblanding i HT-29 og LS174T cellene resulterer i betydelig reduksjon av både Ascl2 mRNA analysert ved real-time PCR og proteinnivåer analysert ved western blot analyse i forhold til kontroll (β-aktin) (**: p 0,01) (E og F).
For å slå ned Ascl2 uttrykk i HT-29 og LS174T celler, celler ble transfektert med shRNA-Ascl2 /EGFP og shRNA-Ctr /EGFP vektorer, fire stabile-transfekterte cellelinjer ( shRNA-Ascl2 /HT-29, shRNA-Ascl2 /LS174T, shRNA-Ctr /HT-29 og shRNA-Ctr /LS174T celler) ble etablert. Ascl2 mRNA kvantifisert med real-time PCR ble redusert i shRNA-Ascl2 /HT-29 og shRNA-Ascl2 /LS174T celler sammenlignet med sine kontroller (figur 1E). En tilsvarende reduksjon i Ascl2 protein ble observert i shRNA-Ascl2 /HT-29 og shRNA-Ascl2 /LS174T celler sammenlignet med sine kontroller (figur 1F). Det var ingen signifikant forskjell mellom shRNA-Ctr /HT-29 og utransfekterte HT-29 celler, og mellom shRNA-Ctr /LS174T og utransfekterte LS174T celler, både Ascl2 mRNA og protein uttrykk (Figur 1E og 1F).
Silence of Ascl2 i HT-29 og LS174T celler førte til endringer i cellulære atferd
Colony formasjon analysen: shRNA-Ascl2 /HT-29 og shRNA-Ascl2 /LS174T celler utviklet færre kolonier etter 20 dager sammenlignet med deres kontroller (p 0,05) (figur 2A). Spredning analyse: De spredning forekomst av shRNA-Ascl2 /HT-29, shRNA-Ascl2 /LS174T og deres kontroller ble undersøkt ved hjelp av en MTT metode, i henhold til produsentens protokoll, fra dag 1 til 4 etter seeding. Som vist i figur 2B, var det signifikante forskjeller i vekstratene mellom shRNA-Ascl2 /HT-29 og HT-29 celler, og mellom shRNA-Ascl2 /HT-29 og shRNA-Ctr /HT-29 celler på dag 3 og 4, også mellom shRNA-Ascl2 /LS174T og LS174T celler, og mellom shRNA-Ascl2 /LS174T og shRNA-Ctr /LS174T celler på dag 3 og 4 (p 0,05). In vitro-analysen invasjon: Invasion analyser ble utført ved anvendelse av Matrigel-belagte Transwell kulturkamre. Etter 48 timers inkubering ble antallet av invaderende celler telles. Med shRNA-Ascl2 /HT-29-celler, 7 ± 3 celler pr felt (under 200 x forstørrelse ved hjelp av det inverterte mikroskop) invaderte gjennom membranen. Dette tallet var signifikant lavere enn den til utransfekterte HT-29-celler (37 ± 5) eller shRNA-Ctr /HT-29-celler (31 ± 6) (P 0,01). På samme måte, med shRNA-Ascl2 /LS174T celler, 84 ± 14 celler pr felt (under 200 x forstørrelse ved hjelp av det inverterte mikroskop) invaderte gjennom membranen. Dette tallet var signifikant lavere enn den til utransfekterte LS174T celler (292 ± 32) eller shRNA-Ctr /LS174T celler (296 ± 30) (P 0,01) (figur 2C). Migrasjon: Endelig 75 ± 10 shRNA-Ascl2 /HT-29 celler per felt (under 200 × forstørrelse) flyttet over skrapt kanten etter 48 timer. Dette tallet var signifikant lavere enn den til utransfekterte HT-29-celler (185 ± 15) eller shRNA-Ctr /HT-29-celler (195 ± 25) (p 0,05). 82 ± 9 shRNA-Ascl2 /LS174T celler per felt (under 200 × forstørrelse) flyttet over skrapt kanten etter 48 timer. Dette tallet var betydelig lavere enn for utransfekterte LS174T celler (177 ± 21) eller shRNA-Ctr /LS174T celler (173 ± 25) (p 0,05). (Figur 2D)
shRNA-Ascl2 /HT- 29 og shRNA-Ascl2 /LS174T celler har færre kolonier (*: p 0,05) (A), lavere vekstrater (*: p 0,05) (B), mindre invaderte celler gjennom Matrigel-belagte membran (**: p 0,05) (D), sammenlignet med sine kontroller (Original forstørrelse: × 200)
Ascl2 forstyrrelser ledet til in vivo vekst arrest av svulster
for å sammenligne vekstratene av shRNA-Ctr /HT-29 og shRNA-Ascl2 /HT-29 celler, shRNA-Ctr /LS174T og shRNA-Ascl2 /LS174T celler, i atymiske nakne mus, den shRNA-Ascl2 /HT-29 eller shRNA-Ascl2 /LS174T celler ble injisert i venstre flanke mens shRNA-Ctr /HT-29 eller shRNA-Ctr /LS174T celler ble injisert inn i den høyre flanke hhv. Tjue dager etter inokulering med hver sammenkoblede celler (shRNA-Ascl2 /HT-29 og shRNA-Ctr /HT-29 celler i figur 3A, eller shRNA-Ascl2 /LS174T og shRNA-Ctr /LS174T celler (resultater ikke vist)) i hver mus, henholdsvis alle mus (12/12, henholdsvis) utviklet tumorer. Tumorvolumene ble målt ved bruk av målepunkter ved forskjellige tidspunkter før døden, mens vekter ble bestemt etter døden. Volumet og massen i shRNA-Ascl2 /HT-29 eller shRNA-Ascl2 /LS174T tumor de var betydelig lavere enn for de shRNA-Ctr /HT-29 eller shRNA-Ctr /LS174T tumor (p 0,05) (figur 3B og 3C). Videre Ascl2 uttrykk i svulstvev fra shRNA-Ascl2 /HT-29 eller shRNA-Ascl2 /LS174T celler var betydelig lavere enn for shRNA-Ctr /HT-29 eller shRNA-Ctr /LS174T celler, som bestemmes av sanntid PCR og western blot analyse (figur 3D og 3E). Ascl2 ekspresjon i tumorvevet fra shRNA-Ascl2 /HT-29 eller shRNA-Ascl2 /LS174T celler var signifikant lavere enn den fra shRNA-Ctr /HT-29 eller shRNA-Ctr /LS174T celler, som vist ved immunhistokjemisk farging (figur 3F) .
Alle mus (6/6, henholdsvis) utvikle svulster 20 dager senere etter en × 10
6 shRNA-Ctr /HT-29 celler (høyre side og er merket med pil) og shRNA-Ascl2 /HT-29 celler (venstre side og merket som pilhode) blir inokulert i nakne mus (A), ble LS174T celler som ikke er vist. Svulsten volum (B) og masse vekt (C) i gruppen av shRNA-Ascl2 /HT-29 og shRNA-Ascl2 /LS174T celler er betydelig lavere enn gruppen av shRNA-Ctr /HT-29 og shRNA-Ctr /LS174T celler (*: p 0,05). Den mRNA (D) og protein (E) nivåer av Ascl2 i tumorvev utvikles fra shRNA-Ascl2 /HT-29 og shRNA-Ascl2 /LS174T celler er lavere enn i de tumorvev utviklet fra shRNA-Ctr /HT-29 og shRNA-Ctr /LS174T celler (**: p 0,01). Ascl2 farging i kjernen av kreftceller i tumorxenotransplantater fra shRNA-Ctr /HT-29 og shRNA-Ctr /LS174T celler er sterkere enn i kjernen av kreftceller i tumorxenotransplantater fra shRNA-Ascl2 /HT-29 og shRNA -Ascl2 /LS174T celler (F)
Ascl2 uttrykk i CD133
+ og CD133
-. HT-29 celler
flowcytometri analyse indikerte CD133 ble uttrykt i 58,1% av HT-29-celler, med 0,1% HT-29 celler ble detektert i den negative kontroll. 98,6% av cellene ble bekreftet å være CD133 positiv i den øverste 10,8% av CD133 positive HT-29 celler ved postsorting seleksjon, ble 98,1% av cellene bekreftet å være CD133 negativ i svakt 7,6% av CD133 negative HT-29-celler (figur 4A).
CD133 er uttrykt i 58,1% av HT-29 celler. 98,6% av cellene er bekreftet å være CD133 positive med post-sortering utvalg i topp 10,8% av CD133
+ HT-29 celler, er 98,1% av cellene bekreftet å være CD133 negativ med post-sortering utvalg i svakt 7.6 % av CD133
– HT-29-celler (A). Ascl2 proteinnivået i forhold til kontroll (β-aktin) i CD133
+ HT-29-celler er signifikant høyere enn det som i CD133
– HT-29-celler (*: p 0,05) (B). Det er en åpenbar nukleær farging av Ascl2 i CD133
+ HT-29-celler, men Ascl2 er nesten negativ i CD133
– HT-29-celler (C) (Original forstørrelse: x 200).
CD133
+ og CD133
– HT-29 celler ble analysert for å uttrykke Ascl2 bruker Western blot analyser. Den Ascl2 proteinnivå i forhold til kontrolldyr (β-aktin) i CD133
+ HT-29-celler var signifikant høyere enn det i CD133
– HT-29-celler (p 0,05) (figur 4B). Den CD133
+ og CD133
– HT-29 celler ble immunostained med anti-Ascl2 antistoff, viser en nukleær farging mønster av Ascl2 i CD133
+ HT-29 celler (den øvre delen av figur 4C), og en ubetydelig farging for Ascl2 i CD133
– HT-29 celler (lav panel av figur 4C)
den prosent av CD133
+ HT-29 celler og «stemness» markører var bemerkelsesverdig. redusert etter Ascl2 knockdown
observasjon at Ascl2 uttrykk var høyere i CD133
+ HT-29 celler enn i CD133
– HT-29 celler, førte til hypotesen om at Ascl2 protein er viktig for
