Abstract
Bakgrunn
gener som koder for fettsyre desaturasene (FADS1, 2 , 3) lokalisert ved kreft genomiske hotspot 11q13 locus er nødvendig for biosyntesen av 20 karbonflerumettede fettsyrer (PUFA) som er direkte eicosanoid forløpere. I flere kreftcellelinjer, FADS2 kodet Δ6 og Δ8 desaturation er ikke funksjonell.
metodikk /hovedfunnene
Analysere MCF7 celle fettsyrer med detaljert strukturell massespektrometri, viser vi at i fravær av FADS2 aktivitet, FADS1 produktet Δ5-desaturase driver å produsere 5,11,14-20:3 og 5,11,14,17-20:4. Disse PUFA mangler 8-9 dobbeltbindingen av eicosanoid signale forløpere arakidonsyre (5,8,11,14-20:4) og eikosapentaensyre (5,8,11,14,17-20:5). Heterologe uttrykk for FADS2 gjenoppretter Δ6 og Δ8-desaturase aktivitet og normal eicosanoid forløper syntese.
Konklusjon /Betydning
Tapet av FADS2-kodet aktiviteter i kreftceller slås normal PUFA biosyntese, slette endogen tilførsel av eicosanoid og nedstrøms docosanoid forløpere, og erstatte dem med uvanlige butylene-avbrutt fettsyrer. Hvis rekapitulert
in vivo
, normal eicosanoid og docosanoid cellesignale miljøet ville bli tømt og endret på grunn av reduksjon og erstatning av vanlige underlag med uvanlig underlag, med uforutsigbare konsekvenser for mobil kommunikasjon.
Citation : Park WJ, Kothapalli KSD, Lawrence P, Brenna JT (2011) FADS2 Funksjon Tap ved Kreft hotspot 11q13 Locus koplinger Lipid Signa Precursor Synthesis å Uvanlig eicosanoid fettsyrer. PLoS ONE 6 (11): e28186. doi: 10,1371 /journal.pone.0028186
Redaktør: Daniel Tomé, Paris Institute of Technology for Life, Food and Environmental Sciences, Frankrike
mottatt: 16 september 2011; Godkjent: 02.11.2011; Publisert: 30.11.2011
Copyright: © 2011 Park et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Disse forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Flere menneskelig cytogenetiske og fine kartleggingsstudier har pin- spiss HSA 11q13 locus som en stor sone for en rekke humane cancere [1], [2], [3], [4], [5]. Tallrike genetiske mekanismer er blitt rapportert, inkludert 11q13 slettinger, tap av heterozygositet, translokasjoner og allelisk amplifikasjon [3], [5]. Fettsyre desaturase cluster (FAD), kodet av gener
FADS1
,
FADS2
, og
FADS3
, lokalisere innenfor en 100 kb region på menneskelig kromosom 11q12-13.1 [ ,,,0],6], [7]. FADS2 og FADS1 kode for kritiske enzymer for langkjedet flerumettet fettsyre (LCPUFA) biosyntese, innføre dobbeltbindinger mellom spesifikke karbonatomer. Omega-3 (ω3 eller n-3) og omega-6 (ω6 eller n-6) PUFA er viktige næringsstoffer som er knyttet til de fleste av sykdommer i mennesker, spesielt hjerte- og (CVD), kreft, diabetes og metabolsk syndrom, og er nøkkelen konstruksjonsdeler i neuralt vev [8], [9]. Den LCPUFA DGLA (20:3n-6), ARA (20:4n-6), EPA (20:5n-3) og DHA (22:6n-3) er forløpere for cellesignale eikosanoider og deres modifikasjon av biosyntetisk inhibering av nedstrøms metabolisme er svært verdifulle narkotika mål, for eksempel, cyklooksygenase og lipoksygenaseinhibitorer, og mer nylig docosanoids som er kandidat narkotika [10].
FADS2 kodet Δ6-desaturase katalyserer første og hastighetsbegrensende trinn i biosyntesen av LCPUFA. I flere kreftceller forekommer ikke avmetning, noe som kan skyldes inaktivering av desaturase eller oppstrøms (f.eks CoA-produksjon) eller nedstrøms (for eksempel acyl-transferase) trinn. Årsaken til denne mangel er blitt foreslått å være på grunn av omfattende kromosomale delesjoner, men ikke noe molekylært bevis er tilgjengelige [11], [12]. Den Δ8-avmetning substrater 20:2n-6 og 20:3n-3 blir ofte detektert, således som tyder på at forlengelsen trinnet er funksjonell [12], [13]. Inntil nylig ble Δ8-desaturation underlag 20:2n-6 og 20:3n-tre ansett dead-end-produkter, selv om de finnes i humane plasma og røde celler samt andre vev. Vi viste den første molekylære bevis for at FADS2 katalyserer Δ8-desaturation for begge disse underlag, som representerer en alternativ rute til LCPUFA biosyntese hos pattedyr hvor de er konvertert til eicosanoid forløper LCPUFA [14]. Denne veien kan være tilgjengelig når Δ6-desaturase aktiviteten er kompromittert.
Den uvanlige tap av PUFA desaturase aktivitet i flere kreftceller bedt oss om å hypoteser om at den primære feilen ligger i desaturase seg selv, og ikke andre steder, for eksempel i aktivering av PUFA ved CoA-syntese eller syntese av fosfoglyserider som akseptorer av begynnende LCPUFA. Vi har bekreftet at human brystcancer MCF7 celler ikke har noen mulighet for biosyntesen av LCPUFA på grunn av fravær av Δ6-desaturase-aktivitet [12]. Her vises restaureringen av denne metabolske defekter ved heterolog ekspresjon av FADS2, bevis på ny substrat spesifisitet for FADS1, og konkurranse mellom FADS1 og FADS2 for de samme substrater, som fører til produksjon av uvanlige LCPUFA som ikke er substrater for eicosanoid produksjon.
diskusjon
FADS2 og FADS1 forbigående transfekterte MCF7 celler Resultater og ble undersøkt for tegn på bioaktivitet mot 18:2n-6 og 18:3n-3. FADS2 transfekterte celler viste aktivitet mot både underlag; gasskromatografi-kovalent addukt kjemisk ionisering tandem massespektrometri (GC-CACI-MS /MS) bekreftet de nye topper som skal 18:3n-6 og 18:4n-3 henholdsvis (figur 1). Som forventet ble det ikke observert produkter når enten 18:2n-6 eller 18:3n-3 ble inkubert med den FADS1 og de tomme vektor kontrollene. Disse dataene gir den første utvetydig molekylære bevis for at den metabolske feil i disse cellene kan gjenopprettes ved å erstatte det hastighetsbegrensende Δ6-desaturase enzymet som kodes for av FADS2
A.: Ingen produkter er sett i FADS1-transfekterte celler. B: FADS2 transfekterte celler Δ6-metning 18:2n-6 → 18:3n-6 (9,12-18:2 → 6,9,12-18:2) og 18:3n-tre → 18:4n-3 (9,12,15-18:3 → 6,9,12,15-18:4).
Når FADS1-transfekterte celler ble inkubert med 20:2n-6 og 20:3n -3 viser CACI-MS /MS gevinst av syntetisk funksjon for å generere to nye butylene-avbrutt PUFA topper: 5,11,14-20:3 og henholdsvis 5,11,14,17-20:4, (figur 2) . Disse to LCPUFA er analoger til arakidonsyre (5,8,11,14-20, 4) og eikosapentaensyre (5,8,11,14,17-20:5), respektivt. Våre data viser at i det vesentlige i fravær av Δ8-desaturase-aktivitet (FADS2), den Δ5-desaturase (FADS1) virker på 20:2n-6 og 20:3n-3. Δ6-desaturation (FADS2) er normalt cirka 10 ganger mer aktive enn Δ5-desaturation (FADS1), og dermed er det sannsynlig at i løpet av celletransformasjon FADS1 aktivitet vil vedvare når FADS2 er inaktiv. Men de foretrukne substrater for FADS1 ikke er essensielle fettsyrer (18:2n-6 og 18:3n-3), men deres forlengelse produkter 20:2n-6 og 20:3n-3. FADS1 som virker på disse substrater genererer uvanlige butylen-avbrutt karbon produkter og våre resultater viser at disse sjeldne fettsyrer kan fremstilles i kreftceller. Dette er den første molekylære bevis som viser roman FADS1 substrat spesifisitet for 20:2n-6 og 20:3n-3 fettsyrer. Videre FADS2-transfekterte celler viser entydig at
FADS2
genprodukt Δ8-desaturates 20:2n-6 og 20:3n-3 til 20:3n-6 (DGLA) og 20:4n-3 (ETA ) henholdsvis, tilsvarende våre resultater i heterologt transformert gjær [14]
A:. FADS1-transfekterte celler Δ5-metning 20:2n-6 → 5,11,14-20:3 og 20:3n- 3 → 5,11,14,17-20:4. B: FADS2 transfekterte celler Δ8-metning 20:2n-6 → 20:3n-6 og 20:3n-tre → 20:4n-3
Videre, mens det er velkjent at både. n-3 og n-6 PUFA underlag konkurrerer om samme enzymene, våre nåværende data viser FADS1 og FADS2 konkurrerer om de samme underlag (figur 2). Netto Konsekvensen er substitusjon av den inaktive 5,11,14-20:3 og 5,11,14,17-20:4 for ARA (5,8,11,14-20:4) og EPA (5, 8,11,14,17-20, 5), henholdsvis, med uforutsigbare konsekvenser for eicosanoid-mediert celle-celle parakrin signalering. Feilregulering av eicosanoid signalering er knyttet til tumorutvikling, angiogenese og metastase i dyremodeller [15]. En dobbeltbinding i posisjon 8 er nødvendig for cyklooksygenase (COX), lipoksygenase (LOX) og tromboksan biosyntese og således fravær av dobbeltbindingen i posisjon 8 gjengir 5,11,14-20:3 og 5,11,14, 17-20:4 inaktive som substrater for biosyntese av et eikosanoider [16], [17], [18]. Dessuten er den mulige virkning av butylen-avbrutt PUFA som konkurrerende inhibitorer av eicosanoid biosyntetiske enzymer ukjent, som er aktiviteten av andre viktige eicosanoid syntetiske enzymer (f.eks cytokrom P450) hvis handlinger på normale deler av uvanlige fettsyrer ville resultere i produkter med ukjent activit (er).
moter gener som koder for enzymer som kreves for PUFA biosyntese oppsto evolusjonært av genet duplisering hendelser. Til tross avgjørende betydning for FADS2 og tap av dens funksjon i flere kreftceller, har de molekylære detaljer og konsekvenser av FADS2 tap ikke vært beskrevet eller undersøkt. FADS2 er kjent for å ha aktivitet mot minst sju substrater (18:2n-6, 18:3n-3, 20:2n-6, 20:3n-3, 24:4n-6, 24:5n-3, 16: 0). Tapet av FADS2-kodet aktivitet i cancerceller slås helt av de klassiske og alternative reaksjonsveier PUFA, eliminerer eicosanoid og docosanoid forløper-biosyntese fra plantebasert PUFA linolsyre og linolensyre og dermed begrense celle-cellesignalering (figur 3). Mange studier har funnet sterke assosiasjoner mellom enkeltnukleotidpolymorfi innenfor FADS clusteret og komplekse fenotyper relatert til kronisk sykdom, så vel som til langkjedete PUFA nivåer [19], [20]. Videre studier er nødvendig for å forstå konsekvensene av MOTER gen-funksjon tap og /eller modulering basert på SNPs i svulst. Tidlige studier viste at mikro-celle mediert overføring av HSA11 inn MCF7 celler redusert tumorigenicity, tyder på potensielle tumorsuppressorgener på dette kromosomet [21].
Δ6- og Δ8-desaturation trinnene er fraværende i MCF7-, fører til Δ5-desaturation av 11,14-20:2 å 5,11,14-20:3 når FADS1 er funksjonell. De analoge trasé for n-3 LCPUFA konvertere 11,14,17-20:3 → 5,11,14,17-20:4 (ikke vist). FADS2 er også antatt å være involvert i C22 LCPUFA biosyntese (ikke vist).
Våre funn viser at en primær molekylær defekt i MCF7 cellene ligger innenfor FADS2 genet som forårsaker tap av FADS2-kodet Δ6-desaturase aktivitet. Kompensasjon for FADS2 funksjon ved FADS1 fører til produksjon av 5,11,14-20:3 og 5,11,14,17-20:4, både primært dead-end fettsyreprodukter som ikke kan være forløpere for de fleste eikosanoider og er sannsynlighet for å være konkurransedyktige hemmere. Den fysiologiske betydningen av butylen avbrutt PUFA i kreftceller samtaler for ytterligere detaljert undersøkelse. Våre nåværende resultater gir en stimulans til bedre å forstå rollen av fettsyrer desaturasene, spesielt FADS2 som en tumor suppressor i neoplastiske lidelser.
Materialer og metoder
Plasmidvektor bygging
den proteinkodende sekvenser av FADS1 (GenBank tiltredelse # EF531577) og FADS2 (GenBank tiltredelse # EU780003) ble klonet inn pcDNA3.1 ekspresjonsvektor hjelp cDNA fra nyfødte bavianer levervev. CDNA ble hentet fra banked prøver hentet fra en studie godkjent av Cornell University Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC, protokoll # 02-105). Analyse og sammenligning av aminosyre-sekvensen av bavian FADS1 viste 95% identitet og 97% positive med human FADS1 (AF084558), mens, bavian FADS2 viste 98% identitet og 99% positive med human FADS2 (NM_004265). Tidligere har vi vist roman Δ8-desaturation funksjon med bavian FADS2 [14].
MCF7 cellekultur og fettsyrer
For transfeksjon eksperimenter MCF7 celler ble dyrket i MEM-α media med 10 % Lipid-redusert FBS (media og serum oppnådd fra HyClone) ved 37 ° C i en fuktig miljø med 5% CO
2. Menneskelige brystkreft MCF7 celler (American Type Culture Collection, ATCC, Rockville, MD) var den type gave av Dr. Rui Hai Liu, Cornell University. De FADS1 og FADS2 konstruksjoner ble transfektert inn MCF7 celler ved hjelp Lipofectamine LTX (Invitrogen, USA) i henhold til produsentens anbefalinger. Tjuefire timer etter transfeksjon, ble MCF7 celler supplert med 100 pM av albumin bundet 18:2n-6, 18:3n-3, 20:2n-6 og 20:3n-3 fettsyrer og ble inkubert i ytterligere 24 timer.
fettsyre~~POS=TRUNC analyse~~POS=HEADCOMP
etter inkubasjon med fettsyrer, ble cellene vasket to ganger med 1XPBS og fjernet ved trypsinisering. Cellene ble høstet ved sentrifugering, og celle-pelleten ble behandlet for lipid ekstraksjon. Fettsyremetylester Fremstillingen ble utført ved anvendelse av en modifisert en-trinns metode for Garces og Mancha [22]. Analysen ble ved gasskromatografi-flammeioniseringsdeteksjon (GC-FID) [8] og topp identifikasjon ble bekreftet ved GC-kovalent addukt kjemisk ionisering tandem massespektrometri (GC-CACI-MS /MS) [14], [23].
