Abstract
Den menneskelige leverkreft (HCC) representerer biologisk aggressive og chemo-resistente kreftformer. På grunn av den lave affinitet med den apoptotiske faktor Mcl-1, BH3 mimetiske medikament ABT-737 mislyktes i å utøve potente kreft-drapet aktiviteter i forskjellige cancermodeller inkludert HCC. Den aktuelle studien viste at å kombinere ABT-737 og Celastrol synergi trykt HCC celledeling og apoptose som ble akkompagnert med aktivering av caspase kaskade og frigjøring av cytokrom c fra mitokondriene. Videre studier viste at den forbedrede Noxa forårsaket av Celastrol var den avgjørende faktoren for synergi, siden små interfererende RNA-mediert knockdown av Noxa uttrykk i HCC celler resulterte i redusert apoptose og svekkede anti-proliferative effekter av kombinasjonen. I tillegg vårt studium avslørt at, ved Celastrol eksponering, aktivering av endoplasmatisk retikulum (ER) stress, spesielt de eIF2α-ATF4 veien Dato uunnværlig rolle i aktiveringen av Noxa, som ble bekreftet ved observasjonen at uttømming av ATF4 betydelig grad opphevet den Noxa heving av Celastrol. Våre funn markere en ny signalveien gjennom hvilke Celastrol øke Noxa uttrykk, og foreslå potensiell bruk av ATF4-mediert regulering av Noxa som en lovende strategi for å forbedre anti-kreft aktiviteter ABT-737
Citation.: Zhu H, Yang W, Han Lj, Ding Wj, Zheng L, Liao Sd, et al. (2012) upregulating Noxa ved ER stress, Utøver Celastrol Synergistic Anti-Cancer aktivitet i kombinasjon med ABT-737 i Human leverkreft celler. PLoS ONE 7 (12): e52333. doi: 10,1371 /journal.pone.0052333
Redaktør: Tetsuo Takehara, Osaka University Graduate School of Medicine, Japan
mottatt: 7 august 2012; Godkjent: 12 november 2012; Publisert: 20.12.2012
Copyright: © 2012 Zhu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne ønsker å takke for økonomisk støtte fra de grunnleggende forskning Midler til de sentrale universiteter (No. 2011FZA7008) og Natural Science Foundation Zhejiang Provincial of China (No. Y2110933). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ABT-737 er en potent liten-molekyl hemmer, som retter seg mot BCL-2-regulert apoptose sti, som fungerer som en dårlig lignende BH3 mimetisk. Det grenser selektivt til BCL-2, BCL-XL og BCL-w men ikke Mcl-en og Bfl-1 /A1. I prekliniske studier har ABT-737 vist mono aktivitet mot ulike leukemi [1], lymfom [2], og småcellet lungekreft [3]. Mens ABT-737 har vist seg å være et lovende terapeutisk middel, er det lite sannsynlig å være effektiv som et enkelt middel i faste tumorer resulterte fra sin lave affinitet med Mcl-1 og høyt nivå av Mcl-1-ekspresjon i kreftceller [4] – [7]. Dette gjør utforskning av kombinasjonsstrategier avgjørende for å forbedre nåværende behandling av ABT-737 mot kreft, hvor den varme problemet på er å kombinere ABT-737 med andre stoffer som har evnen til å modulere Mcl-1. I våre tidligere studier, fant vi at gemcitabin kunne forbedre ubiquitinering og den påfølgende nedbrytning av Mcl-en, derfor utstilt synergistisk cytotoksisitet med ABT-737 i flere typer kreftceller [6]. Tilsvarende GDC-0941-fremme nedbrytning av Mcl-en var også ansvarlig for synergistisk drap av brystkreftceller med ABT-737 [5]. Derfor ville modifikasjon på Mcl-1 uttrykk utløse allergi av ABT-737 i avbryte celler.
BH3-bare protein Noxa er i stand til å selektivt samhandle med Mcl-en, og slipp deretter Bak eller Bax fra Mcl- 1 for å aktivere den mitokondrielle apoptose gangsti eller målrette det for proteasomal degradering [5] – [8]. På grunn av sin typisk karakteristikk, har Noxa blitt fremhevet som en effektiv faktor for å reversere resistens til ABT-737 som er forårsaket av Mcl-1. Lucas KM et al viste at overekspresjon av Noxa sterkt overvant ABT-737 motstand i melanomceller [9]. Dessuten har Noxa-induserende midler har også blitt rapportert til å sensibilisere kreftceller for å ABT-737, som blant annet bortezomib [10], Fludarabine [11], oksaliplatin [12], etc. Nylig Dai Y et al viste at Celastrol, en naturlig ekstrakt med potente anti-kreft evner, kan føre til induksjon av Noxa og kløyving av Mcl-1 [13], som tiltrakk seg oppmerksomheten til å undersøke effektene når kombinere dette agent med ABT-737, som har anti-kreft aktiviteter ble nært knyttet til Mcl -1.
Celastrol er en farmakologisk aktiv forbindelse opprinnelig identifisert fra tradisjonell kinesisk medisin Thunder of God Vine root ekstrakter, og har blitt brukt som et naturlig middel for inflammatoriske tilstander og kreft behandling i mange år [14]. Som en HSP90 inhibitor, Celastrol forstyrret HSP90-Cdc37 interaksjon mot kreft i bukspyttkjertelen celler [15], [16], og pålagt innflytelse på ER-stress respons [17]. I tillegg kunne Celastrol indusere apoptose ved å aktivere Noxa og moduler Mcl-1 [13], med detaljerte mekanismer ukjente, og potensialet søknaden forbli unnvikende.
I denne studien undersøkte vi de potensielt synergi evner ABT- 737 i kombinasjon med Celastrol i humane hepatocellulære karsinom-cellelinjer, der for det meste havn høyt nivå av Mcl-1-protein ekspresjon [18]. Kombinasjonen indeks (CI) -verdier for de anti-proliferative egenskaper på to humane lever-kreft-cellelinjer Bel-7402 og HepG2 var mindre enn 0,7, hvilket indikerer synergisme for kombinasjonen av ABT-737 og Celastrol. Videre Celastrol sterkt potenseres ABT-737-mediert apoptose i Bel-7402 og HepG2-celler ved å stimulere Noxa ekspresjon og dets interaksjon med Mcl-1, som var avhengig av induksjon av ER stressrespons, spesielt, aktivering av ATF4. Generelt, vår studie for det første fast de synergistiske virkningene av ABT-737 pluss Celastrol i humane leverkreft celler, åpne mulighet for å kombinere disse to midlene som potent terapeutisk kombinasjon, og antyder at aktiveringen av ER stress som fører til manipuleringen på Noxa Dette kan tjente som en effektiv strategi for å inhibere Mcl-1 og således for å øke anti-kreft-aktivitet av ABT-737.
MTT-analyser ble brukt for å undersøke de celleproliferasjonsprosesser inhiberende aktiviteter i human leverkreft Bel-7402 ( A) og HepG2-celler (B). Celler i 96-brønners plater ble utsatt for serie konsentrasjoner av ABT-737, Celastrol eller konstant-forholdet blanding av disse to i 72 timer. Konsentrasjonene anvendt var 1,25 til 10 mikrometer for ABT-737, 0,16 til 1,25 mikrometer for Celastrol. Konsentrasjon-responskurvene på to cellelinjer til ABT-737, Celastrol og kombinasjonen ble presentert. Tre uavhengige eksperimenter ble utført, og standardavviket var representert som feilfelt. CI verdier ble vist i Tabell 1.
Materialer og metoder
1. Kjemikalier og reagenser
ABT-737 ble kjøpt fra Selleck Chemicals (Houston, TX). Celastrol ble syntetisert av professor Wei Lu (East China Normal University) med renhet større enn 99%. Både ABT-737 og Celastrol ble oppløst i dimetylsulfoksyd ved lager-konsentrasjon på 20 mM (DMSO). De primære antistoffer mot PARP, pro-caspase-3, Bax, Bim, BCL-XL, ubiquitin, Actin og HRP-merket sekundært anti-geit, anti-mus og anti-kanin antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA); de primære antistoffer mot kløyvet-caspase-3, Puma, cytokrom c, BCL-2, Mcl-en, ATF4, Chop, p-eIF2α (Ser51), eIF2α, HSP70, p-ERK, ERK, og CDK4 ble kjøpt fra Cell signale Technology (Danvers, MA); de primære antistoffer mot Noxa ble kjøpt fra Calbiochem (Darmstadt, Tyskland).
2. Cell Culture
Menneskeleverkreft cellelinjer Bel-7402 og HepG2 ble kjøpt fra Shanghai Institute of Biochemistry og cellebiologi (Shanghai, Kina) og vedlikeholdes i en 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C. Bel-7402-celler ble dyrket i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum og HepG2-cellene i Dulbeccos modifiserte Eagles medium supplert med 10% føtalt bovint serum.
A. Celler ble behandlet med 10 uM ABT-737, 1,25 mM Celastrol og kombinasjonen for 24, 48, 72 timer, og apoptose ble testet ved propidiumjodidfarging av lyserte cellekjerner, analysert ved hjelp av strømningscytometri. B. Etter behandling 10 uM ABT-737, 1,25 mM Celastrol og kombinasjonen i 72 timer, ble cellene farvet med DAPI og observert av Leica DMI 400B Xuorescence mikroskop. Celler ble behandlet med 10 uM ABT-737, 1,25 mM Celastrol og kombinasjonen i 24 timer; C. lysater ble høstet og immunobloted med caspase-3, caspase-3 spaltet og PARP-antistoffer; D. Caspase-3-aktivitet ble bestemt ved bruk av spesifikt substrat Ac-DEVDPNA; HepG2-celler ble behandlet med 10 uM ABT-737, 1,25 mM Celastrol og kombinasjonen i 24 timer. E. Bel-7402 og HepG2 celler ble farget med JC-1, deretter observert av Leica DMI 400B Xuorescence mikroskop; F. protein nivåer av Bax, BCL-2, Bcl-xL og Mcl-en i HepG2 og Bel-7402 celler ble oppdaget av western blotting analyse. Tettheten av proteinbånd ble bestemt ved hjelp av Bio-Rad Mengde One bildebehandling; G. separasjon av cytosol ble oppnådd. Cytosol Prøvene ble analysert, og frigjøring av cytokrom c ble vurdert ved Western blotting-analyse. Resultatene var tilsvarende i minst tre uavhengige eksperimenter. *,
p
0,05; **,
p
. 0,01
3. Cell Survival analysen
Cell overlevelse ble vurdert ved MTT celleviabilitet analysen. Kort sagt ble eksponensielt voksende Bel-7402 og HepG2 celler sådd ut i 96-brønners plater og dyrket over natten i en 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C før behandling av eksponert for DMSO kjøretøy, serie konsentrasjoner av ABT-737, Celastrol eller en kombinasjon i 72 timer. Deretter ble cellene inkubert med MTT (5 mg /ml, 20 ul /brønn) i 4 timer og de formazanfremstilling granulene som genereres av levende celler ble oppløst i DMSO. Absorbansen ved 570 nm ble målt ved anvendelse av et Multiscan-spektrum (Thermo Electron Corporation Marietta, OH). Analysene ble utført i tre eksemplarer i tre uavhengige eksperimenter.
4. Analyse av Apoptose av DAPI Farging
Eksponensielt voksende Bel-7402 og HepG2-celler ble sådd i 96-brønns plater og dyrket over natten i en 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C før behandling av DMSO kjøretøy, serielle konsentrasjoner av ABT-737, Celastrol eller en kombinasjon i 72 timer. Høstede celler ble vasket en gang med PBS, inkubert med 0,1% Triton og 0,1% DAPI ved romtemperatur i 3 min, deretter vasket to ganger med PBS og avbildes med Leica DMI 400B fluorescens mikroskop.
A. Bel-7402-celler ble behandlet med 10 uM ABT-737, 1,25 mM Celastrol og kombinasjonen for 3, 6, 12 timer. B. HepG2-celler ble behandlet with10 pM ABT-737, 1,25 mM Celastrol for 12, 24, 48 timer. Deretter lysatene ble høstet og immunobloted med NOXA, Bim, Puma og PARP antistoffer.
5. Analyse av apoptose ved PI Farging
Eksponensielt voksende Bel-7402 og HepG2-celler ble sådd og dyrket over natten i en 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C før behandling av DMSO kjøretøy, serie konsentrasjoner av ABT- 737, Celastrol eller en kombinasjon i 24 timer, 48 timer og 72 timer. Høstede celler ble vasket en gang med PBS og fiksert med kald 70% etanol ved -20 ° C i minst 2 timer. De fikserte cellene ble vasket to ganger med PBS og resuspendert i PBS inneholdende 40 pg /ml RNase A ved 37 ° C i 30 minutter og 10 ug /ml propidiumjodid i mørket ved romtemperatur i 30 minutter. Flowcytometri ble utført på FACScan (BD Biosciences, San Jose, California).
6. Bestemmelse av mitokondriemembranen depolarisering
Eksponensielt voksende Bel-7402 og HepG2-celler ble sådd og dyrket over natten i en 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C før behandling av DMSO kjøretøy, serie konsentrasjoner av ABT-737 , Celastrol eller en kombinasjon i 24 timer. Høstede celler ble vasket en gang med PBS og resuspendert i PBS som inneholdt 10 mikrogram /ml JC-1 (5,5 «, 6,6′-tetraklor-1,1′, 3,3»-tetraethylbenzimidazolyl arbocyanine jodid). Etter incubationat 37 ° C i 20 min, ble cellene vasket to ganger med PBS, deretter fotografert med Leica DMI 400B fluorescens mikroskop eller analysert av flowcytometri.
HepG2 celler ble transfektert med NOXA siRNA i henhold til produsentens anbefalinger. Førtiåtte timer etter transfeksjon ble cellene behandlet with10 uM ABT-737, 1,25 mM Celastrol og kombinasjonen i 48 timer. A. Lysates ble høstet og immunobloted med NOXA antistoff. B. Lysater ble høstet og immunobloted med spaltede kaspase-3 og PARP-antistoffer. C. Forholdene mellom spaltede-kaspase 3 /β-aktin. D. Forholdet mellom spaltet PARP-/aktin. Tettheten av proteinbånd ble bestemt ved hjelp av Bio-Rad Mengde One bildebehandling. E. Celleoverlevelse fraksjoner ble påvist ved MTT-analyse. *,
p
0,05; **,
p
. 0,01
7. Western blot-analyse
Bel-7402 og HepG2-celler ble høstet, vasket en gang med PBS og resuspendert i lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, 0,5% deoksykolsyre -syre, 0,02% natriumazid, 1% NP-40, 2,0 ug /ml aprotinin, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid) på is i 30 min. Lysatene ble sentrifugert ved 13000 rpm i 30 minutter ved 4 ° C. Konsentrasjonene av det totale protein lysatet ble påvist ved standard Bradford-analyse (Bio-Rad, San Diego, CA). For Western blot-analyse, ble 40-100 ug av proteiner elektroforese ved hjelp av SDS-PAGE, overført til nitrocellulosemembran (Pierce Chemical) og probet med primære antistoffer, etterfulgt av pepperrot peroksidase-koblet sekundære antistoffer ved 1:5000 fortynning. Proteinene ble visualisert ved hjelp av forbedret chemiluminescence (ECL)-pluss kit fra Amersham Biosciences (UK).
8. Måling av caspase-3 aktivitet
Aktiviteten av caspase-3 ble målt ved å spalte selektiv substrat acetyl-Asp-Glu-Val-Asp P-nitroanilide (Ac-DEVDPNA) (Beyotime Institutt for bioteknologi). Celler ble lysert og proteinkonsentrasjon på supernatanter ble målt ved Bradford-metoden og like mengder av protein (10 ul) ble inkubert i et totalvolum på 100 ul som består av 80 ul deteksjonsbuffer. Reaksjonen ble startet ved tilsetning av caspase-3 substrater Ac-DEVD-PNA (10 ul). Etter inkubering i 60 minutter ved 37 ° C, ble spaltning av substratet påvises ved hjelp av et Multiscan-spektrum (Thermo Electron Corporation Marietta, Ohio) ved bølgelengden 405 nm. Aktiviteter av caspase-3 ble uttrykt som endringer i DEVDase aktivitet.
9. Påvisning av Frigivelse av cytokrom c
Cellene ble høstet, vasket en gang med PBS og resuspendert i en ekstraksjonsseksjon buffer [20 mmol /L HEPES (pH 7,5), 1,5 mmol /l MgCl
2, 10 mmol /l KCl, 1 mmol /liter EGTA, 1 mmol /l EDTA, 250 mmol /l sukrose, 0,1 mmol /l fenylmetylsulfonylfluorid og 1 mmol /l DTT], og homogenisert ved hjelp av en microhomogenizer. Homogenatene ble sentrifugert ved 750 x g i 10 minutter ved 4 ° C. Deretter ble supernatanter ble sentrifugert ved 10 000 x g i 15 min ved 4 ° C, og de gjenværende supernatantene ble betraktet som cytosol fraksjon. Etter Western blot analyse, ble anti-cytokrom c-antistoffer (Cell Signaling Technology) som brukes til å oppdages mitokondrie frigjøring av cytokrom c.
Etter behandling av 10 mm ABT-737, 1,25 mikrometer Celastrol og kombinasjonen i 24 timer , cellulære ekstrakter ble immunopresipitert med Mcl-1 (A) eller (B) Noxa antistoffer. Immunutfellinger ble underkastet SDS-PAGE og probet med Noxa (A) eller Mcl-1 (b) antistoffer. Lysater ble høstet og immunobloted med MCL-1, Noxa og Actin-antistoffer.
A og B. Bel-7402 og HepG2-celler ble behandlet 1,25, 2,5, 5 uM Celastrol i 3 timer, lysater ble høstet og immunobloted med Hsp70, p-ERK, CDK4 og UB antistoffer. C. HepG2-celler ble behandlet 1,25, 2,5, 5 uM Celastrol i 3 t, lysater ble høstet og immunobloted med p-eIF2a og ATF4. D. HepG2-celler ble behandlet med 1,25 uM Celastrol eller pluss 10 uM ABT-737 i 12 timer. Noxa mRNA-nivåer ble bestemt ved sanntids RT-PCR i forhold til GAPDH som en intern kontroll. E. HepG2 celler ble transfektert med ATF4 siRNA i henhold til produsentens anbefalinger. Førti-åtte timer etter transfeksjon ble lysatene høstet og immunobloted med ATF4 antistoff. F. Celler ble behandlet med 1,25 uM Celastrol i 24 timer. Noxa mRNA-nivåer ble bestemt ved sanntids RT-PCR i forhold til GAPDH som en intern kontroll. Resultatene var tilsvarende i minst tre uavhengige eksperimenter. *,
p
. 0,05
10. Revers transkripsjon PCR-analysen
Totalt RNA ble fremstilt ved anvendelse av TRIzol-, utfelt ved isopropylalkohol og renset med 70% etanol. Enkeltstreng-cDNA ble fremstilt fra det rensede RNA ved å bruke oligo (dT) priming (Thermoscript RT kit, Invitrogen), etterfulgt av SYBR-grønn real-time PCR (Qiagen). Primerne var som følger: Noxa, 5′-ATGAATGCACCTTCACATTCCTCT-3 «, 5′-TCCAGCAGAGCTGGAAGTCGAGTGT-3′ [19]; GAPDH, 5»-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3 «, 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′ [20]. Relative uttrykk nivåer av målgener ble normalisert med kontroll genet GAPDH. For påvisning av Xbp1 skjøting, betingelsene anvendt for revers transkripsjon-PCR var som følger: 10 min ved 25 ° C, 60 min ved 42 ° C og 15 minutter ved 72 ° C. CDNA ble underkastet PCR-amplifisering ved anvendelse av følgende forover og revers primer: Xbp1, forover-primer: 5»-CCTTG TAGTTGAGAACCAGG-3 «og revers primer: 5′-GGGGCTTGGTATATATGTG G-3» [21]. PCR-produktene ble separert på 1,0% agarosegel og visualisert ved hjelp av etidiumbromidfarging. Geler ble fotografert med en Gel DOC 2000 bilde analysator (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
11. Stanse av Gene Expression med små interfering RNA (siRNA)
eksponentielt voksende celler ble sådd i 6-brønners plater (4 × 10
4 /brønn) og dyrket over natten i en 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C. Da mediet ble erstattet med Opti-MEM jeg Redusert Serum Media (GIBCO) som inneholdt 20,0 nM Mcl-en eller ATF4 siRNA (GenePharma, Kina) og oligofectamine reagens (Invitrogen Corporation) i henhold til produsentens anbefalinger. Deteksjons sekvenser av siRNA var som følger: NOXA: 5′-UCAGUCUACUGAUUUACUGG-3 «[22]; ATF4: 5»-GCGUAGUUCGCUAAGGUGAdTdT-3 «[23]. Førti-åtte timer etter transfeksjon ble cellene høstet eller behandlet med DMSO kjøretøy, serie konsentrasjoner av ABT-737, Celastrol eller kombinasjonen.
12. Immunoutfelling
Cellene ble høstet og resuspendert i lyserings universell /immunoutfelling buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 25 mM NaF, 25 mM β-glycerofosfat, pH 7.5, 0,1 mM natriumortovanadat, 0,1 mM PMSF, 5 ug /ml leupeptin, 0,2% Triton X-100, 0,5% Nonidet P-40) på is i 30 min. Lysatene ble sentrifugert ved 13000 rpm i 30 minutter ved 4 ° C. 300 ug cellulære proteiner ble klaret ved tilsetning av 1 ug av normal immunoglobulin G sammen med 50 ul av passende protein A + G-agarose-konjugat (Santa Cruz) i 1 time ved 4 ° C. De immunoutfellinger ble utført med det passende primære antistoff over natten ved 4 ° C. Komplekser som er bundet til protein A + G-agarose-konjugat ble vasket syv ganger med lyserings universal /immunpresipitering buffer og fraksjonert ved hjelp av SDS-PAGE. Western blot analyse ble deretter utført.
13. Statistisk analyse
Kombinasjons index (CI) er godt akseptert for kvantifisering av narkotika synergi basert på flere narkotika effekt ligning av Chou-Talalay [24]. I vår studie ble CI’er for hver konsentrasjon av ABT-737, Celastrol og kombinasjonen i celleoverlevelsesanalyser beregnes ved Calcusyn programvare (Biosoft, Cambridge, Storbritannia). En CI lavere enn 0,9 indikerer synergisme; et CI av 0,9 til 1,10 indikerer additiv; og en CI høyere enn 1.10 indikerer antagonisme
Forskjeller i sub-G1 befolkningen, caspase-3-aktivitet og Bax /BCL-2 ratiofor hver to grupper (kombinasjons
vs
ABT-737..; kombinasjonen
vs.
Celastrol), og forskjeller i kløyvde caspase-3 /aktin, kløyvde PARP /aktin, og overlevelse prosentandel av kombinasjonsgruppen i Noxa forstummet celler
vs.
kontroll siRNA celler, brett . endring i Noxa mRNA av Celastrol-behandlede celler i ATF4 siRNA celler
vs
kontrollere siRNA celler, ble evaluert av uparet tosidig t-test og angitt med ** for p 0,01 og * for p 0,05. For hver analyse ble tre uavhengige eksperimenter utført for å få tak i data.
Resultater
1 Cytotoksisitet av ABT-737 og Celastrol Kombinasjon i Human leverkreft cellelinjer
Først , ved hjelp av MTT-analysen vi evaluert cytotoksisiteten til ABT-737, Celastrol og kombinasjonen ved de angitte konsentrasjoner i 72 timer i to HCC cellelinjer Bel-7402 og HepG2. Tilsvarende overlevelsesfraksjonskurver er vist i fig. 1. I sammenligning med ABT-737 eller Celastrol alene, kombinasjonen av ABT-737 og Celastrol utøves mer betydelige anti-spredningseffekter i både Bel-7402 og HepG2. CI verdier ble beregnet ved Calcusyn programvare på fast system konsentrasjoner av ABT-737 og Celastrol (tabell 1). Synergy (CI 0,70) eller sterk synergi (CI 0,30). Det ble observert i begge testede kreftcellelinjer
2 ABT-737 synergized med Celastrol å utløse apoptose
2,1 ABT-737 plus celastrol indusert økt apoptose.
Både ABT-737 og celastrol rapporteres å modulere apoptose i kreftceller, og dermed er vi inspirert til å bestemme synergieffekter av ABT-737 pluss celastrol på apoptose i Bel-7402 og HepG2 celler . For det første ble PI farging for Sub-G1 innholdsanalysen benyttes til å karakterisere apoptose i Bel-7402 og HepG2-celler ble behandlet med 10 uM ABT-737, 1,25 uM Celastrol eller en kombinasjon i 24 timer, 48 timer og 72 timer. Som vist på fig. 2A, ABT-737 i kombinasjon med Celastrol ført til mer apoptose enn mono-behandlingsgruppene; celler som lider av apoptose følgende kombinasjonsbehandlingen økte tidsavhengig. Forskjellene av apoptotiske celler mellom kombinasjonsbehandling versus monobehandlingsgruppene var statistisk signifikant i både Bel-7402 og HepG2 celler (*,
p
0,05, **,
p
0,01) (fig. 2A). Typiske morfologiske trekk ved apoptose, inkludert kromatin kondensasjon, kjerne fragmentering og dannelse av apoptotiske legemer, ble også observert i 10 uM ABT-737, 1,25 uM Celastrol eller kombinasjonen behandlede Bel-7402 og HepG2-celler med DAPI farging. 10 uM ABT-737 i kombinasjon med 1,25 uM Celastrol induserte mer apoptotiske legemer enn de mono-behandling (fig. 2B). Caspase-3 er en kritisk effektor caspase i apoptotiske reaksjonsveier, hvorav den klassiske substratet er poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) [25]. Ved hjelp av western blot-analyse, vi har oppdaget aktiveringen av caspase-3 og spalting av PARP. I både Bel-7402 og HepG2 celler, selv om ABT-737 og Celastrol hadde liten effekt på caspase-3 og PARP, kombinasjonen førte til mye mer betydelig kløyving av caspase-3 og PARP (Fig. 2C). I HepG2-celler, ved å innføre den caspase-3 spesifikke substrat Ac-DEVDPNA, ABT-737 og Celastrol ko-behandling ble vist å utløse en markert økning av caspase-3 aktivitet (4,2-ganger sammenlignet med kontroll-gruppen) (Fig. 2D) , mens mono-behandlingsgruppene ikke vises en tydelig caspase-3-aktivering (1.1-ganger og 1,0-ganger, i Celastrol- og ABT-737-grupper, henholdsvis), som var i overensstemmelse med den observasjon i fig. 2C, ytterligere indikerer synergi apoptose indusert av ABT-737 og Celastrol. Vanligvis er disse data viser at kombinasjonen av ABT-737 og Celastrol resulterte i økt apoptose i Bel-7402 og HepG2-celler.
2.2 Aktivering av mitokondriell-baserte apoptotiske reaksjonsvei ble utløst av en kombinasjon av ABT-737 og celastrol.
Neste, mitokondriemembranen potensialet i cellene eksponering for ABT-737, Celastrol eller kombinasjonen ble undersøkt av JC-1 farging. Antall celler skiftende fra rød til grønn fluorescens indikerer hyppigheten av celler som oppviser mitokondriell depolarisering. I 24 h-behandlet Bel-7402 og HepG2 celler ble moderat grønn fluorescens observert etter at mono-behandlinger, mens grønn fluorescens erstattet de fleste rød fluorescens etter kombinasjonsbehandling av ABT-737 og Celastrol (Fig. 2E). Videre har vi oppdaget at proteinnivåer Bax, Bcl-2, Bcl-xL, samt mitokondrie frigjøring av cytokrom c (fig. 2F og 2G). I både HepG2 og Bel-7402-celler, ble akkumulering av Bax detektert etter behandling av ABT-737 og Celastrol i 24 timer, i motsetning til Bcl-2 og Bcl-xL sank etter kombinasjonsbehandling. Vi evaluerte deretter forholdet Bax /Bcl-2 og Bax /Bcl-xL i HepG2-celler, som spiller viktige roller i utbruddet av apoptose [26]. Kombinasjonen av ABT-737 og Celastrol signifikant oppregulert forholdet Bax /Bcl-2 og Bax /Bcl-xL, økende 0,35 til 2,49 (Bax /Bcl-2) og 0,55 til 3,91 (Bax /Bcl-xL), respectivley (fig. 2F). I tillegg tydelig frigjøring av cytokrom c fra mitokondrie til cytoplasma ble også indusert av ABT-737 pluss Celastrol kombinasjon (Fig. 2G). Samlet utgjør disse resultatene antydet mitokondrie veien var involvert i apoptose utløst av en kombinasjon av ABT-737 og Celastrol.
3 Kinetics av Noxa Induksjon korrelert med Aktivering av apoptotisk Maskiner av kombinasjonen av ABT-737 og Celastrol
for å karakterisere synergis apoptotiske maskineriet i ABT-737 og Celastrol, ble utført western blot analyse på Bel-7402 og HepG2 celler etter eksponering for 10 mm ABT-737, 1,25 mikrometer Celastrol eller kombinasjonen for ulike tids intervaller. I Bel-7402-celler, kinetisk analyse present at induksjon av Noxa proteiner ble detekterbart etter eksponering til 1,25 uM Celastrol eller kombinasjonen i 3 timer. I mellomtiden, la vi merke til at spalting av PARP (indikerer caspaseaktivering) av kombinasjonen ble synlig etter 6 timer (fig. 3A). I HepG2-celler, induksjon av Noxa ved 1,25 uM Celastrol eller kombinasjonen, sammenlignet med Bel-7402-celler, ble forsinket med utseende etter 24 timer, etterfulgt av mindre sensitiv PARP-spaltning (Fig. 3B). Merkbart i de to testede cancercellelinjene, selv om tidsberegningen av kaspase-aktivering og Noxa oppregulering var forskjellige fra hverandre, Noxa induksjon ble visst observert tidligere enn caspaseaktivering, noe som antydet at under behandlingen av ABT-737, Celastrol eller kombinasjonen, ble Noxa inkrement utløst før den apoptotiske celledød, øke muligheten for at Noxa induksjon spilte en rolle i apoptose fremkalt av ABT-737 pluss Celastrol.
i tillegg til Noxa, ble det registrert at den ekspresjon av en annen to BH3-bare proteiner Bim og Puma ble også oppregulert ved kombinasjonen av ABT-737 og Celastrol (fig. 3A og 3B), impliserer at disse to faktor kan hjelpe til å fremme den synergistiske apoptotiske-induksjon av kombinasjonen.
4 Noxa var nødvendig i Potent styrking av ABT-737-drapet etter Celastrol
Som nevnt ovenfor, Noxa trolig delta i apoptose indusert av kombinasjonsbehandlinger ABT-737 og Celastrol. Å identifisere involvering av Noxa og dens rolle i apoptose, vi først slått ned Noxa etter transfeksjon med Noxa spesifikke siRNA i HepG2 celler i 48 timer. Ekspresjon av Noxa ble vesentlig redusert ved transfeksjon med Noxa siRNA (Fig. 4A). Deretter HepG2 celler transfektere Noxa siRNA ble behandlet med 10 uM ABT-737, 1,25 uM Celastrol eller kombinasjonen for en annen 48 timer. Fig. 4B viste at Noxa-spesifikke siRNA betydelig redusert spaltingen av caspase-3 og PARP av ABT-737 i kombinasjon med Celastrol. Fra tre uavhengige eksperimenter, ble forholdet mellom spaltet-caspase-3 /β-aktin og spaltet-PARP /β-Actin analysert (fig. 4C og 4D), som viste at knockdown av Noxa tydeligvis resulterte i decrement av forholdene, noe som tyder på redusert apoptotiske potente av ABT-737 pluss Celastrol kombinasjon i Noxa-forstummet celler. I tillegg transfeksjon av Noxa siRNA avbrytes også den synergistiske anti-proliferativ effekt ved kombinasjonen av ABT-737 og Celastrol i HepG2-celler, med den celleoverlevelsesfraksjonen aggrandizing fra 57,14% til 93,56% (fig. 4E). Disse dataene viste at de samarbeidende anti-kreft effekt av ABT-737 og Celastrol nødvendig Noxa, hvorav knockdown svekket cytotoksisitet og apoptotiske virkninger av ABT-737 pluss Celastrol.
5 Celastrol fremmet Binding av Noxa til Mcl -1
Den store motstanden mot ABT-737 er tenkt å være sin lave affinitet med Mcl-en. Noxa er en BH3-bare protein som effektivt kan binde seg til Mcl-en og hemme de pro-overlevelse effektene av Mcl-en. Gitt induksjon av Noxa av Celastrol og kombinasjonsbehandling, bestemt vi samspillet mellom Noxa og sin høye affinitet partner Mcl-en som resulterte i Noxa /Mcl-1-komplekser. For å klargjøre dette problemet, vi immunopresipitert Mcl-1-proteinet og analysert for Noxa i HepG2 celler behandlet med 10 uM ABT-737, 1,25 uM Celastrol eller en kombinasjon i 24 timer. Som åpenbart i fig. 5A, Celastrol mono-behandling forbedret samhandlingen mellom Mcl-en og Noxa i HepG2 celler og Noxa binding til Mcl-en forhøyet betydelig etter kombinasjonsbehandling; i mellomtiden, Mcl-1 protein nivåer falt i Celastrol behandlet og kombinasjonsbehandlet HepG2 celler. Vi gjennomfører ytterligere en omvendt IP ved hjelp av anti-Noxa antistoffer, og også lagt merke til en økning av Mcl-en bundet med Noxa (Fig. 5B). Tatt sammen, induksjon av Noxa ved Celastrol oppmuntret interaksjonen av Noxa og Mcl-1, resulterte i reduksjon av Mcl-1, som kan bidra til økt apoptose indusert av ABT-737 og Celastrol formasjon.
6 Celastrol-forårsaket HSP90 Hemming og ER-Stress Response ført til økningen av Noxa
6,1 Celastrol indusert nedbrytning av HSP90 klient proteiner.
for å belyse sammenhengen mellom HSP90 målretting effekter [ ,,,0],27] og den Noxa induksjon i celastrol-eksponerte celler, nedbrytning av HSP90 klient proteiner, slik som fosfo ERK1 /2 og CDK4, ble kontrollert ved western-blotting i både Bel-7402 og HepG2-celler med serie konsentrasjoner av celastrol i 3 timer ( fig. 6A og 6B). I tillegg, i samsvar med forrige rapport, Celastrol også økt Hsp70 uttrykk, som er et kjennetegn på HSP90 hemming [28]. Siden HSP90 klient proteiner blir misfolded og ubiquitinmolekyler av HSP90 hemming og er deretter nedregulert ved proteasomal degradering [29], vi deretter oppdaget om Celastrol kan indusere protein ubiquitinering fulgt av proteasomal degradering. Som vist på fig.
