Abstract
PFTK1, også kjent som PFTAIRE1, CDK14, er et nytt medlem av Cdc2-relaterte serin /treonin proteinkinaser. Nyere studier viser at PFTK1 er sterkt uttrykt i flere maligne tumorer så som leverkreft, spiserørskreft, brystkreft, og er involvert i regulering av cellesyklusen, tumorer proliferasjon, migrering og invasjon som ytterligere påvirker prognose av tumorer. Men uttrykket og fysiologiske betydning av PFTK1 i magekreft fortsatt uklare. I denne studien analyserte vi uttrykket og kliniske betydningen av PFTK1 av Western blot i åtte parede ferske mage kreft vev, nontumorous mage slimhinne vev og immunhistokjemi på 161 paraffinembedded skiver. Høy PFTK1 ekspresjon ble korrelert med tumor karakter, lymfeknute invasjon, så vel som Ki-67. Gjennom Celletelling Kit (CCK) -8-analyse, strømningscytometri, kolonidannelse, sårheling og Transwell analyser, de vitro-studier har vist at overekspresjon PFTK1 fremmet proliferasjon, migrering og invasjon av magekreftceller, mens PFTK1 knockdown førte til det motsatte resultat. Våre funn for første gang støttet at PFTK1 kan spille en viktig rolle i reguleringen av magekreft spredning, migrasjon og ville gi en ny lovende terapeutisk strategi mot menneskehandel magekreft
Citation. Yang L, Zhu J, Huang H, Yang Q, Cai J, Wang Q, et al. (2015) PFTK1 Fremmer Gastric Cancer Progresjon ved å regulere spredning, migrasjon og invasjon. PLoS ONE 10 (10): e0140451. doi: 10,1371 /journal.pone.0140451
Redaktør: Keping Xie, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, UNITED STATES
mottatt: 7 mai 2015; Godkjent: 25 september 2015; Publisert: 21 oktober 2015
Copyright: © 2015 Yang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra stiftelsen av Kina (nr 81302285, nr 81402015) Natural Science
Konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den fjerde vanligste ondartet svulst og den nest største årsaken til kreft-relaterte dødelighet i alle typer kreft i verden [1]. Det er vanskelig å helbrede, med mindre det er funnet på et tidlig stadium [2]. På grunn av mangelen på spesifisitet, er tidlig diagnose hastighet lav og flertallet av magekreftpasienter er i middel sent stadium ved diagnose. 40% -60% av pasientene med magekreft mottatt magekreft radikal operasjon vil ofte ha postoperativ tilbakefall og metastase, disse egenskapene alvorlig påvirke langtidsoverlevelse hos pasienter med magekreft [3,4]. Til tross for stor utvikling av nye diagnose- og behandlingsstrategier av magekreft, forblir de nøyaktige molekylære mekanismer av magekreft dårlig forstå. Således kan identifisering av den molekylære mekanismen under magekreft progresjon og metastase gi pasienter med nye diagnostiske og terapeutiske strategier.
PFTK1 (også kjent som PFTAIRE1, CDK14) er et nytt medlem av Cdc2-relaterte serin /treonin proteinkinaser som først ble identifisert i mus nervesystemet og er en viktig regulator av cykliner og cellesyklus [5,6]. Få studier har blitt utført for å karakterisere sin fysiologiske funksjon eller biologisk betydning. Det er rapportert at PFTK1 er sterkt uttrykt i hjernen, bukspyttkjertel, nyre, og eggstokk. CDK binder til spesifikke cyclin boksen for å danne funksjonelle protein-kinase-komplekser og reguleres delvis av den subcellulære lokalisering av [7]. For eksempel, syklin Y, en ny membran-assosiert cyclin, vekselvirker med PFTK1 forsterker PFTK1 kinaseaktivitet og rekrutterer PFTK1 til plasmamembranen [8]. PFTK1 samhandler med Cyclin B2 samlokalisering i kjernen i leverkreft [9]. Den grunnleggende funksjonen til PFTK1 er rapportert som et cyclin-avhengig kinase (CDK) regulerer cellesyklusprogresjon og celleproliferasjon ved spesifikt å kommunisere med medlemmer av cyclin proteiner som cyclin D3 (CCND3), cyclin Y (CCNY) og danner en trefoldig kompleks med cellesyklus-inhibitor p21, fosforylerer således tumor suppressor Rb for G1 /S overgang [10]. Knockout Cyclin Y i glioma cellelinjer som gjør cellesyklus blokkeres i S periode [11]. Cyclin Y samvirker med PFTK1 justere M fasen av mitosen [12]. Disse funnene sammen implisere at PFTK1 kan fungere som en svulst promoter via regulering av cellesyklusen. I mellomtiden flere studier viser at PFTK1 har også andre viktige funksjoner. PFTK1 modulerer oligodendrocyte differensiering via PI3K /AKT vei [13]. Nylig PFTK1 overfører HCC cellemotilitet gjennom inaktivere aktin-bindende bevegelige undertrykkende funksjon av TAGLN2 via fosforylering [14]. PFTK1-mediert fosforylering gjør sammenslutning av CAD til F-actin filamenter, noe som resulterer i å forbedre polymerisasjon av aktin spennings fibrene, og dermed fremme celle migrasjon og invasjon i HCC celler [15,16]. Overekspresjon av PFTK1 kan gi en bevegelig fenotype i maligne hepatocytter [9]. Etter avtale med de molekylære funn, CCNY og /eller PFTK1 alene kan aktivere noncanonical Wnt signal å forbedre cellemotilitet i HCC celler [17]. Alle disse studiene antyder at PFTK1 kan være involvert i celledeling og bevegelighet, men uttrykket og betydningen av PFTK1 i magekreftceller er fortsatt uklar.
I vår studie ønsket vi å gjennomføre en omfattende analyse av PFTK1 uttrykk og sin prognose rolle i magekreftceller. Vi undersøkte uttrykk for PFTK1 og sin tilknytning til kliniske egenskaper og Ki-67 ved hjelp av Western blot og immunhistokjemi (IHC). Vår studie viste at PFTK1 forbedret spredning, migrasjon og invasivitet av magekreftceller ved CCK-8, flowcytometri analyser, kolonidannelse analyser, transwell analysen, påvirket uttrykket av relaterte proteiner. Disse funnene ble først rapportert i mage kreftceller og kan gi en ny innsikt i å utvikle eksperimentelle behandlingsformer i magekreft.
Materialer og metoder
Vevsprøver
Ett hundre og seksti -en mage kreft vevsprøver og matchet tilstøtende noncancer vev ble valgt fra pasienter som gjennomgikk kirurgi mellom 2007 og 2013 ved Avdeling for patologi, Nantong Tumor Hospital. Disse vev ble lagret ved -80 ° C umiddelbart etter kirurgisk fjerning. For histologisk undersøkelse, ble alle gastrisk vevsprøver fiksert i 10% bufret formalin og innstøpt i parafin for seksjonering. Resected prøvene ble klassifisert i henhold til den syvende utgaven av TNM klassifisering for magekreft [1] .Alle den clinicopathological informasjon inkludert alder, kjønn, infiltrasjon dybde, differensiering status, lymfeknute invasjonen, nerve invasjon og TNM stadium. Godkjenningen av fjernet vev for forskningsformål ble hentet fra etikkomiteen i Nantong Tumor Hospital. Signert informert samtykke ble også hentet fra hver pasient. De viktigste kliniske og patologiske variabler ble oppsummert i tabell 1.
Western blot analyse
Western blot analyse ble brukt til å oppdage noen proteiner [18-20]. For det første ble de gastriske caner vev og celler sprakk i lyseringsbuffer (1 M Tris-HCl, pH 7,5, 1% Triton X-100, 10% natriumsulfat (SDS), 1% NP-40, 0,5 M EDTA, 0,5% natrium- deoksycholat, 10 ug /ml aprotinin, 1 mM PMSF, 10 ug /ml leupeptin) og deretter sentrifugert ved 10 000 x g i 30 minutter for å samle supernatanten. Supernatanten ble fortynnet i 2 x SDS lastebuffer og kokt. En ekvivalent mengde av proteiner fra hver prøve ble underkastet elektroforese på 10% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og deretter overført til en Polyvinylidenfluorid (PVDF) membran (Millipore, Bedford, MA). Etter dette ble membranene blokkert i ca. 2 timer ved romtemperatur og deretter inkubert over natten ved 4 ° C med de primære antistoffer. Etter vasking med fosfatbufret saltvann (PBS) inneholdende 0,1% Tween 20 tre ganger, hver gang i 5 minutter, ble membranene deretter inkubert med pepperrotperoksidase bundne IgG som det sekundære antistoff i ytterligere 2 timer ved romtemperatur. Membranene ble deretter utviklet ved hjelp av ECL-deteksjonssystemer (bildeteknologi, Ontario, Canada). Antistoffene som brukes i denne studien inkluderte: anti-PFTK1 (1: 500, Santa Cruz Biotechnology), anti-Cyclin E (1: 500, Santa Cruz Biotechnology), anti-PCNA (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology), anti- GAPDH (1: 1000, Sigma), anti-β-catenin (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology), anti-Dvl1 (1: 600, Santa Cruz Biotechnology), anti-Dvl2 (1: 600, Santa Cruz Biotechnology), anti-Naked1 (1: 500, Cell Signaling), anti-MMP2 (1: 500, Santa Cruz Biotechnology).
Immunhistokjemisk analyserer
i korte trekk ble vevssnitt avvokset i xylen og rehydrert gjennom gradert ethanols. Da seksjonene bråkjølt i 3% metanolisk peroksyd i ca. 10 minutter for å blokkere endogen peroksidase-aktivitet. Ved høyt trykk og temperatur i en autoklav, ble dets immunreaktivitet forbedret i 0,1 M citratbuffer i 3 min. Vevssnitt ble inkubert med anti-PFTK1 (1: 100, Santa Cruz Biotechnology) og anti-Ki-67 (1: 400, Santa Cruz Biotechnology) i 120 minutter ved romtemperatur. I henhold til produsentens instruksjoner, etter vasking i fosfat-bufret saltvann (PBS), ble vevene inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert anti-mus Ig-polymer som et andre antistoff (Envision kit, Dako) i 20 minutter ved romtemperatur. Til slutt, lysbilder ble kontra med hematoxylin, dehydrert, og montert i harpiks mount. For å kvantifisere PFTK1 og Ki-67 protein uttrykk, både omfanget av immunoreaktivitets og intensiteten ble evaluert og scoret. Fem kraftige feltene ble valgt tilfeldig for hver seksjon og minst 300 celler ble telt per felt. For statistisk analyse av PFTK1 ble hvert lysbilde evaluert ved hjelp av en semikvantitativ scoringssystem for både intensiteten av flekken, og prosentandelen av positive maligne celler. Cellene ble bedømt som følger: 1 (≤25% tumorcellene farget), 2 (26% -50% tumorcellene farget), 3 (51% -75% tumorcellene farget), 4 (76% -100% tumorceller farget). For tetthet evaluering: en svak farging; 2 moderat farging; 3 sterk farging. Deretter multipliseres vi de to score og klassifisert dem inn i to grupper: lav uttrykk og høy uttrykk. Som for statistisk analyse av Ki-67, 50% tumorceller farget så lavt uttrykk og ≥50% tumorceller farget så høyt uttrykk. For å unngå tekniske feil, ble fargingsgjentatt tre ganger, og lignende resultater ble oppnådd.
Cellekulturer og transient transfeksjon
MGC803 og HGC27 ble gastriske cellelinjer, som ble kjøpt fra celle bibliotek av den kinesiske Academy of Sciences. Begge ble dyrket i RPMI-1640 medium (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA). SGC7901 og GES1 var en annen mage cellelinjer, som ber ble gitt av Avdeling for patologi Forskning fra Nantong University. SGC7901 og GES1 ble dyrket i DMEM medium (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA). Hele mediet ble foretatt med 10% føtalt bovint serum (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA) supplert med 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin-streptomycin-blanding (GIBCO-BRL, Grand Island, NY, USA ), ved 37 ° C og 5% CO
2. PFTK1 små interfererende RNA (siRNA) ble designet og syntetisert av Shanghai Genechem (Kina). SiRNA rettet mot PFTK1-sekvensene var som følger: 5′-GTTCATTCTTTACCACATT-3 «, 5′-AGGTTGCATCTTTGTTGAA-3′, 5»-AAAGAGTCACCTAAAGTTA-3 «, 5′-ACCCATACAGGAAATCCAA-3». The Flag-PFTK1 plasmid ble kjøpt fra Shanghai Genechem (Kina). Lipofectamine 2000 transfeksjon reagens (Life Technologies) ble brukt for celler transfeksjon følge produsentens instruksjoner.
flowcytometrisk analyse
Først ble alle gastrisk cellelinjer fiksert i 70% etanol over natten ved -20 ° C. sekund, etter å ha vasket med citrat-fosfatbuffer og PBS, ble cellene inkubert med 1 mg /ml RNaseA i 30 minutter ved 37 ° C. Deretter ble cellene farget med 50 ug /ml propidiumjodid i fosfatbufret saltvann (PBS) -Triton i ytterligere 20 min ved 4 ° C. Til slutt ble cellene analysert ved å bruke en Becton Dickinson FACScan flowcytometer BD (San Jose, CA) og Cellquest innhentingsanalyseprogrammer. Eksperimentet ble gjennomført tre ganger.
kolonidannelse assays
MGC803-celler ble dyrket i seks-brønners kulturplater (Corning Inc, Corning New York) ved en tetthet på 200 celler /brønn etter transfeksjon PFTK1 #siRNA og Flag-PFTK1 i henhold til produsentens instruksjoner. Etter to uker ble cellekolonier (≥ 50 celler /koloni) ble tellet ved farging med 0,5% krystallfiolett.
Cell proliferasjonsanalyser
MGC803 celler som omfattet normal, transfeksjon av PFTK1 # siRNA og Flag-PFTK1 ble sådd ut på 96-brønners cellekulturklaseplater (Corning inc, Corning New York) ved en tetthet på 2 x 10
4 celler /brønn i 100 ul kultur og dyrket over natten. Ifølge produsentens instruksjoner, ble cellene målt ved hjelp av en kommersiell CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan). CCK-8 reagenser ble tilsatt til hver brønn i 2 timer inkubering ved 37 ° C. Absorbansen ble avlest ved bølgelengden 450 nm i en automatisk plateleser. Eksperimentene må gjentas minst tre ganger.
sårhelende assay
MGC803-celler ble dyrket i seks-brønners kulturplater (Corning Inc, Corning New York) ved en tetthet på 5 x 10
5 celler /brønn og dyrket til konfluens over natten. Etter transfektert 48 timer ble cellene inkubert med serumfritt medium. En linje ble skrapet i Conflent cellelaget ved hjelp av fie slutten av en 10 ml pipette (tid 0) og cellene ble vasket med PBS. Bilder av migrerende celler ble sekvensielt tatt etter 24 timer, 48 timer i løpet av lukking av såret område.
Trans-brønn assay migrering
Cellemigrering analysen ble utført ved anvendelse av transwell kammer (8,0 lm porestørrelse ; Costar, Cambridge, NY, USA). Omtrent 1 x 10
5 celler /ml ble sådd ut i de øvre kamrene i medium, og RPMI-1640 ble tilsatt til de nederste kamre. Etter 24 timer ble de beste celler som ikke ble overført fjernet og de nederste celler som ble migrert ble fiksert med paraformaldehyd og farget med krystallfiolett. Antallet celler som migrerer i 5 områder ble tellet under 200 x forstørrelse, og midlene for hvert kammer ble bestemt. Alle forsøk ble gjentatt tre ganger
Trans-brønn assay invasjon
Cellemigrering analysen ble utført ved anvendelse av transwell kammer (8,0 lm porestørrelse, Costar, Cambridge, NY, USA).. BD MatrigelTM basalmembran Matrix ble tilsatt til det øvre kammer i 1 t ved 37 ° C. Deretter ble 500 ul medium inneholdende kjemotaktisk faktor plassert i det nedre kammer. Omtrent 1 x 10
5-celler /ml ble sådd i øvre kammer ved 37 ° C i 24 h.Cells ble deretter fiksert med paraformaldehyd og farget med krystallfiolett. Alle forsøk ble gjentatt tre ganger.
Statistisk analyse
All statistisk analyse ble utført ved hjelp av SPSS statistikk 19 programvarepakken. Den PFTK1, Ki-67 uttrykk og clinicopathologic funksjonene ble analysert ved hjelp av χ
2 test. Totalt overlevelseskurver ble beregnet med Kaplan-Meier metoden og ble testet med log-rank test. Multivariat analyse ble analysert ved Cox proporsjonal farer modell, risikoforhold og sin 95% konfidensintervall ble registrert for hver markør. Verdiene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SE, og
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
PFTK1 er overuttrykt i mage tumorvev
Det er rapportert at PFTK1 er en viktig cyclin avhengig kinase som kan regulere cellesyklus, men forskning på magekreft er aldri blitt undersøkt. Siden overekspresjon av PFTK1 ble funnet i leverkreft og spiserørskreft sammenlignet med normalt vev. Så det er interessant å analyse uttrykk for PFTK1 i mage tumorvev og dens coorelation med prolifererende cell nuclear antigen (PCNA). For det første, undersøkte vi uttrykket for PFTK1 i 8 par gastrisk tumorvev og deres tilsvarende nontumorous gastrisk slimhinnevevet ved hjelp av Western blot. Som vist i figur 1, sammenlignet med tilstøtende normale vev, ble oppregulering av PFTK1 påvist i alle de åtte gastrisk vev i samsvar med PCNA. For å bekrefte den kliniske betydningen av PFTK1 i magekreft progresjon, analyser immunhistokjemiske (IHC) ble brukt til å observere uttrykk for PFTK1 protein i 161 mage kreft vev. Som forventet ble det uttrykk for PFTK1 og tumor grad negativt relatert. PFTK1 hadde en signifikant høyere uttrykk i dårlig differensierte prøver enn i godt differensiert eksemplarer, noe som var i samsvar med Ki-67. PFTK1 ble uttrykt i cellemembranen, mens cytoplasma, Ki-67 hovedsakelig i kjernen. Resultatet er vist på figur 2. Deretter undersøkte vi korrelasjonen mellom PFTK1 og Ki-67 av Pearsons korrelasjonskoeffisient. Vi kan se i figur 3A at PFTK1 var positivt assosiert med Ki-67 (Pearsons γ = 0,833,
P
0,001)
(A) Proteininnholdet av PFTK1 var høy i. åtte representative parede prøver av magekreft vev (T) sammenlignet med nontumorous tilstøtende vev (N). GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. (B) Stolpediagrammet viser forholdet mellom PFTK1 protein til GADPH. Middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. (*
P
0,05 sammenlignet med kontroll nontumorous tilstøtende vev).
(A-H) Paraffinembedded vevssnitt ble farget med antistoffer for PFTK1 og Ki-67 og kontra med hematoxylin. (A, E) negativ farging av PFTK1, Ki-67 i tilstøtende normale vev (x 200); (B, F) svak farging av PFTK1, Ki-67 i tillegg differensiert mage kreft vev; (C, G) moderat farging av PFTK1, Ki-67 i moderat differensierte magekreft vev; (D, H) sterk farging av PFTK1, Ki-67 i fattige differensierte mage kreft vev, forsterkning (× 100, × 400).
(A) Sammenheng mellom PFTK1 og Ki-67 uttrykk i magekreft tissues.The sammenheng mellom PFTK1 og Ki-67 uttrykk ble evaluert av Pearson korrelasjon test (r = 0,833,
P
0,001). (B) Kaplan-Meier overlevelsesanalyse av 161 mage kreftpasienter basert på PFTK1 uttrykk nivå. Ifølge PFTK1 prosenter, ble pasientene delt inn i høye PFTK1 expressers og lave PFTK1 expressers. Og median overlevelse tid og hazard ratio ble vist. Pasienter i high-uttrykk PFTK1 gruppen hadde en signifikant kortere total overlevelse (
P
0,01).
PFTK1 er forbundet med negative kliniske egenskaper og dårlig mage kreft pasientenes overlevelse
klinisk forening studien ble undersøkt for å analysere korrelasjonen av PFTK1 med magekreft clinicopathological funksjoner blant 161 vev. De clinicopathological data ble oppført i tabell 1. Høy uttrykk for PFTK1 var relatert med svulst Karakter (
P
= 0,009), infiltrasjon dybde (
P
= 0,002), lymfeknute invasjonen (
P
= 0.000) samt Ki-67 (
P
= 0,000). Men det var ingen sammenheng mellom PFTK1 uttrykk og andre kliniske variabler som alder, kjønn, nerve invasjon, og TNM stadium.
I tillegg ble Kaplan-Meier analyse brukes til å analysere sammenhengen mellom PFTK1 uttrykk og 161 pasientenes overlevelse. Ifølge overlevelseskurver, ble høyt uttrykk for PFTK1 åpenbart korrelert med dårlig total overlevelse, mens lav uttrykk for PFTK1 var korrelert med bedre total overlevelse. Og median overlevelse tid og hazard ratio ble vist i figur 3B. Videre univariat analyse i mage kreft vev viste at svulsten Karakter (
P
= 0,020), infiltrasjon dybde (
P
= 0,011), lymfeknute invasjonen (
P
= 0,011), TNM stadium (P = 0,031), PFTK1 uttrykk (
P
= 0,002), og Ki-67 uttrykk (
P
= 0,013) var prognostiske faktorer av total overlevelse (tabell 2 ). Multivariat analyse ved hjelp av Cox proporsjonale farer modell foreslo PFTK1 var en selvstendig prognostiske indikatorer for pasientenes total overlevelse (
P
= 0,048, Tabell 3). For å oppsummere, våre resultater viste at uttrykket av PFTK1 er signifikant assosiert med kliniske egenskaper og dårlig total overlevelse.
Uttrykket av PFTK1 i nontransfected og transfekterte mage kreftceller
Som PFTK1 er overuttrykt i mage tumorvev, da vi analyserte uttrykk for PFTK1 i cellelinjer inkludert MGC803, SGC7901, HGC27, GES1. Fra figur 4A, uttrykk for PFTK1 i normal mage cellelinje GES1 var lavere enn i mage cellelinjer MGC803, SGC7901, HGC27. For ytterligere å studere funksjonen av PFTK1 i magekreftceller
in vitro, etter MGC803 celler ble transfektert med PFTK1-siRNA og SGC7901 celler ble transfektert med flagg-PFTK1. Western blot ble anvendt for å måle den PFTK1 uttrykk. Når Flag-PFTK1 ble transfektert i SGC7901, PFTK1 hadde et høyere uttrykk (Fig 4B). Mens PFTK1-siRNA ble transfektert i MGC803, PFTK1-siRNA # 4 oppnådde den høyeste knockdown effektivitet sammenlignet med andre PFTK1-siRNA (Fig 4C). Så vi valgte the Flag-PFTK1 og PFTK1-siRNA # 4 for å fortsette følgende eksperimenter.
(A) PFTK1 protein nivå i SGC7901, MGC803, HGC27, GES1 mage cellelinjer. (B) SGC7901-celler ble transient transfektert med flagg-PFTK1 plasmid som beskrevet ovenfor i 48 timer. Western blot-analyse ektopisk ekspresjon av PFTK1. (C) MGC803 celler ble transient transfektert med PFTK1-siRNA # 1, 2, 3, 4 i 48 timer. Western blot-analyse knockdown ekspresjon av PFTK1. Stolpediagrammet viser forholdet mellom PFTK1 protein til GADPH. Middelverdi ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. (*
P
0,05)
PFTK1 kan fremme celler migrere og invasiv
in vitro
Det er rapportert PFTK1 overekspresjon kan. øke Cad fosforylering og forbedre cad å binde seg til F-actins, som fremmer leverkreft celler migrasjon [16]. Gitt at PFTK1 var relatert til lymfeknute invasjonen i magekreftprøver, studerte vi om PFTK1 kan påvirke mage kreftceller migrasjon og invasjon. Sårhelende analyse og Transwell analyser viste at migrering av Flag-PFTK1-celler ble særlig økt sammenlignet med kontrollceller. Tvert imot ble det migrering av PFTK1-siRNA # 4 celler redusert sammenlignet med kontrollceller (figur 5A og 5B). Videre Matrigel invasjonen analysene viste også at oppregulering av PFTK1 ved transfeksjon Flag-PFTK1 kunne fremme invasive evne, og knockdown av PFTK1 kunne dempe invasiv evne mage kreftceller (Fig 5C). Total, vi kunne komme til en konklusjon om at PFTK1 fremme migrasjon og invasjon av mage kreftceller.
(A) Migrasjon av celler transfektert med Ctrl, flagg-PFTK1, PFTK1-siRNA # 4was undersøkt av sårhelende analyser . Såret av celler ble visualisert ved 0 timer, 24 timer og 48 timer. (B) Cell migrasjon transfektert med Ctrl, flagg-PFTK1, PFTK1-siRNA # 4 ble undersøkt av trans-brønns analyser. (C) Celle invasiv evne transfektert med Ctrl, flagg-PFTK1, PFTK1-siRNA # 4 ble undersøkt med Matrigel cellekultur kamre. Den venstre delen viste MGC803 celler transfektert med Ctrl, flagg-PFTK1. Den høyre delen viste MGC803 celler transfektert med Ctrl, PFTK1-siRNA # 4. Mean ± SD av tre uavhengige forsøk (*
P
0,05). Disse resultatene viser overekspresjon av PFTK1 kan forbedre celler migrasjon og invasjon, mens knockdown PFTK1 redusere celler migrasjon og invasjon.
Uttrykk for PFTK1 fremme spredning av magekreftceller
Ifølge resultatene presentert ovenfor, ble PFTK1 positivt korrelert med PCNA, Ki-67 ekspresjon og tumor karakter, som var da celler proliferasjon. Vi analyserer rollen PFTK1 på å regulere spredning evne. Først ble MGC803 celler transfektert med PFTK1-siRNA # 4, Flag-PFTK1 og var fast bestemt CCK-8 analysen. Overekspresjon av PFTK1 demonstrert for å forbedre mage celler vekst enn kontroll, mens knockdown av PFTK1 viste det motsatte resultat (figur 6A). I samsvar med styrke cellevekst følgende PFTK1 overekspresjon, kolonidannende analysen viste også det kan øke kolonidannelse. Og knockdown av PFTK1 viste det samme resultat med CCK-8-analysen (fig 6B). Til slutt, utforsket vi spredning mekanismen for PFTK1 ved flowcytometrisk analyse, og data antydet at flere gastrisk kreft celler ble funnet i S-fasen i nærvær av ektopisk PFTK1, mindre gastrisk kreft celler ble funnet i S-fasen i transfeksjon med PFTK1- siRNA # 4 (figur 6C). For å oppsummere, disse dataene viste at PFTK1 deltatt i cellesyklusregulering ved å akselerere G0 /G1 -S overgang.
(A)
In vitro
Cell Counting Kit (CCK) -8-analysen ble brukt til examin celler vekst ved absorbans ved 450 nm på det angitte tidspunkt. (Dataene er midler ± SD fra tre uavhengige eksperimenter *
P
. 0,05) (B) Colony dannelse analyse av MGC803 celler transfektert med Ctrl, flagg-PFTK1, PFTK1-siRNA 4 #. (C) Cellesyklus analyse ble vist etter transfektert med Ctrl, flagg-PFTK1, PFTK1-siRNA # 4 av flowcytometri. The Flag-PFTK1 celle nummer ble redusert i G0 /G1 fase og tilsvarende økning ble observert i S-fasen sammenligne med Ctrl. Den PFTK1-siRNA # 4 celle nummer ble økt i G0 /G1 fase og tilsvarende reduksjon ble observert i S-fasen sammenligne med Ctrl. Den venstre delen viste MGC803 celler transfektert med Ctrl, flagg-PFTK1. Den høyre delen viste MGC803 celler transfektert med Ctrl, PFTK1-siRNA # 4. Disse resultatene viser overekspresjon av PFTK1 kan øke celler spredning, mens knockdown PFTK1 redusere celler spredning.
Signal sti PFTK1 fremme spredning og migrasjon
For ytterligere å studere mekanismen som PFTK1 regulerte mage kreftceller spredning, migrasjon, invasjon, bestemte vi oss for å oppdage den relaterte protein endret av Western blot når PFTK1 ble overexpressed eller knockdown i MGC803. Som rapportert, kunne PFTK1 aktivere noncanonical Wnt signal i leverkreft [17]. Wnt signal var relatert med svulster spredning og migrasjon. Oppregulering av PFTK1 delvis aktivert Dvl2, Naked1, MMP2 og forhøyet uttrykk av cellesyklusen regulator Cyclin E, men ikke endret Dvl1, β-catenin. Hva mer, fant vi at knockdown av endogen PFTK1 uttrykk kan redusere Dvl2, Naked1, MMP2, Cyclin E uttrykk, men ikke endret Dvl1, β-catenin (Fig 7).
Effektene av PFTK1 på uttrykk for cyclin E, PCNA, MMP2, Wnt relatert trasé som β-catenin, Dvl1, Dvl2, Naked1 av western blot. Økende PFTK1 uttrykk promted uttrykk for Cyclin E, PCNA, Dvl2, Naked1, MMP2, men hadde ikke endret uttrykk av β-catenin, Dvl1. Mens slå ned endogen PFTK1 uttrykk viste det motsatte resultat.
Diskusjoner
Som en av de høyest forekomst kreft i verden, den 5-års overlevelse av magekreft er mindre enn 20% -25% i USA, Europa og Kina på grunn av lett å tilbakefall og høy metastase rate i postoperativ [2]. Helicobacter pylori-infeksjon, endring av onkogen og tumorsuppressorgener, blir reguleringen av cellesyklusen og telomerase aktivering forbundet med magekreft [21]. Unormal cellesyklusregulering i utviklingen av magekreft har vært tema for forskning i de senere år. Nøyaktig og streng regulering av cellesyklusen, avhenger av enkelte faktorer, inkludert kontrollcellesyklusen avhengig kinase (CDK), cellesyklus protein (Cykliner), og cellesyklusavhengig kinaseinhibitorer (CKIs). Alle er kjent med 11 klassiske CDK (CDK1-11), PFTK1 som en ny cellesyklus avhengig kinase er funnet ikke sammen og sammenhengen mellom PFTK1 og kreft er ikke mye, også i magekreft [22].
PFTK1 ble opprinnelig funnet i nervesystemet hos rotter [23]. PFTK1 modulerer oligodendrocyte differensiering via PI3K /AKT vei [13]. Den nyeste forskningen rapportert at PFTK1 er oppregulert i menneskelig spiserørskreft, leverkreft og forbinder med tumorvekst, migrasjon og invasjon [14,24]. I vår studie, utforsket vi om uttrykket av PFTK1 var involvert i magekreftceller spredning, migrasjon og invasjon. Til å begynne med viste vi at PFTK1 uttrykt høyere i magekreft vev enn i tilstøtende nontumor vev ved western blot at i samsvar med resultatene i andre kreftformer (fig 1). Deretter viste immunhistokjemi høy uttrykk for PFTK1 var relatert med svulst klasse, infiltrasjon dybde, lymfeknute invasjonen samt Ki-67 i 161 mage kreft vev. Disse funnene blir bedt PFTK1 kan påvirke magekreft spredning og migrasjon. Kaplan-Meier analyse viste at PFTK1 spådd dårlig total overlevelse (figur 3B). Multivariat analyse ved hjelp av Cox proporsjonale farer modell foreslo PFTK1 var en selvstendig prognostiske indikatorer for pasientenes total overlevelse. For ytterligere å forstå regulerende effekt av PFTK1 på mage celler, ble MGC803 celler transfektert med PFTK1-siRNA # 4, Flag-PFTK1
in vitro plakater (figur 4). Fig 6 viste PFTK1 kunne fremme proliferasjon av CCK-8, kolonidannende analyse. Samtidig økte PFTK1 G1-S-fasen transformasjon i henhold til flowcytometrisk, som sammenfaller med det funn av PFTK1 i leverkreft [10]. Cyclin E var en av de viktige regulatoriske faktorer i løpet av G1-S-faseomdannelse og Cyclin E-protein kan definere som en prognostisk faktor for pasienter med magekreft [25]. Interessant nok var PFTK1 nivå økt etter transfeksjon med flagg-PFTK1 consistented med PCNA, MMP2 og Cyclin E (Fig 7).
I tillegg har vi også undersøkt om PFTK1 kan påvirke celler migrasjon og invasjon evne ved sårhelende analyse og Transwell analyser. Resultatene viste at overekspresjon av PFTK1 kunne forbedre celler migrering og invasjon, som kan være på grunn av en endring av nedstrøms for PFTK1 signalveier (figur 5). Som rapportert i leverkreft, PFTK1 og /eller CCNY alene kan aktivere ikke-kanoniske Wnt signal forårsaker celler migrasjon og invasjon [17]. Wnt trasé inkludert den kanoniske Wnt /β-catenin signalering og ikke-kanoniske Wnt signale måte (Wnt /Ca
2 + og Wnt /PCP). Wnt signal måte spilt en viktig rolle i utviklingen av kreft og regulert celler spredning, migrasjon og invasjon [26]. Deretter fant vi uttrykk av proteiner β-catenin, Dvl1, Dvl2, Naked1. Dvl2 og Naked1 var positivt korrelert med PFTK1 og de kanoniske Wnt /β-catenin relaterte proteiner beta-catenin, hadde Dvl1 ikke endret (figur 7).
