Abstract
Bakgrunn
Vi har tidligere vist at kjernekraft og cytoplasma opphopning av det intracellulære domenet (EP- ICD) av epitelial celleadhesjonsmolekyl (EpCAM) ledsaget av en tilsvarende reduksjon av den ekstracellulære domene (EPEX), forekommer i aggressive thyroid kreft. Denne studien er designet for å avgjøre hvorvidt lignende opphopning av Ep-ICD er en vanlig hendelse i andre epiteliale kreftformer.
Metode og resultater
Ti epiteliale krefttilfeller ble immunohistochemically analysert ved hjelp av Ep-ICD og EPEX domene -spesifikke antistoffer. Den subcellulære lokalisering av EPEX og Ep-ICD i den humane kolon adenocarcinom-cellelinje CX-1 ble observert ved anvendelse av immunfluorescens. Nuclear og cytoplasmisk Ep-ICD-ekspresjon ble øket i kreft i bryst (31 av 38 vev, 82%), prostata (40 av 49 vev, 82%), hode og nakke (37 av 57 vev, 65%) og spiserør ( 17 av 46 vev, 37%) sammenlignet med de tilsvarende normale vev som viste membran lokaliseringen av proteinet. Viktigere, Ep-ICD ble ikke påvist i kjernen av epitelceller i de fleste normale vev. Høy kjernekraft og cytoplasma Ep-ICD opphopning også skjedd i de andre seks epiteliale krefttyper analysert – lunge, tykktarm, lever, blære, bukspyttkjertel, og eggstokkreft. En samtidig reduksjon i membran EPEX ekspresjon ble observert i et delsett av alle krefttyper. Mottaker opererer karakteristikk analyse avslørte atom Ep-ICD fornem brystkreft med 82% sensitivitet og 100% spesifisitet og prostatakreft med 82% sensitivitet og 78% spesifisitet. Lignende funn ble observert for cytoplasma opphopning av Ep-ICD i disse kreftformene. Vi gir kliniske tegn på økt kjernekraft og cytoplasma Ep-ICD akkumulering og en reduksjon i membran EPEX i disse kreftformene.
Konklusjoner
Økt atom og cytoplasma Ep-ICD ble observert i alle epiteliale kreft analysert og utmerket dem fra normalt vev med høy sensitivitet, spesifisitet, og AUC. Utvikling av en robust høy gjennomstrømning analyse for Ep-ICD vil lette fastsettelse av sin diagnose, prognostisk og terapeutisk relevans i epiteliale kreft
Citation. Ralhan R, Han HC-H, så AK-C, Tripathi SC , Kumar M, Hasan MR, et al. (2010) Nuclear og Cytoplasmatiske Opphopning av Ep-ICD blir ofte oppdaget i Human epiteliale cancere. PLoS ONE 5 (11): e14130. doi: 10,1371 /journal.pone.0014130
Redaktør: Marc Vooijs, University Medical Center Maastricht, Nederland
mottatt: 20 juni 2010; Godkjent: 24 oktober 2010; Publisert: 30.11.2010
Copyright: © 2010 Ralhan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansielt støttet av Mount Sinai Foundation of Toronto, Da Vinci Gala fundraiser, Alex og Simona Shnaider Chair i skjoldbruskkjertelen, Mount Sinai Hospital Department of Medicine Research Fund, Alex og Simona Shnaider Laboratory i molekylær onkologi, og Temmy Latner Dynacare Family Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) er et 40 kDa-transmembran-glykoprotein som tjener viktige roller i celleadhesjon, celleproliferasjon, differensiering, migrasjon, cellesyklusregulering og er implisert i kreft og stamcellesignale [1]. EpCAM er en av de mest undersøkte proteiner i humane kreftformer, ofte overuttrykt i humane ondartede sykdommer, lokalisert på plasmamembranen av tumorceller, og om enn i mindre grad i den normale epitel [2], [3], [4], [5 ], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Alle disse studiene benyttet antistoffer rettet mot det ekstracellulære domenet av EpCAM (EPEX) [13]. Disse tallrike rapporter om den celleoverflate-ekspresjon av EpCAM i humane kreftformer har antydet at det kan være en ideell kandidat for anvendelse som en epitelial cancer markør og et terapeutisk mål [18], [19], [20], [21]. Paradoksalt nok har de fleste kliniske studier med murine monoklonale antistoffer nemlig edrecolomab i tykktarmskreft, eller humanisert antistoff, adecatumumab, i brystkreft vist begrenset effekt [14], [22]. En forståelse av disse begrensningene er en utfordring for onkologer og er av stor betydning for fremtidig utvikling av mer effektive anti-EpCAM strategier. I denne sammenheng Gires og Baeuerle [23] diskutert behovet for å måle EpCAM uttrykk nivåer i kreftceller og deres innvirkning på utfallet av en klinisk studie. Men ingen av de tidligere studier har analysert EpCAM uttrykk i tumorvev, prospektivt eller retrospektivt. Hvorvidt den nylig rapportert reguleres intramembrane proteolyse (RIP) mediert tap av EpCAM fra tumorcelleoverflaten kan være en av årsakene til den begrensede effekten av EpCAM-baserte kreft terapi er ikke klarlagt [24]. Spaltingen av EpCAM ectodomain, EPEX, ved proteasen tumornekrosefaktor α-omdannende enzym (TACE) og dens avgivelse er blitt vist å frigi sitt intracellulære domene (Ep-ICD), som deretter translocates til kjernen som resulterer i aktivering av onkogene signalisering [ ,,,0],24]. Foreningen av Ep-ICD med FHL2 og Wnt pathway komponenter p-catenin og Lef-1 danner en kjernefysisk komplekse som binder DNA på Lef-1 konsensus nettsider og induserer gentranskripsjon, noe som fører til økt celledeling [24]. Den kliniske signifikans av Ep-ICD i humane kreftformer må bestemmes i lys av de flere roller EpCAM som et onkogen signal transduser, celle adhesjonsmolekyl, og kreft stamcelle markør [24], [25], [26], [27 ].
Nuclear lokalisering av Ep-ICD ble først rapportert i en studie av 26 tilfeller av human tykktarmskreft, men ikke i normal colonic epithelia [24]. Deretter rapporterte vi kjernekraft og cytoplasma opphopning av Ep-ICD i ulike undergrupper av skjoldbrusk kreft som var forbundet med en gjensidig reduksjon i membran EPEX, og også observert en sammenheng av kjernefysisk Ep-ICD opphopning med tumor aggressivitet og dårlig sykdom prognose [28] . Den brede heterogenitet i solide svulster warrants undersøkelse for å finne ut om kjernekraft og cytoplasma Ep-ICD uttrykk kan også forekomme i andre menneskelige kreftformer. I denne studien, har den subcellulære compartment akkumulering av Ep-ICD blitt behandlet i et bredt utvalg av epiteliale kreftformer, nemlig, bryst, prostata, hode og nakke, spiserør, eggstokk, bukspyttkjertel, tykktarm og rektum, lunge, urinblære, lever karsinomer ved immunhistokjemi (IHC) (ved bruk av et spesifikt antistoff rettet mot Ep-ICD domene av EpCAM). Kjernekraft og cytoplasmatiske Ep-ICD har også blitt kvantitativt oppdaget i CX-1 tykktarmskreftceller ved hjelp av immunfluorescens. Med unntak av en tidligere rapport i tykktarmskreft og vår studie i skjoldbruskkjertelkreft [24], [28], nyheten av denne rapporten er det demonstrasjon av den utbredte forekomsten av økt kjernefysiske og cytoplasma opphopning av Ep-ICD i forbindelse med variabel membran EPEX uttrykk i et bredt spekter av epiteliale kreftformer.
Metoder
Etikk erklæringen
Denne undersøkelsen ble gjennomført i henhold til de prinsipper som er nedfelt i Helsinkideklarasjonen. Studien ble godkjent av Mount Sinai Hospital forskningsetikk Board, Toronto, Canada. De arkiverte parafin vevsblokker av et hode og nakke kreft studien godkjent av Human Etisk komité av All India Institute of Medical Sciences, New Delhi, India, med samtykke fra pasientene, ble brukt i denne studien.
pasienter og prøver vev
for IHC analyse, arkivert vevsblokker av hode og nakke plateepitelkarsinom (HNSCCs) og normalt vev, samt esophageal plateepitelkarsinom (ESCCs) ble hentet fra svulsten bank, vurdert av patolog og brukes til å klippe vevssnitt for farging med Ep-ICD og EPEX antistoffer som beskrevet nedenfor. De kliniske og patologiske data registrert inkludert klinisk tumorstadium, stedet for lesjoner, histopatologiske differensiering, alder og kjønn i en pre-designet Performa som beskrevet av oss tidligere [29]. Tissue-mikromatriser (TMA) av brystkreft og tilstøtende normalt brystvev (IMH-371), prostatakreft og tilstøtende normal prostatavev (IMH-303), lungekreft (IMT-305), tykktarms- og endetarmskreft (IMH-306) , vanlige epiteliale kreftformer består av lever, urinblæren, eggstokker, bukspyttkjertel, bryst og prostata (IMH-327) ble anskaffet fra IMGENEX Corp (San Diego, California). Tjueen vevsblokker av benign prostata hyperplasi (BPH) ble hentet fra vevet bank i Mount Sinai Hospital, vurdert av patologen og brukes til å klippe vevssnitt for farging med Ep-ICD og EPEX antistoffer.
Antistoffer og cellelinje
Anti-humant Ep-ICD kanin-monoklonalt antistoff ble oppnådd fra Epitomics Inc. (Burlingame, CA). Anti-human EPEX mus monoklonalt antistoff (MOC-31) ble oppnådd fra ABD Serotec (Raleigh, NC). Den α-Ep-ICD-antistoff 1144 gjenkjenner det cytoplasmatiske domene av human EpCAM og har vært brukt i vår nylig undersøkelse på Ep-ICD i tyreoideacancer [28]. MOC-31 gjenkjenner det ekstracellulære domene av EpCAM. Begge antistoffer er blitt anvendt i vår nylig undersøkelse i tyreoideacancer [28].
human colon adenocarcinoma cellelinje CX-1 ble dyrket i RPMI-1640 medium inneholdende 100 ug /ml streptomycin og 100 U /mL penicillin , 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% ikke-essensielle aminosyrer. STR profilen av cellelinjen ble funnet å være i overensstemmelse med den kjente profil CX-1 i databasene i den tyske samling av mikroorganismer og cellekulturer (DSMZ, Braunschweig, Tyskland).
Clinicopathological karakteristika pasienter
Femti-sju HNSCC pasienter i alderen 29 til 75 år ble inkludert i studien. Deres diagnoser var basert på klinisk undersøkelse og histopatologisk analyse av vevsprøver. Svulstene ble histologisk gradert samt differensiert plateepitelkarsinom (WDSCC), moderat differensiert plateepitelkarsinom (MDSCC) eller dårlig differensiert plateepitelkarsinom (PDSCC). Tjue vev tatt fra en fjern stedet HNSCCs (med histologisk bekreftet normal epitel referert til her som hode- og nakke normalt vev) ble også evaluert for Ep-ICD og EPEX uttrykk.
Førti-seks ESCC pasienter ble inkludert i denne studien. Deres diagnoser var basert på klinisk undersøkelse og histopatologisk analyse av vevsprøver. Svulstene ble histologisk gradert også, moderat eller dårlig differensierte SCCS. Tjue vev tatt fra en fjern stedet ESCCs (med histologisk bekreftet normal epitel referert til her som esophageal normalt vev) ble også evaluert for Ep-ICD protein uttrykk. Tilsvarende førti vev tatt fra en fjern stedet ESCCs (med histologisk bekreftet normal epitel referert til her som esophageal normalt vev) ble evaluert for EPEX uttrykk.
TMA av brystkreft og tilstøtende normalt brystvev, prostatakreft og tilstøtende normalt vev prostatakreft, lungekreft, tykktarms og endetarmskreft, felles epiteliale cancere som består av leveren, urinblæren, eggstokker, bukspyttkjertel, bryst og prostata ble undersøkt. For Ep-ICD, antall vev analysert var 38 brystkreft og 25 tilsvarende normale vev, 49 prostatakreft og 9 tilsvarende normale vev og 21 godartet prostata hyperplasier, 57 HNSCCs og 20 tilsvarende normale vev, 46 ESCCs og 20 tilsvarende normale vev, 59 hver av lunge og tykktarm kreft, 10 hver av blære, eggstokkene og bukspyttkjertel kreft, og 9 leverkreft. For EPEX, antall vev som var tilgjengelige for immunhistokjemisk analyse inkluderte 40 brystkreft og 29 tilsvarende normale vev, 49 prostatakreft og 9 tilsvarende normale vev og 21 godartet prostata hyperplasier, 39 HNSCCs og 20 tilsvarende normale vev, 47 ESCCs og 40 tilsvar normalt vev, 59 tilfeller hver av lunge og tykktarm kreft, og 10 tilfeller hver av blære, eggstokkene, og leverkreft.
Immunhistokjemisk analyse av Ep-ICD uttrykk i epiteliale kreft
serie~~POS=TRUNC parafin- innebygde seksjoner (5 um tykkelse) av HNSCCs, ESCCs og deres normale vev ble anvendt for Ep-ICD og EPEX immunofarging som vi har beskrevet nylig [28]. De TMA lysbilder og de enkelte delene vev ble de-paraffinized ved å bake ved 62 ° C i 1 time i vertikal retning og rehydrert i xylen og gradert alkohol serien. Deretter ble antigen gjenfinning betingelser optimalisert og ble utført i 0,01 M citratbuffer, pH 6,0 i 3 minutter ved 115 ° C, ved hjelp av en TTmega ovn (Milestone Inc. Shelton, CT). Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert ved inkubering seksjoner i metanol inneholdende 0,3% hydrogenperoksid i 20 minutter. Etter blokkering av ikke-spesifikk binding med normal heste eller geiteserum, ble seksjonene inkubert med α- Ep-ICD kanin-monoklonalt antistoff 1144 (fortynning 1:200) i 30 minutter og biotinylert geit anti-kanin sekundært antistoff i 30 minutter og inkubert med MOC-31 (fortynning 1:200) i 30 minutter med tilsvarende biotinylert sekundært antistoff (hest anti-mus eller geit anti-kanin) (Vector Laboratories, Burlington, Ontario, Canada) i 30 minutter. Seksjonene ble endelig inkubert med Vectastain Elite ABC Reagens (Vector Laboratories) og diaminobenzedine ble brukt som kromogen.
Evaluering av immunhistokjemisk farging
TMA bildene ble anskaffet ved hjelp av Visiopharm Integrator System (Visiopharm , Horsholm, Danmark). Ep-ICD og EPEX immunopositive farging ble evaluert i fem områder i de oppkjøpte bilder av vevssnitt og gjennomsnittet av disse fem score ble beregnet. Snittene ble scoret som positivt hvis epitelceller viste immunopositivity i plasmamembranen, cytoplasma, og /eller kjernen når observert av to evaluatorer som var blindet for den kliniske histopatologi og diagnose. Disse avsnittene ble bedømt på basis av prosentvise positivitet som følger: 0, 10% celler; 1, 10-30% celler; 2, 30-50% celler; 3, 50-70% celler; og 4, ved 70% celler viste immunoreaktivitet som tidligere beskrevet [28]. Snittene ble også mottok en semi-kvantitativt på grunnlag av intensitet som følger: 0, ingen; 1, mild; 2, moderat; og 3, intens. Til slutt ble en total poengsum (som varierer fra 0 til 7) oppnådd ved å legge resultatet av prosent positivitet og intensitet for hver kreft og § normalt vev. De immunhistokjemiske data ble utsatt for statistisk analyse som beskrevet tidligere [29].
Statistisk analyse
IHC data ble utsatt for statistisk analyse ved hjelp av SPSS 17.0 programvare (SPSS, Chicago, IL) og Graphpad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Scatter tomter ble brukt til å bestemme fordelingen av total poengsum for membran, kjernekraft, og cytoplasma Ep-ICD uttrykk i normale og kreft vev. Mottaker som opererer karakteristikk (ROC) kurve-analyser ble utført for å beregne følsomhet, spesifisitet og arealet under kurven (AUC) verdier i hver krefttype for nukleær og cytoplasmisk Ep-ICD. Basert på den optimale sensitivitet og spesifisitet, ble en IHC stillingen cut-off-verdi på ≥4 definert som immunopositive jevnt for alle krefttyper som ble analysert for statistisk undersøkelse.
Immunofluorescensanalyse av Ep-ICD og EPEX lokalisering i CX -1 koloncancercellelinje
CX-1 colon cancerceller ble dyrket på objektglass opp til 60% konfluens og deretter inkubert med enten α-Ep-ICD kanin-monoklonalt antistoff 1144 (1:100 fortynning) eller mus monoklonalt antistoff MOC-31 (1:100). For Ep-ICD, det sekundære antistoff som ble benyttet var en tetrametyl rhodaminisotiocyanat (TRITC) -merket geite-anti-kanin-antistoff (Sigma-Aldrich, 1:200 fortynning). For EPEX, det sekundære antistoff som ble benyttet var et fluorescein isothiocyanat (FITC) -merket geite-anti-mus-antistoff (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, 1:200 fortynning). Lysbilder ble sett ved hjelp av et Olympus Upright fluorescens mikroskop (BX61) og bildene ble analysert ved hjelp Volocity programvare (PerkinElmer, Waltham, MA).
Resultater
Immunhistokjemisk analyse av Ep-ICD uttrykk i menneskelig epitelial kreft
de kjente kliniske parametre, histopatologi, og Ep-ICD IHC score for hver krefttype er gitt i tilleggs Tabeller S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, S9, S10. Blant de krefttypene som ble sammenlignet med normalt vev (tabell 1), brystkreft viste 82% kjernekraft Ep-ICD positivitet (31 av 38 vev) og 84% cytoplasma Ep-ICD positivitet (32 av 38 vev). Basert på en IHC cut-off score på fire, ble ingen av de 25 normale bryst vev analysert anses positivt for atom Ep-ICD; 56% (14 av 25 vev) viste ingen påvisbar nukleær farging i bryst lobular celler eller ductal celler, mens de resterende 11 tilfeller viste lave IHC score. Prostatakreft utstilt 82% kjernekraft positivitet (40 av 49 vev) og 82% cytoplasma positivitet (40 av 49 vev). Nuclear Ep-ICD var positiv i to av ni normal prostata vev, og cytoplasmatiske positivitet ble observert i en av ni vev. Blant de 21 BPH vev analysert, ble cytoplasmatiske positivitet observert i en av 21 vev; ingen av vev var atom Ep-ICD positiv basert på en score cutoff på 4. I HNSCCs, Ep-ICD atom positivitet var 65% (37 av 57 vev) og cytoplasmatiske positivitet var 74% (42 av 57 vev). ESCC atom positivitet var 37% (17 av 46 vev) og cytoplasmatiske positivitet var 70% (32 av 37 vev). Kjernekraft og cytoplasmatiske Ep-ICD ble hver observert å være positiv i bare 1 av 20 normalt vev i hode og nakke kreft. For ESCC, ble atom positivitet observert i to av 20 normalt vev og cytoplasmatiske positivitet ble observert i 6 av 20 normale vev. Alle gjenværende epiteliale kreftformer som vises nukleær og cytoplasmisk akkumulering av Ep-ICD (tabell 1). Spesielt, selv om bruken av en cutoff av ≥4 for å bestemme positivitet førte til redusert atom og cytoplasmisk positivitet i bukspyttkjertel kreft, en undersøkelse av poeng viste at en cutoff på 3,5 ville ha identifisert 7 av 10 tilfeller av kjernefysisk Ep-ICD akkumulering og 5 av 10 tilfeller av cytoplasma Ep-ICD akkumulering (se utfyllende tabell S8).
De representative photomicrographs vist i figur 1 viser Ep-ICD farging i normale og kreft vev. Panel A viser dominerende membran lokalisering av Ep-ICD, og ingen nukleær farging i det normale brystvev (I), mens den kreftvev viser nukleær og cytoplasmisk Ep-ICD akkumulering (II). Panel B (la) fremstiller lavt nivå av membran Ep-ICD i epitelceller og basalcellene vise svak, nukleær farging i normal prostatavev og i benign prostata hyperplasi (Ib). Prostata kreftvev viser intens cytoplasmisk og økt nukleær farging (panel B, II). I endotelceller, ble sterk Ep-ICD farging konsekvent observert. I adipocytter, beising varierte fra fraværende til mild i enkelte celler. Lymfocytter farget sterkt i tumorvev, mens ingen ble observert i normale vev. Glatt muskulatur flekker var fraværende eller svak i alle tilfeller. Ingen påvisbar Ep-ICD farging ble observert i normale vev esophageal (panel C, I), mens den ESCC viste intens atom og cytoplasmisk farging (panel C, II). Hodet og nakken normal slimhinne viste svak membran Ep-ICD (panel D, I), mens intens kjernekraft og cytoplasma farging ble observert i HNSCC (panel D, II).
De representative photomicrographs skildre Ep-ICD farging i normale og kreft vev. Panel A viser dominerende membran lokalisering av Ep-ICD, og ingen nukleær farging i det normale brystvev (I), mens den kreftvev viser nukleær og cytoplasmisk Ep-ICD akkumulering (II). Panel B viser lavt nivå av membran Ep-ICD i epitelceller og basalcellene vise noen nukleær farging i normal prostatavev (Ia) og benign prostata hyperplasi (B, lb), mens den kreftvev viser intens cytoplasmisk og atom farging (II). Panel C viser ingen påvisbar Ep-ICD farging i det normale vev esophageal (I), mens den ESCC viser intens nukleær og cytoplasmisk farging (II). Panel D viser hode og hals normal slimhinne som viser svak membran Ep-ICD (I), mens den HNSCC viser intens nukleær og cytoplasmisk farging (II). Original forstørrelse × 400.
Økt atom og cytoplasma immunoreaktivitets og redusert eller ble observert fravær av membranfarging av Ep-ICD i kreft i blæren (figur 2, panel A), lunge (B), lever (C), eggstokk (D), tykktarmen (E), og bukspyttkjertel (F). Spesielt, ble membran Ep-ICD farging observert i noen tilfeller av hvert epitelial kreft analysert. Representative mikrofotografier av prostatakreft og tykktarmskreft som viser heterogen Ep-ICD farging er vist i figur 3 A, B. Noen områder av vev seksjon viste overveiende membran og cytoplasmisk svak, men ingen nukleær lokalisering av Ep-ICD (figur 3A, B – venstre kvadrat), mens andre deler av samme vev delen viste kjernekraft og cytoplasma opphopning av Ep-ICD med fravær av membran Ep-ICD uttrykk (figur 3A, B – rett firkantet). De negative og positive kontrollmikrofotografier er vist i figur 4.
Økt atom og cytoplasmisk immunreaktivitet og redusert eller fravær av membranfarging av Ep-ICD ble observert i kreft i blære (panel A), lunge (panel B ), lever (panel C), eggstokk (panel D), tykktarm (panel E), og bukspyttkjertel (panel F). Original forstørrelse × 400.
Membran, cytoplasma, og kjernefysisk Ep-ICD uttrykk i prostatakreft (A) og tykktarmskreft (B). Noen områder av vev avsnittet viser dominerende membran og svak cytoplasma men ingen kjernefysiske lokalisering av Ep-ICD (A, B – venstre kvadrat), mens andre deler av samme vev avsnittet viser atom og cytoplasmatiske akkumulering av Ep-ICD med fravær av membran Ep-ICD uttrykk (A, B – rett firkantet). Original forstørrelse × 400.
De negative og positive kontroll photomicrographs vises. Ep-ICD negative kontroller for HNSCC (A), prostatakreft (B), tarmkreft (C), brystkreft (D), ESCC (E), og normal spiserør (F); paneler G og H er positive kontroller for Ep-ICD farging. Original forstørrelse × 400.
Scatter Plot analyse
spredningsplott i figur 5A og 5B viser fordelingen av kjernefysiske og cytoplasmatiske Ep-ICD farging score i alle de epiteliale krefttyper analysert . Nuclear Ep-ICD ble observert i 39 av de 57 HNSCC vev og i 18 av de 46 ESCC vev. Tretti syv av disse 39 HNSCC vev undersøkt og 17 av de 18 ESCC vev viste IHC poengsum ≥4. Cytoplasmatiske Ep-ICD-farging ble påvist i 42 av de 57 (74%) HNSCC vev undersøkt og 32 av de 46 (70%) ESCC vev. Brystkreft, prostatakreft, og positivt flekker HNSCCs og ESCCs alle utstilt bemerkelsesverdige økninger i både kjernekraft og cytoplasma Ep-ICD sammenlignet med normalt vev og prostata godartede hyperplastiske vev analysert. Lunge, tykktarm, lever, blære, eggstokkene, og kreft i bukspyttkjertelen typer hver demonstrerte fremtredende uttrykk for kjernekraft og cytoplasma Ep-ICD. De spredningsplott i figur 5C viser fordelingen av membran Ep-ICD score i alle de epiteliale krefttypene som ble analysert.
Spredningsplott som viser fordeling av totale farging score bestemmes av IHC av vevssnitt av kreft i bryst (n = 38), prostata (n = 49), lunge (n = 59), eggstokk (n = 10), tykktarm (n = 59), blære (n = 10), lever (n = 9), positivt-flekker HNSCCs (n = 39) og ESCCs (n = 19), og normalt bryst (n = 25), prostata (n = 9) og BPH (n = 21), normal esophageal (n = 20), og hode og hals (n = 20) vev. Den vertikale aksen angir det totale IHC stillingen som beskrevet i Metoder. Et cutoff av ≥4 ble anvendt for å bestemme positivitet. N, normal; Ca, kreft. A. Økt atom akkumulering av Ep-ICD ble observert i de fleste av de epiteliale kreftformer analysert. B. Økt cytoplasmisk akkumulering av Ep-ICD ble observert i nesten alle epiteliale kreftformer analysert. C. Membran lokalisering av Ep-ICD variert i de ulike kreft og normale typer vev undersøkt.
Immunhistokjemisk analyse av EPEX uttrykk i humane epiteliale kreft
I likhet IHC analyse av EPEX uttrykk i disse humane epiteliale kreftformer ble også utført ved anvendelse av MOC31, et spesifikt antistoff mot det ekstracellulære domene av EpCAM (EPEX) i alle ti epiteliale kreftformer (figur 6 og 7). Representative mikrofotografier i figur 6, panel viser jeg lavt nivå av membranen EPEX ekspresjon i normalt bryst (A) og prostata (B, Ia), BPH (B, lb), og normal spiserøret (C) og hode og hals (D) vev . De tilsvarende cancervev som viser økt nivå av EPEX i membranen er vist i figur 6, panel II (A-bryst, B-prostata, C- spiserøret, og D- hode og nakke). I motsetning til mange av de cancervev for hver krefttype viste fravær av membran EPEX; Representative mikrofotografier er vist i panel III (A-D). Figur 7, panel I viser intens membran EPEX i tykktarmskreft (A), lever (B), blære (C), lunge (D), eggstokk (E) og bukspyttkjertel (F) kreft. Figur 7 panel II (A-F) viser redusert eller fravær av membran EPEX i en undergruppe av hver av disse epiteliale kreftformer. De positive og negative kontroller er vist i Supplementary figur S1.
photomicrographs skildre MOC31 farget membran EPEX i epiteliale kreftformer. Panelet I viser lavt nivå av membranen EPEX ekspresjon i normalt bryst (A) og prostata (B, Ia), BPH (B, lb), og normal spiserøret (C) og hode og hals (D) vev. De tilsvarende cancervev som viser økt nivå av EPEX i membranen er vist i panel II (A-D). I motsetning til mange av de cancervev for hver krefttype viste fravær av membran EPEX (felt III, A-D). Original forstørrelse × 400.
Membran EPEX uttrykk ble observert i alle epiteliale kreftformer. Panel I viser intens membran EPEX i tykktarmskreft (A), lever (B), blære (C), lunge (D), eggstokk (E) og bukspyttkjertel (F) kreft. Panelene II A-F viser redusert eller i fravær av membranen EPEX i en undergruppe av hver av disse epiteliale kreftformer. Original forstørrelse × 400.
Analyse av Ep-ICD og EPEX immunfluorescens i CX-en tykktarmskreft cellelinje
I CX-en, en aggressiv tykktarmskreft cellelinje, EPEX og Ep-ICD ble begge funnet i plasmamembranen (figur 8). Intens membran ekspresjon ble observert ved celle-celle kryss med både EPEX og Ep-ICD domenespesifikke antistoffer (figur 8 – A, D, F og G). I tillegg ble akkumulering av Ep-ICD observert i cytoplasma og kjerner av kreftcellene, men ikke EPEX akkumulering ble funnet i kjernen (Figur 8 – C, E, G). Den kvantitative fluorescens signal skanning av EPEX og Ep-ICD støtter klart disse observasjonene (figur 8E).
Sekundære antistoffer er FITC-anti-mus (grønn) og TRITC-anti-kanin (rød). A) EPEX; B) Ep-ICD; C) DAPI; D) EPEX og DAPI (A E) Ep-ICD og DAPI (B C fusjonert); F) EPEX og Ep-ICD (A B fusjonert); G) EPEX, Ep-ICD, og DAPI (A, B, C slått sammen); I) Måling av tettheten av tre farger over hele linjen i cellene i H.
ROC Curve Analyse
ROC-kurver ble generert for kjernekraft og cytoplasma Ep-ICD i HNSCC, ESCC, blir prostata og bryst kreft (figur 9), og deres resultater sammenfattet i tabell 2. Basert på denne analyse, ble en cutoff av ≥4 brukes til å bestemme atom og cytoplasmisk positivitet. Analyse viste at atom Ep-ICD opphopning skilles prostata kreft og brystkreft fra normale vev med 82% sensitivitet og med en spesifisitet på 100% for bryst og 78% for prostata. I HNSCCs, kjernekraft Ep-ICD var i stand til å skille kreft fra normale vev med 65% sensitivitet og 95% spesifisitet, mens i ESCCs, kjernekraft Ep-ICD viste 37% sensitivitet og 90% spesifisitet. AUC-verdiene viste seg å være 0,905 for brystkreft, 0,867 for prostatakreft, 0,822 for HNSCC, og 0,630 for ESCC. Cytoplasmatiske Ep-ICD-ekspresjon i bryst og prostata kreft hadde en sensitivitet på 82% og 84% henholdsvis, med en spesifisitet på 100% for bryst og 89% for prostata. I HNSCC, cytoplasmatisk Ep-ICD ekspresjon hadde en sensitivitet på 74% og en spesifisitet på 95%, mens cytoplasmatisk Ep-ICD hadde sensitivitet og spesifisitet på 70% i hvert ESCCs. AUC-verdier for cytoplasma Ep-ICD var 0,928 i brystkreft, 0.880 i prostatakreft, 0,864 i HNSCC, og 0,758 i ESCC.
ROC-kurver som beskriver forholdet mellom følsomhet og 1-spesifisitet av kjernekraft og cytoplasma Ep -ICD uttrykk i disse epiteliale kreftformer. Den vertikale aksen til hver kurve angir følsomhet og den horisontale akse angir 1-spesifisitet. Følsomhet, spesifisitet og AUC-verdier for kreft er oppsummert i tabell 2.
Diskusjoner
Den aktuelle studien fremhever den hyppige forekomsten av kjernekraft og cytoplasma opphopning av Ep -ICD i ti epiteliale krefttyper. Den normale epitel i bryst, prostata og spiserøret vev analysert viste distinkt membran Ep-ICD lokalisering. Viktigere, redusert eller manglende membran Ep-ICD ble observert i kreft i bryst, prostata, hode og nakke og spiserøret, parallelt med markert Ep-ICD opphopning i kjernen og cytoplasma av de respektive tumorceller. Imidlertid er en undergruppe av tumorer i hver av disse ti krefttyper viste høy Ep-ICD membran uttrykk som korrelert med høy EPEX ekspresjon på membranen detektert ved hjelp av en Ep-CAM eksternt domene (EPEX) spesifikt antistoff (MOC31), noe som antyder økt ekspresjon av full-lengde proteinet som påvist ved Ep-ICD og EPEX spesifikke antistoffer. Spesielt, immunohistokjemisk analyse av epitelial kreft ved hjelp av MOC31 viste økt ekspresjon EPEX membranen sammenlignet med de normale vev i noen tumorer, mens de andre viste nedsatt eller manglende membran EPEX, støtter våre observasjoner med Ep-ICD domenespesifikke antistoffer. Det er verdt å påpeke at kreft som viser redusert eller manglende membran EPEX eller Ep-ICD hadde betydelig økt Ep-ICD i cytoplasma og kjerner av slike kreftceller. Spesielt, EPEX ble ikke påvist i noen av de kjerner av tumorceller i noen av kreft analysert. Til sammen favorisere disse observasjonene økt uttrykk og økt Shedding av EPEX av tumorceller i et delsett av alle epiteltumorer studert.
