Abstract
Pasienter med kreft i bukspyttkjertelen vanligvis utvikle svulst invasjon og metastasering i tidlig stadium. Disse ondartede atferd kan være stammer fra kreft stamceller (cscs), men den ansvarlige målet er mindre kjent om usynlige cscs spesielt for invasjon og metastasering. Vi har tidligere undersøkt proteasome aktivitet cscs og konstruert en sanntids visualisering system for menneskelige bukspyttkjertelen cscs. I denne studien fant vi at cscs var svært metastatisk og dominant lokalisert på invaderende tumoravgrensninger i en levermetastaser modell. Microarray og siRNA utvelgelsesassays viste at doublecortin-lignende kinase 1 (DCLK1) ble hovedsakelig uttrykt med histone modifikasjon i bukspyttkjertelen cscs med invasiv og metastatisk potensial. Overekspresjon av DCLK1 førte til amoeboid morfologi, som fremmer migrasjon av kreft i bukspyttkjertelen celler. Knockdown av DCLK1 dypt trykkes in vivo levermetastaser fra bukspyttkjertelen cscs. Klinisk DCLK1 ble overuttrykt i metastatiske svulster hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen. Våre studier viser at DCLK1 er avgjørende for invasive og metastatiske egenskaper cscs og kan være en lovende epigenetisk og terapeutisk mål i menneskelig kreft i bukspyttkjertelen
Citation. Ito H, Tanaka S, Akiyama Y, Shimada S, Adikrisna R, S Matsumura et al. (2016) Dominant Expression of DCLK1 i Human kreft i bukspyttkjertelen stamceller Akselererer Tumor invasjon og metastasering. PLoS ONE 11 (1): e0146564. doi: 10,1371 /journal.pone.0146564
Redaktør: Zhiqian Zhang, Peking University Cancer Hospital Institute, KINA
mottatt: 17 august 2015; Godkjent: 18 desember 2015; Publisert: 14 januar 2016
Copyright: © 2016 Ito et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av prosjektet for utvikling av innovative kreftforsking Therapeutics (P-Direct), en Grant-in-Aid for Scientific Research på innovative områder, Scientific Research (A), Utfordrende Utforskende forskning fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap Teknologi fra Japan, og en Health Arbeids Sciences Research Grant fra Helsedepartementet Arbeids- Velferd Japan. Nummer: 22130005, 25253081, 15H01484, 15K15491. URL:. Https://kaken.nii.ac.jp/d/r/30253420.ja.html
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Forkortelser : CSC, kreft stamcelle; ODC, ornitindekarboksylase; Gdeg, ZsGreen-merket degron ODC; H3K4me3, histon H3 lysin 4 tri-metylering; H3K9me3, histon H3 lysin 9 tri-metylering; H3K27me3, histon H3 lysin 27 tri-metylering; FACS, fluorescens-aktivert cellesortering; RT-PCR, revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon; QRT-PCR, kvantitativ RT-PCR; GAPDH, er glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase
Innledning
Bukspyttkjertelkreft den mest dødelige vanligste kreftformen fordi det er vanligvis diagnostisert på et avansert stadium og er motstandsdyktig mot terapi [1]. Den totale overlevelse 5 år etter diagnose er ca 5-6%, som er den laveste frekvensen av noen kreft [2]. Til tross for nylig utviklet kirurgiske teknikker og anti-kreft narkotika, har behandlingseffekt for kreft i bukspyttkjertelen ikke vesentlig forbedret i løpet av de siste ti årene på grunn av tendensen til tidlig invasjon og metastasering [3]. Disse svært maligne egenskaper er på grunn av den selvfornyelse og differensiering av en liten subpopulasjon av kreftceller med stem-lignende egenskaper, såkalt kreft stamceller (cscs) [4, 5], som også er referert til som metastatiske stamceller [6, 7]. Nyere studier viser at den stamcelle skjebne bestemmes av epigenetiske mekanismer, inkludert histon modifisering i enten normale celler [8] eller cscs [9]. Enda viktigere, er identifisering av molekylære mål av cscs forventes å akselerere utviklingen av nye målrettede terapier [10]. Selv om flere celleoverflatemarkører har blitt identifisert som karakteristisk for bukspyttkjertel cscs [5, 11], terapeutiske mål av invasiv og metastatisk prosess er fortsatt uklart i bukspyttkjertelkreft [12, 13]. Vurderer terapeutiske strategier for å målrette cscs er vanskelig på grunn av kompleksiteten i å rekonstruere blandede bestander med differensiert avkom på en hierarkisk måte [14, 15]. Et overvåkingssystem basert på CSC-spesifikke funksjoner kan være en løsning på disse vanskelighetene, og vi utnyttet lav proteasomet aktivitet av cscs for å skape et slikt system. Humane bryst og gliom kreftceller ble konstruert til å stabilt uttrykke grønn fluorescens fusjonert til degron av ornitindekarboksylase (Gdeg), noe som resulterte i intracellulær akkumulering av grønt fluorescerende protein Gdeg som en konsekvens av den lave aktiviteten til 26S-proteosomet [16, 17] . Ved å bruke denne egenskapen, vi tidligere bygget et sanntids visualisering system for humane lever cscs og demonstrerte sin høye metastatisk evne med nisje formasjon [18]. Våre visualiseringssystemet ble også brukt til å klargjøre de svært ondartet karakteristikk av menneskelige bukspyttkjertelen cscs [19]. I denne studien identifiserte vi doublecortin-lignende kinase 1 (DCLK1) som et protein som er overveiende uttrykt i invasive og metastatisk cscs. Genet ble assosiert med epigenetikk endringer inkludert H3K4me3 og H3K27me3 histone modifisering. DCLK1 ble tidligere rapportert å være en kandidat normal stamcelle markør i tarmen [20, 21]. Men Nakanishi
et al
. brukte avstamning-tracing eksperimenter og viste at DCLK1 markerer kreft stamceller som kontinuerlig produserer svulst avkom [22]. I tillegg Westphalen
et al
. brukte samme strategi og rapporterte forholdet mellom langlivede DCLK1-positive celler og oppstart av tykktarmskreft [23]. Ifølge den siste rapporten fra Bailey
et al
., Bukspyttkjertelen svulster hos mus som uttrykker DCLK1 inneholde morfologisk og funksjonelt forskjellige subpopulasjoner med CSC-lignende egenskaper [24]. Bruke ovenfor visualiseringssystemet og metastatisk bukspyttkjertel kreft, våre studier viste at DCLK1 er sterkt uttrykt i humane bukspyttkjertelen cscs og i kliniske prøver, og kan representere et terapeutisk mål.
Materialer og metoder
Retroviral transduksjon av degron reporter inn i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler
degron sekvens av ornitindekarboksylase (ODC) blir ført direkte ved proteasomer, noe som fører til umiddelbar ødeleggelse av de involverte protein [16]. Den retrovirusekspresjonsvektor pQCXIN-ZsGreen-COdc, inneholder grønn fluorescens ZsGreen-merket degron ODC (Gdeg), ble vennlig levert av Dr. Frank Pajonk (UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center, CA, USA). Vektoren ble transfektert inn i platina retrovirale pakkefremmende celler [25], og den retrovirus oppsamlet fra supernatanten ble brukt til å infisere kreft i bukspyttkjertelen celler. Stabile transfektanter ble selektert med G418 (Geneticin; Promega Madison, WI, USA), og akkumulering av ZsGreen-degronODC protein (Gdeg) ble overvåket ved fluorescensmikroskopi og flowcytometri (FITC kanal). For å bekrefte stabil transfeksjon, ble cellene eksponert for proteasominhibitor MG-132 (Calbiochem, San Diego, CA, USA) i 12 timer. Fluorescens mikroskopi ble utført ved hjelp AxioObserver (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland), og bildene ble anskaffet digitalt ved hjelp AxioVision programvare (Carl Zeiss).
In vitro-celle migrasjon og invasjon analyser
Den doble -chamber migrering assay ble utført ved hjelp av en transwell skammer [26] (24-brønns plate, 8-um porer, BD Biosciences, Canaan, CT, USA). For invasjonen analysen, ble Matrigel-belagt (BD Biosciences) transwells (0,1 mg /ml) fremstilt ved inkubering i serumfritt medium i 2 timer ved 37 ° C i en 24-brønns plate. Det nedre kammer ble fylt med 0,8 ml kulturmedium uten antibiotika. Deretter DCLK1 høy uttrykk, vill-type, Gdeg
høy, og Gdeg
High-siDCLK1 tumorceller (8 × 10
4 i 0,3 ml serumfritt medium) ble sådd i den øvre kammer og inkubert ved 37 ° C i 24 timer. Tumorcellene på den øvre overflaten av filteret fjernet ved hjelp av en bomullsdott. Cellene ble så fiksert med 100% metanol og farget med Giemsa-løsning, og antallet celler som migrerer inn i eller invaderer den nedre overflate ble tellet i tre tilfeldig valgte høy forstørrelse felt (100 x) for hver prøve. Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer.
Microarray analyse
For genekspresjonsanalyser, 2 × 10
5 fersk sortert Gdeg
høye og Gdeg
lave KLM1 cellene anvendes. Total RNA ble ekstrahert fra hver celletype med QIAZOL, en RNeasy Micro Kit, og QIAshredder spin kolonner (Qiagen, Hilden, Tyskland). Integriteten til RNA ble oppnådd ble vurdert med en Nanodrop ND-100 spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA), en 2100Bioanalyzer, og en RNA6000Pico Kit (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). I henhold til GeneChip®3’IVT Express Kit, P /N702646 Rev.7 protokollen (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA), ble komplementært DNA fremstilt fra 100 ng total-RNA ved hjelp av en syklus mål merking og en styre reagenssett (Affymetrix). Hybridisering og signal deteksjon av HG-U133 Plus 2,0 arrays (Affymetrix) ble utført. Microarray datasett av Gdeg
høye og Gdeg
lave celler ble normalisert og merket med Expression Console ™ programvare (Affymetrix). Antatt genuttrykk nivåer ble oppnådd som log2-transformerte verdier. Gener ble ekskludert fra analysen om påvisning samtalen var «marginal» eller «fraværende» i begge Gdeg
høye og Gdeg
lave celler.
taushet overekspresjon av
DCLK1
Små interfering RNA (siRNA) rettet mot kandidatgener og egge sirnas (siScr) ikke sams noen menneskelige gener ble kjøpt fra Invitrogen. Ferskt sortert Gdeg
høy-celler (både KLM1 og BxPC3) ble sådd ut ved en tetthet på 2,0 x 10
5 celler per brønn i 6-brønners plater i 2 ml dyrkningsmedium. Deretter transfeksjon med siRNA ble utført ved hjelp RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner [27]. Etter transfeksjon med forskjellige konsentrasjoner (10 nM, 20 nM) ble cellene inkubert i 48 timer ved 37 ° C i en 5% CO
2 atmosfære. Antallet levedyktige og ikke-levedyktige celler ble tellet ved hjelp av en automatisk celletellemaskin ved hjelp av trypanblått-eksklusjon fargestoff (CYTORECON, Hirata, Tokyo, Japan). Ved 48-timers tidspunktet etter siRNA transfeksjon, ble cellene løsnet fra hver plate som skal brukes for videre eksperimenter. SiRNA målsekvenser var de fra genom-wide RNAi skjermer høyt innhold [28]. Å konstruere shRNA uttrykk vektor (pSilencer
TM 2.1-U6 puro, Invitrogen) [29], KLM1-Gdeg celler (2,0 × 10
5) ble transfektert med 2,5 ug plasmid med Lipofectamine2000 (Invitrogen). Mediet ble byttet hver 2. dag, og stabile transfektanter ble isolert ved inkubering i medium inneholdende 400 ug /ml puromycin. Å skape forbigående kreftceller som overuttrykker DCLK1, vi brukte pCMV6-AC-GFP (RG217050 TrueORF
TM cDNA kloner og PrecisionShuttle
TM Vector System, OriGene Technologies, Rockville, MD, USA). KLM1 celler ble transfektert bruker Lipofectamine2000 henhold til produsentens protokoll. Etter inkubasjon ved 37 ° C i 48 timer, ble GFP-positive celler sortert for videre forsøk.
In vivo studier av tumorigenicity og metastase
Kvinne NOD.CB17-PRkdcScid /J-mus, i alderen 5-6 uker, ble kjøpt fra Charles River Laboratory (Kanagawa, Japan). Kirurgi ble utført under bedøvelse levert av isofluran nese-cone innånding. Ulike mengder sortert celler (1 x 10
2 til 1 × 10
5 Gdeg
høy KLM1 og Gdeg
lav-KLM1, 1 × 10
2-1 × 10
4 Gdeg
høy BxPC3 og Gdeg
lav-BxPC3) ble blandet med matrigel, og 100 ul ble injisert subkutant i begge flankene av mus. Svulstdannelse deretter ble overvåket hver 4. dag i inntil 10 uker. Tumorvolumet ble beregnet ved hjelp av følgende ligning: volum = (lengde) x (bredde)
2/2. Hver gruppe besto av 4-6 mus. For levermetastaser analyse, abdominal hud og muskel, omtrent 5 mm i lengde, ble radert like ved midtlinjen. Milten ble exteriorized gjennom snittet ved å bruke forsiktig trekkraft, og de sorterte celler (Gdeg
høy KLM1, Gdeg
lav-KLM1 og Gdeg
høy KLM1-shDCLK1, Gdeg
high-BxPC3 og Gdeg
lav-BxPC3; n = 6), suspenderes i 1 x 10
6 celler pr 100 ul PBS ble injisert like under kapsel av den nedre pol ved hjelp av en tuberkulinsprøyte med en 30 gauge nål . Hemostase ble oppnådd ved å påføre forsiktig trykk (med en bomullspinne) på injeksjonsstedet. Milten ble deretter returnert til bukhulen, og magen ble lukket ved hjelp av to 6-0 silkesuturer gjennom både hud og muskler samtidig [30, 31]. Vi har observert disse musene i 8 uker, og deretter undersøkt om metastasering hadde forekommet [32]. Alle in vivo prosedyrer i denne studien ble godkjent av Animal Care Committee of Tokyo Medical and Dental University (tillatelse No.0150044A).
Pasienter og prøver
Vi har registrert pasienter som gjennomgikk primær og metastatisk (lever og lunge) tumorreseksjon for bukspyttkjertel ductal adenokarsinom på Tokyo Medical and Dental universitetssykehus mellom 2005 og 2013. parede prøver ble brukt til immunhistokjemisk analyse. Resected vev ble fiksert i 10% formaldehyd løsning og i parafin for histopatologiske analyse i henhold til de generelle reglene for klinisk og patologisk studie av primær kreft i bukspyttkjertelen. Denne studien ble godkjent av etisk komité av Tokyo Medical and Dental University (Permission No.1080) og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter.
Statistisk analyse
Alle verdier er presentert som gjennomsnitts ± SD mindre annet er angitt. De to-halet t-test (for sammenligning mellom grupper), eller en-veis analyse av varians (for sammenligning av tre eller flere grupper) etterfulgt av Dunnetts
post-hoc
tester ble brukt for statistiske analyser. SPSS programvareversjon 21,0 (SPSS, Chicago, IL) ble brukt. Statistisk signifikans ble definert som p. 0,05
Resultater
visualisert bukspyttkjertelen cscs er særlig i stand til levermetastaser
Stabil transfeksjon av Gdeg reporter i to human bukspyttkjertelkreft celle linjer med ulike onkogene potensialer av metastaser; KLM1 som høy-evne celler med mutert KRAS, og BxPC3 som lav-evne celler med villtype KRAS [33-35]. Cscs merket med reporter viste en Gdeg
høy befolkning som utgjorde ca 1,0% av det totale celle nummer (S1 fig). I analysen for sfære formasjon [36], antall kuler (mer enn 50 pm i diameter) avledet fra Gdeg
høye celler var signifikant høyere enn den til Gdeg
lave celler (p 0.01, fig 1A og 1B). Økt tumorgenisitet in vivo har også blitt brukt som en del av avgjørende bevis for eksistensen av cscs [4]. Dermed vil en sortert befolkning på Gdeg
høye eller Gdeg
lave celler ble injisert subkutant i NOD /SCID-mus. For Gdeg
høye celler avledet fra både KLM1 og BxPC3 cellelinjer, bekreftet vi den svært ondartet potensial (S2 fig). I både KLM1 og BxPC3 cellelinjer, Gdeg
høy-celler hadde en signifikant høyere evne til å migrere og invadere enn Gdeg
lave celler i en dobbeltkammer-analyse (p 0,01, figur 1C og 1D). For å undersøke om Gdeg cellene megle metastaser in vivo, Gdeg
høye eller Gdeg
lave celler ble injisert i milten av NOD /SCID mus (n = 6). Etter 8 uker, vi visuelt bekreftet tilstedeværelsen av tumorer i milten og telles antallet levermetastaser. Vi fant betydelig mer levermetastatiske svulster i Gdeg
høy gruppen enn i Gdeg
lav (p 0,05; Gdeg
high-KLM1 celler, 5.3 ± 3.4 svulster versus Gdeg
lav- KLM1 celler, 0 ± 0 svulster, p 0,01; Gdeg
High-BxPC3 celler, 13,6 ± 5,1 svulster versus Gdeg
lavt BxPC3 celler, 2,2 ± 2,8 svulster) (figur 2A og 2B, 2F og 2G ). Vi har også observert noen mikrometastaser i leveren av Gdeg
høye grupper (Fig 2C og 2H), men vi oppmerksom på at ingen metastatiske svulster ble sett i mus injisert med Gdeg
lav KLM1 celler. Immunofluorescent analyse klart frem Gdeg
høye celler som ble lokalisert til randen av svulsten (Fig 2D og 2i). Andelen av Gdeg
høye celler i tumor margin området (MA; 200 um) var mye høyere enn det som i tumoren sentrale området (CA) (Gdeg
høyt KLM1 tumor; 26,1 ± 4,2% i forhold til 4,1 ± 2,5%, Gdeg
høy BxPC3 svulst, 21,0 ± 1,9% versus 4,1 ± 0,2%, p 0,01) (figur 2E og 2J). Som i en tidligere studie [11], våre resultater antydet at cscs tendens til å invadere videre utenfor svulsten.
(A) Representative mikroskopiske bilder av kuler vises. Gdeg
høy KLM1 og Gdeg
høy BxPC3 celler dannes komplette kuler, men Gdeg
lav-KLM1 og Gdeg
lavt BxPC3 celler ikke. Scale bar, 50 mikrometer. (B) Et antall sfærer ( 50 mikrometer i diameter) sett i hver brønn (n = 6). Dataene er gjennomsnitt ± SD. ** P 0,01 sammenlignet med Gdeg
høy. De to-sidig t-test ble brukt til å sammenligne to uavhengige grupper. (C og D) Cell migrasjon og invasjon ble analysert med en dobbel-kammer analysen bruker Gdeg
høy KLM1, Gdeg
lav KLM1, Gdeg
høy BxPC3, og Gdeg
lav-BxPC3 celler. Representative mikroskopiske bilder vises. Kvantifisering av migrering og invasjon er presentert som gjennomsnitt ± SD for tre uavhengige eksperimenter. ** P. 0,01 sammenlignet med Gdeg
høye celler
(A og F) Representant levermetastatiske svulster er vist i mus 8 uker etter injeksjon. (B og G) Histogram viser gjennomsnittlig antall tumorer i leveren (n = 6, middelverdi ± SD). For begge cellelinjer, fant vi en signifikant forskjell mellom de Gdeg
høy og Gdeg
lave celler. * P 0,05 i (B) og ** p 0,01 i (G). (C og H) Mikroskopiske bilder av lever som ble resected, seksjonert og farget med H E vises. Noen mikro svulster var tilstede i leveren. Scale bar, 1000 mikrometer. (D og I) Fluorescent mikroskopiske bilder av hoved svulsten er vist. For begge cellelinjer, Gdeg
høye celler ble lokalisert fortrinnsvis på de invaderende tumoravgrensninger. Scale bar, 200 mikrometer. Forstørrede bilder av eske regionene er vist. Scale bar, 20 mikrometer. (E og J) Grafen viser at andelen av Gdeg
høye celler var signifikant høyere i den marginale område (MA) enn i det sentrale området (CA; middelverdi ± SD). ** P 0,01. Vi telte tre ulike områder for hver region.
Overuttrykte DCLK1 i forbindelse med histone modifikasjon er ansvarlig for invasiv potensialet i bukspyttkjertelen cscs
For å klargjøre invasive og metastatiske markører for bukspyttkjertel cscs, sammenlignet vi genuttrykksmønster mellom Gdeg
høye celler og Gdeg
lave celler ved microarray hybridisering (S1 data). Scatterplot analyse av 25,572 sonder som påvisning samtalen var «til stede» viste at 483 gener ble oppregulert og 1,138 gener ble nedregulert med mer enn to ganger i Gdeg
high-KLM1 celler sammenlignet med Gdeg
lav-KLM1 celler. Basert på fold endring rangering i Gdeg
høye celler (tabell 1), ble siRNA screening for kandidatgener vurderes etter de hemmende effekt på Gdeg
høy celle migrasjon og invasjon ved hjelp av dobbel-kammer analysen. Følgelig er bare den siRNA mot DCLK1 betydelig redusert cellulær migrering og invasjon sammenlignet med kontroller i både KLM1 og BxPC3 Gdeg
høy-celler (p 0,01, figur 3A og 3B). DCLK1 ble identifisert som et mål molekyl som er overuttrykt i Gdeg
høye celler med migrasjon og invasiv evne i forhold til Gdeg
lave celler. QRT-PCR og Western blotting analyser viste at DCLK1 mRNA og protein ble overexpressed i Gdeg
høye celler, men ikke i Gdeg
lave celler (S3 fig). Immunocytokjemisk analyse viste DCLK1 protein ble hovedsakelig lokalisert i cytoplasma (fig 4A og 4B), og redusert ekspresjon av DCLK1 ble bekreftet ved anvendelse av siRNA (S3 Fig, Fig 4C og 4D). Deretter undersøkte vi epigenetiske aspekter av
DCLK1
uttrykk ved å gjennomføre kromatin immunoprecipitation (chip) analyse av tre sentrale histone metylering markører, H3K4me3, H3k9me3, og H3K27me3, i begge Gdeg cellelinjer. Som vist i figur 4E, Gdeg
høy-celler uttrykte høye nivåer av H3K4me3, som er forbundet med aktive promotorer, enn H3K27me3, som er forbundet med taushet promotorer. Gdeg
lave celler var nesten bivalent. Disse resultatene antyder at
DCLK1
uttrykk i Gdeg cellelinjer ble regulert av histon modifikasjon av H3K4 og H3K27. Vi fant ingen forskjell i H3K9me3 nivåer mellom Gdeg
høy og Gdeg
lav i disse cellelinjene.
(A) Dobbelt kammer analysen av migrasjon og invasjon for både Gdeg
høy cellelinjer etter behandling. Representative mikroskopiske bilder vises. (B) Antall trekkende og invadere celler sammenlignet med kontrollgruppen var påfallende undertrykt i begge Gdeg
høyt siDCLK1 cellelinjer. #not signifikant, ** p. 0,01, ved enveis variansanalyse fulgt av Dunnetfs multiple sammenligningstester
(A og B) immuncytokjemisk analyse av DCLK1 i begge cellelinjene (opprinnelig forstørrelse x 200) er vist. Gdeg
høye cellene uttrykte DCLK1 protein, som ble lokalisert i cytoplasma, men Gdeg
lave celler viste bare svak uttrykk. Scale bar, 10 mikrometer. (C og D) immuncytokjemisk analyse av celler behandlet med
DCLK1
-spesifikk siRNA er vist (opprinnelig forstørrelse x 200). DCLK1 protein uttrykk ble redusert i Gdeg
høye celler etter transfeksjon med siDCLK1. Scale bar, 20 mikrometer. vises (E) ChIP analyse. Begge Gdeg
høye cellelinjer ble sterkt anriket for H3K4me3 forhold til H3K27me3 på
DCLK1
promoter-regionen. Histone H3 og IgG ble brukt som positive og negative kontroller for ChIP analyse, henholdsvis.
DCLK1 fremmer morfologiske endringer, migrasjon og invasjon i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler
Å undersøke hvilken rolle DCLK1 i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler, vedtok vi en gevinst-of-funksjon strategi ved hjelp av KLM1 celler som forbigående over-uttrykt GFP-merket DCLK1. Som tidligere rapportert for neuronale cellelinjer, immunofluorescensanalyse av KLM1-DCLK1-GFP vist overlappende mønster av DCLK1 ekspresjon med mikrotubuli ved hjelp av en α-tubulin-antistoff [37] (figur 5A). Funksjonen DCLK1 i menneskelige kreft i bukspyttkjertelen celler kan således være å kontrollere handlingen av mikrotubuli. Bevegelse og morfologiske endringer, inkludert strekker pseudopodia ble klart observert i tids-lapse mikroskopiske bilder (fig 5b). I løpet av en 15-timers observasjonsperiode, migrasjon avstand på KLM1-DCLK1-GFP celler var lengre enn for villtype KLM1 celler (p 0,01, figur 5C). I den dobbeltkammer analysen, antallet migrering og invasjon KLM1-DCLK1-GFP-celler var høyere enn for villtype KLM1 celler (p 0,01, figur 5D). Videre KLM1-DCLK1-GFP celler trans-plassert via hurtig vekslende sykluser av morfologiske ekspansjon og sammentrekning kalles amoeboid migrasjon (S1 Video) [38].
(A) immunocytokjemisk analyse viste at DCLK1 var overveiende co- lokalisert med α-tubulin i KLM1-DCLK1-GFP celler. Scale bar, 20 mikrometer. Forstørrede bilder av eske regionene er vist i andre rad. Scale bar, 10 mikrometer. (B) Fire KLM1-DCLK1-GFP celler ble observert med time-lapse fotografering i 15 timer. De vedtok en amoeboid morfologi som de flyttet. Scale bar, 20 mikrometer. En forstørret bilde av eske regionene er vist i hjørnet. Hvite piler mark strekker pseudopodia. Scale bar, 10 mikrometer. Sine spor (vist som røde stiplede linjer) ble målt. (C) Histogram viser gjennomsnittlig avstand på migrasjon for villtype KLM1 celler (kontrollceller) og KLM1-DCLK1-GFP celler (n = 4 hver, gjennomsnitt ± SD). KLM1-DCLK1-GFP celler migrert betydelig lengre enn kontrollceller. ** P 0,01. (D) Antallet migrering og invasjon KLM1-DCLK1-GFP-celler var også høyere enn for kontrollceller. ** P. 0,01
DCLK1 knockdown fører til en reduksjon i metastatisk evne bukspyttkjertelen cscs
For å bekrefte in vivo tap-av-funksjon analyse, stabil knockdown av DCLK1 ble vurdert i Gdeg-KLM1 celler ved hjelp av
DCLK1
shRNA. Kvaliteten på transfeksjon ble bekreftet ved QRT-PCR, western blotting og immunocytokjemiske analyser (fig 6A-6C). Befolkningen i shDCLK1-Gdeg
høy KLM1 cellene var mindre enn 0,5% av det totale celle nummer (S1 fig). Vi injisert fersk sortert shDCLK1-Gdeg
høy KLM1 celler i milten av NOD /SCID mus (n = 6). Betydelige levermetastaser ble oppdaget etter injeksjon av kontroll Gdeg
høye celler, men interessant, ingen metastatiske lesjoner ble identifisert etter injeksjon av shDCLK1-Gdeg
høye celler, som bestemmes av makroskopisk og mikroskopisk undersøkelse (Fig 6D). Disse resultatene antydet at DCLK1 spiller en avgjørende rolle i levermetastaser i menneskelig kreft i bukspyttkjertelen.
(A og B)
DCLK1
-spesifikk shRNA (shDCLK1) betydelig redusert DCLK1 mRNA og protein uttrykk i Gdeg
høyt KLM1 celler. ** P 0,01. (C) En markert nedgang i DCLK1 immunoreaktivitets ble observert etter transfeksjon med shDCLK1 forhold til Gdeg
høy (kontroll). Scale bar, 20 mikrometer. (D) Noen svulster langs kanten av leveren var synlig i Gdeg
høy KLM1 gruppe, men ingen tumorer ble sett i shDCLK1-Gdeg
høy gruppe. Det gjennomsnittlige antall tumorer i leveren (n = 6 mus) er vist (middel ± SD). Vi har observert en signifikant forskjell mellom kontrollgruppen og den shDCLK1 gruppen. * P. 0,05
Dominant uttrykk for DCLK1 i metastatiske svulster er klinisk anerkjent hos pasienter med kreft i bukspyttkjertelen
Blant 135 bukspyttkjertelkreft pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon 2005-2013 i vårt sykehus, seks metastatiske svulster ble resected synkront eller metachronously. Disse seks par primære og metastatiske svulster ble evaluert for uttrykket av DCLK1. Primære og metastatiske svulster ble resected synkront i tre tilfeller, og primærsvulster og metachronous fjernmetastaser ble separat resected i de tre andre tilfellene (tabell 2). Interessant, kreftceller som ble positivt farget for DCLK1 protein ble sjelden påvises i primærsvulster, men var tydelig påvist i metastatiske svulster (Fig 7A-7F), og i alle tilfeller, farging stillingen var høyere i metastatiske svulster enn i primære svulster (fig 7G). I tilfeller 5 og 6 i særdeleshet, ble de primære svulster fullstendig reseksjon og ingen lokale tilbakefall inntraff. Men selv om disse pasientene ble behandlet med adjuvant kjemoterapi, dukket fjernmetastaser. I disse to tilfellene, DCLK1 ekspresjon var mye høyere i de metastatiske tumor enn i den primære tumor. Disse resultatene tyder på at metastatiske svulster er motstandsdyktig mot konvensjonell kjemoterapi og at DCLK1 er en markør for metastatiske svulster.
(A, C og E) I primære lesjoner, noen kreftceller var positive for DCLK1 og farging intensiteten var svak (venstre; 100 ×, høyre, 400 ×). (B, D og F) I metastatiske lesjoner (lever eller lunge), antall DCLK1-uttrykker cellene var høyere enn i primærsvulster, og fargeintensitet var sterkere (venstre; 100 ×, høyre, 400 ×). (G) Sammenligning av farging score mellom primære lesjoner og metastatiske lesjoner. I alle seks kliniske prøver, DCLK1 ble mer høyt uttrykt i metastatisk lesjon enn i primær lesjon.
Diskusjoner
DCLK1 består av en N-terminal som er 65 % lik doublecortin (DCX) gjennom hele lengden av DCX, men DCLK1 inneholder også ytterligere 360 aminosyrer i den C-terminale domene, og skaper en antatt Ca
2 + /kalmodulin-avhengig proteinkinase.
DCLK1
ligger på regionen av kromosom 13q13.3 [37].
DCX
genet, som ligger på kromosom region Xq23, er en microtubule-assosiert protein nødvendig for migrering av nevrale stamceller til hjernebarken.
Mutasjoner i DCX føre til kortikale lamine defekter i utviklingen av hjernen som kalles subcortikal bandet heterotopi hos kvinner og klassiske lissencephalies hos menn [39]. En tidligere studie på mus hvor DCLK1 og /eller DCX ble slått ut avdekket at begge proteiner har genetisk kompenserende roller i neuronal migrasjon; det vil si at
DCLK1
genet funksjoner i en delvis overflødig sti med DCX i dannelsen av aksonal anslag over midtlinjen og migrasjon av kortikale nevroner [40]. Vi fant at overuttrykt DCLK1 fremmer migrasjon og invasjon i cellelinjer, og knockdown undertrykker disse evnene. Vi har nøye vurdert hvordan våre resultater om DCLK1 passer med tidligere resultater om en neuronal rolle for DCLK1. Noen bevis finnes for potensialet involvering av axon veiledning gener i bukspyttkjertelen kreftutvikling [41], og disse resultatene er i samsvar med våre funn at sterkt uttrykt DCLK1 er nært knyttet til invasjon og metastasering i kreft i bukspyttkjertelen. Epigenetisk kontroll av genuttrykk spiller en stor rolle i celle skjebne besluttsomhet. Spesielt er høyere ordens kromatinstruktur fremstår som en viktig regulator av stamcelledifferensiering [8], inklusive pankreatisk utvikling [42]. I løpet av induksjon av pluripotency er passende kromatin remodellering som er nødvendig for ekspresjon av stamcelle-spesifikke gener. Videre har flere studier på hjernesvulster, leverkreft og brystkreft vist at histone modifikasjon er ansvarlig for den hierarkiske struktur som består av kreft stamceller på toppen [43-45]. Rheinbay
et al
. rapporterte tap av H3K27me3 aktiverer et signalveien som kreves for vedlikehold og tumorgenisiteten av glioblastom cscs [43]. Knockdown av H3K20 metyltransferase PR-SET7 i leveren forårsaket spontan utvikling av leverkreft med kreftstamcelleegenskaper [44]. Westcott
et al
. rapporterte en epigenetisk distinkt undergruppe av brystkreftceller med en forbedret evne til kollektivt invadere [45]. I denne studien ChIP analyse viste at
DCLK1
transkripsjon start stedet i begge Gdeg
høy cellelinjer ble sterkere markert med histone modifikasjon for genaktivering (H3K4me3) enn undertrykkelse (H3K27me3).
