Abstract
Bakgrunn
Kreft cachexia (CC) er knyttet til dårlig prognose. Selv om mekanismene som fremmer denne betingelsen ikke er kjent, har flere sirkulerende proteiner blitt foreslått å bidra. Vi analyserte plasma proteomet i kreft fag for å identifisere faktorer assosiert med kakeksi.
Design /Fag
Plasma ble hentet fra en screening kohort av 59 pasienter, nylig diagnostisert med mistenkt gastrointestinal kreft, med (n = 32) eller uten (n = 27) kakeksi. Prøvene ble utsatt for proteomikk profilering ved hjelp av 760 antistoffer (rettet mot 698 individuelle proteiner) fra Human Protein Atlas-prosjektet. Hovedfunnene ble validert i en kohort av 93 pasienter med bekreftet og avansert bukspyttkjertelen kreft.
Resultater
Bare seks proteiner som vises differensial plasmanivå i screening kohort. Blant disse, ble carnosin dipeptidase 1 (CNDP1) bekreftet ved sandwich-immunoanalyse for å være lavere i CC (p = 0,008). I begge kohorter, ble lave CNDP1 nivåer forbundet med markører for dårlig prognose, inkludert vekttap, underernæring, lipid sammenbrudd, lave sirkulerende albumin /IGF1 nivåer og dårlig livskvalitet. Elleve av de fagene i oppdagelsen kohorten ble endelig diagnostisert med ikke-ondartet sykdom, men å utelate disse fagene fra analysene ikke har noen stor innvirkning på resultatene.
Konklusjoner
I gastrointestinal kreft, reduserte plasmanivået av CNDP1 assosierer med tegn på katabolisme og dårlig resultat. Disse resultatene, sammen med nylig publiserte data viser lavere sirkulerende CNDP1 hos forsøkspersoner med glioblastom og metastatisk prostatakreft, tyder på at CNDP1 kan utgjøre en markør for aggressiv kreft og CC
Citation. Arner P, Henjes F, Schwenk JM , Darmanis S, Dahlman jeg, Iresjö BM, et al. (2015) Sirkulasjons Carnosine dipeptidase 1 Associates med vekttap og dårlig prognose i Gastrointestinal Cancer. PLoS ONE 10 (4): e0123566. doi: 10,1371 /journal.pone.0123566
Academic Redaktør: Juergen Eckel, GDC, TYSKLAND
mottatt: 04.12.2014; Godkjent: 19 februar 2015; Publisert: 21 april 2015
Copyright: © 2015 Arner et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra det svenske Heart and Lung Foundation, den svenske Diabetes Association, Novo Nordisk Foundation, den svenske Cancer Foundation, DiabetesWellness, den Swedish Medical Association, Vetenskapsrådet, Strategic Research Programme i Diabetes ved Karolinska Institutet, Knut og Alice Wallenberg-stiftelsen og SciLifeLab Stockholm. Ingen av finansieringskildene har deltatt i planlegging, gjennomføring, analyse av data eller skrive manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kakeksi er en tilstand av ufrivillig vekttap observert i kroniske lidelser som kreft, inflammatoriske sykdommer, hjertesvikt og end-stage renal sykdom [1]. Så mange som halvparten av alle kreftpasienter erfaring cancer cachexia (CC), som er sterkt assosiert med redusert overlevelse og dårlig respons på antitumorbehandling [2]. Redusert matinntak kan bidra til CC [3], men det betyr ikke utelukkende forklare sin utvikling, og ernæringsmessige kosttilskudd ikke klarer å reversere prosessen [4]. Til tross for en betydelig innsats, de underliggende årsaksmekanismer fortsatt uklare, og det er ingen effektiv behandling selv om flere palliative strategier har blitt foreslått [5,6,7,8].
Både fettmasse og muskelmasse er brukt i avansert CC [5,9]. Imidlertid har longitudinelle studier vist at tap av hvite fettvev (WAT) masse forut at av muskelsvinn [10,11]. Resultater de siste årene har også vist at WAT masse reduksjon i CC er først og fremst forbundet med økt hydrolyse (lipolyse) [12] og oksidasjon [13] av adipocyte triglyserider. Mekanismene som påvirker fettmetabolismen i CC er ikke kjent, men det er mulig at faktorer slippes ut i sirkulasjon, enten direkte fra tumor eller indirekte fra andre vev, kan forårsake endringer i fettcelle lipolyse /lipid oksidasjon [12]. Flere kandidater er blitt foreslått gjennom årene, blant annet sink-alpha2-glykoprotein og tumornekrosefaktor-alfa [14] Selv om senere undersøkelser har vist at ingen av dem kan
per se
forklare økt fett tap i CC [10 , 15].
Identifisering av nye sirkulerende proteiner forbundet med CC har vært hemmet av flere grunner, ikke minst det faktum at plasma /serum er en kompleks matrise hvor de 20 mest tallrike proteiner står for ~ 98% av proteininnhold [16]. Følgelig påvisning av proteiner tilstede på lavere nivåer krever tilhørighet proteomikk tilnærminger hvor stor hindring har vært tilgjengeligheten av spesifikke affinitet reagenser. Nylig har flere konsortier satt i gang arbeid for å løse dette hinderet og produserer spesifikke affinitet permer [17]. The Human Protein Atlas (HPA) prosjektet [18] tar sikte på å generere minst ett antistoff mot hverandre humant protein og for tiden ~ 22.000 antistoffer, rettet ~ 16.000 proteiner, er representert med protein lokalisering og uttrykk data på en offentlig tilgjengelig database (www.proteinatlas .org).
Vi avgjort om plasma fra kreftpasienter med kakeksi, i forhold til vektstabile kreft fag (WS), viser konkrete endringer i proteinnivåer som forbinder med kroppsvekt /fettmasse tap og /eller andre kliniske funksjoner i CC. For dette formål ble 760 antistoffer (som målretter 698 unike proteiner) fra HPA-prosjektet benyttes på suspensjonen perle arrays (SBA). Denne fremgangsmåten identifiseres et lite sett av differensielt uttrykte proteiner blant hvilke carnosin dipeptidase 1 (CNDP1), et protein som nylig vist seg å bli redusert i metastatisk prostata kreft og glioblastom [19,20], ble bekreftet ved sandwich-immunoanalyse for å bli redusert i CC. Sirkulerende nivåer av CNDP1 ble derfor sammenlignet med kliniske målinger av sykdomstilstand.
Materialer og metoder
Pasienter
De kliniske kjennetegn kohort 1 og 2 er beskrevet i Tabell 1. kohort 1 besto av 59 pasienter med mistanke om kreft, gastrointestinal 43 hanner og 16 hunner og 26 av disse har i stor grad blitt beskrevet andre steder [21]. Trettito pasienter oppfylte kriteriene for kakeksi, dvs. ufrivillig vekttap overstiger fem prosent av vanlig kroppsvekt i de foregående tre månedene eller ti prosent de siste seks månedene [21]. Tjuesyv rapporterte ingen signifikant vekttap og ble definert som vekt-stabil (WS). CC pasienter ble diagnostisert med adenokarsinom i mageområdet dvs. Cardia /ventrikkel (n = 3), kolon (n = 2 hvorav en med levermetastaser), bukspyttkjertel (n = 11), spiserør (n = 9, ut av hvorav 4 med plateepitelkarsinom) og kolangiokarsinom (n = 1). De WS pasienter ble diagnostisert med adenokarsinom i spiserøret (n = 4), mageområdet (n = 2), kolon (n = 7, alle med levermetastaser), bukspyttkjertel (n = 8) eller kolangiokarsinom (n = 1). Elleve personer (seks i CC og fem i WS gruppe), preoperativt fast bestemt på å ha en ondartet sykdom, ble postoperativt vist å ha en ikke-tumor relatert diagnose. I CC gruppen endelig diagnose var godartede bukspyttkjertelen cyster (n = 1), kolecystitt (n = 2), dysplasi i spiserøret (n = 1) og kronisk pankreatitt (n = 2). I WS gruppe var de endelige diagnoser kolecystitt (n = 1) og kronisk pankreatitt (n = 4). Som beskrevet i resultater, selv om disse temaene ble tatt med i den samlede analysen, utelatelse av disse personene ikke har noen stor innvirkning på sammenhengen mellom CNDP1 og ulike kliniske parametre. Cohort 2 besto av 93 pasienter med diagnosen unresectable ductal bukspyttkjertelkreft. Disse prøvene ble valgt ut fra en biobank samlet under en tidligere beskrevet [22] palliasjon programmet ved poliklinikk for Kirurgisk avdeling, Sahlgrenska universitetssykehus mellom 1993 og 2005. Kun pasienter som ble bedømt rimelig god fysisk form ble inkludert i denne studien. Ingen av pasientene hadde tegn på åpenbar diabetes eller andre tilleggskreftdiagnose eller alvorlig sykdom.
Etikk erklæringen
Etiske godkjenninger for studiene ble innhentet fra de regionale styrene i etikk ( i Stockholm og henholdsvis Göteborg,) før starten av studien, og alle pasientene ga sin signert informert samtykke. Studien ble utført i full overensstemmelse med uttalelser i Helsinkideklarasjonen.
Klinisk undersøkelse
I kohort 1, pasientene kom til laboratoriet etter en natts faste. Bortsett fra å måle høyde og vekt, ble kroppssammensetning bestemt ved bioimpedance bruke en QuadScan 4000 (Bodystat Ltd, Isle of Man, britiske øyer). Indirekte kalorimetri å bestemme hvile energiforbruk (REE) og respiratorisk kvotient (RQ) ble utført ved hjelp Deltatrac (Datex-Engströms, Helsinki, Finland). Ernæringsstatus ble vurdert ved hjelp av et standardisert spørreskjema for onkologi betegnes Pasientskapt Subjektiv Global Assessment (PG-SGA) [23]. En venøs blodprøve ble anvendt for bestemmelse av sirkulerende faktorer. I korte trekk, ble 20 ml venøst blod trekkes fra hver donor og kald sentrifugert for å oppnå plasma som så ble alikvotert i 2 ml Eppendorf-rør og oppbevares ved -80 ° C inntil bruk. Leptin nivåer ble bestemt ved hjelp av ELISA (RD-systemer, Abingdon, UK) mens albumin, transferrin, insulin-lignende vekstfaktor-1 (IGF1) og C-reaktivt protein (CRP) ble bestemt ved akkreditert rutinekjemi laboratorium ved Karolinska universitetssykehuset . Plasma glycerol ble bestemt ved bioluminescens som beskrevet [24] ved hjelp av heparin-plasma, prøver ble kjørt i duplikater (2×25 uL) og middelverdiene ble korrigert for total fettmasse (i kg) som tidligere beskrevet [21]. Forholdet mellom glycerol til hele kroppen fett vekt ble ansett som en indeks av
in vivo
lipolyse [21]. Fag i kohort 2 ble undersøkt som beskrevet tidligere [11,22]. I korte trekk, ble serum og plasma målinger som utføres av rutinen akkreditert kjemi laboratorium av Sahlgrenska universitetssykehuset med unntak av leptin som ble bestemt internt ved hjelp av RIA (Linco forskning Inc). Kroppssammensetning ble målt ved dual-energy X-ray absorpsjonsmetri (DXA) med en LUNAR DPX-L scanner (Scanexport Medical, Helsingborg, Sverige). Hele kroppsskanning ble oppnådd i rask skannemodus. Kroppsfett og fettvevsmasse ble analysert ved hjelp av utvidet forskning modusen for Lunar DPX-L-programvare (v1.31). REE og fettforbrenning ble målt ved indirekte kalorimetri i morgentimene etter en natts faste hjelp Deltatrac (Datex-Engströms, Helsinki, Finland). Den korte formen spørreskjemaet SF-36 (www.sf-36.org/tools/sf36.shtml) ble brukt for å måle livskvalitet i henhold til fysisk funksjon (PF), kroppslig smerte (BP), rolle fysisk (RP ), generell helse (GH), den fysiske delen sammendraget (PCS), vitalitet (VT), sosial fungering (SF), rolle emosjonell (RE), mental helse (MH) og mental komponent sammendrag (MCS).
antistoffer
Alle antistoffer som brukes i den innledende screening og profilering stammer fra ressursene i affinitet reagenser som genereres innenfor human Protein Atlas (www.proteinatals.org). Protokoller for antigen seleksjon, kloning, ekspresjon, rensing, og immunisering av kaniner, etterfulgt av affinitetsrensing under dannelse av mono-spesifikke polyklonale antistoffer, og deres karakterisering med Western blot og antigen mikromatriser ble påført som tidligere beskrevet [25]. Alle proteinfragmenter som benyttes for immunisering ble produsert med en His6-albumin-bindende protein tag og et målprotein del av 80-120 aminosyrer. Antistoffene ble samlet i sett med 380 for praktiske eksperimentelle grunner, og to slike sett ble brukt. Inklusjonskriteriene ble bare basert på kvalitetssikring og tekniske parametere som positiv bekreftelse på protein-mikromatriser og innenfor et bredt panel av vev i immunhistokjemi, så vel som konsentrasjonen av antigen-rensede polyklonale antistoffer. Utover det ble det ikke hensyn gjort om merknad eller funksjon av målrettede proteiner. Den endelige samling ble drevet av hvilke antistoffer tilfeldigvis ble produsert og validert på tidspunktet for valget.
Antistoffhenge perle arrays
Antistoffer ble koplet til fargekodede magnetiske kuler (MagPlex sfærer, Luminex Corp .) i henhold til produsentens protokoll og som tidligere beskrevet [20]. Koblingseffektiviteten for hvert antistoff ble bestemt ved hjelp R-fykoerytrin-merket anti-kanin-IgG-antistoff (Jackson Immunoresearch Laboratories). En 384-Plex perle blandingen ble opprettet med 380 antigen-renset polyklonale HPA antistoffer og fire perle identiteter brukt som kontroller. Sistnevnte besto av IgG fra en ikke-immunisert kanin og antistoff-fri buffer som negative kontroller, mens anti-albumin og anti-humane IgG-antistoff (Dako) ble betraktet som positive kontroller. Blandingen inneholder like mengder perler der hver populasjon av en distinkt fargekode var bærer et spesielt antistoff. Plasmaprøver ble merket og analysert i overensstemmelse med tidligere studier med mindre endringer. De prøveplater (Abgene) ble sentrifugert (2 minutter ved 2000 rpm), og 3 ul av hver prøve ble tilsatt til 22 ul av sterilfiltrert PBS med en væskebehandler (Selma, Cybio). N-Hvdroksvsuccinimidvlester ester av biotinoyl tetraoxapentadecanoic syre (Pierce) ble deretter tilsatt ved ti-ganger molart overskudd til å gi et samlet 01:10 prøvefortynning, etterfulgt av en 2-timers inkubasjon ved 4 ° C i en mikrotiter-plateryster (termomikser, Eppendorf) . Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av en 250-gangers molart overskudd av Tris-HCl, pH 8,0 i løpet av biotin og inkubert i ytterligere 20 minutter ved romtemperatur (RT) før en endelig lagring ved -20 ° C. Alle prøver ble deretter benyttes uten å fjerne ikke-inkorporerte biotin og fortynnet 1:50 i en analysebuffer bestående av 0,5% (w /v) polyvinylalkohol og 0,8% (vekt /volum) polyvinylpyrrolidon (Sigma) i 0,1% kasein i PBS supplert med 0,5 mg /ml kanin IgG (Bethyl Laboratories). Prøvene ble varmebehandlet i en termosykler i 30 minutter ved 56 ° C og 10 minutter ved 23 ° C. Deretter ble 45 pl tilsatt til 5 ul perle blandinger i et halv-område flatbunnet 96-brønns plate (Greiner), og inkubering fant sted over natten på en orbital-rystemaskin ved 650rpm ved RT. Kulene ble vasket i brønner med 3 x 100 ul PBST (1 PBS, pH 7,4, 0,05% Tween 20) på magneten ved hjelp av en platevasker (EL406, BioTek) etterfulgt av 10 min fiksering med 50 ul 0,4% paraformaldehyd i PBS. Perlene ble vasket en gang før 50 ul av 0,5 ug /ml R-fykoerytrin-merket streptavidin (Invitrogen) i PBST ble tilsatt og inkubert i 20 min. Til slutt, Kulene ble vasket og målt i 100 ul PBST hjelp av en dedikert instrument (FlexMap3D, Luminex Corp.).
sandwich-immunoanalyse
Bead-baserte sandwich-immunoanalyser ble utført som tidligere beskrevet [26 ]. To forskjellige kuleanalyser ble opprettet, en som inneholder flere mono- og polyklonale antistoffer målrettet mot CNDP1 samt kontrollproteiner [26], mens den andre inneholdt en antistoff (HPA008933) rettet mot CNDP1 så vel som kontroller. I begge tilfeller BAF2489 (R 0,05. I oppdagelsen årsklasse, ble ingen strøm beregning. Statistiske beregninger ble utført ved hjelp av standard programvarepakker.
Resultater
Kliniske kjennetegn ved oppdagelsen kohorten
I kohort 1, CC og WS fag var av samme alder og kjønn distribusjon selv om begge undergrupper besto hovedsakelig av menn (tabell 1). Som forventet, CC pasientene rapporterte mer uttalt vekttap og vist tegn til katabolisme som gjenspeiles av lavere BMI, lavere plasma albumin og transferrin nivåer samt dårligere ernæringsstatus demonstrert av høyere PG-SGA score. Den vekttap observert i cachectic gruppen var først og fremst på grunn av tap av fettmasse, siden lean body mass (LBM) var lik i de to gruppene. I samsvar med tidligere publiserte data, de cachectic fagene vises nedre luft kvotient (RQ), et indirekte mål på fettsyre oksidasjon, samt tegn til økt
in vivo
lipolyse dokumentert av betydelig forhøyede plasma glyserol nivåer (korrigert for total fettmasse). Til sammen vises cachectic gruppen i kohorten en primært WAT massetap, samt alle de klassiske funksjonene og kliniske kjennetegnene ved forstyrret lipidmetabolisme tidligere rapportert i CC.
Affinity proteomikk analyse av sirkulerende faktorer
for å identifisere sirkulerende faktorer assosiert med CC, plasmaprøver fra kullet 1 ble analysert ved hjelp av proteomikk profilering suspensjon kule arrays (SBA, nærmere informasjon om antistoffet utvelgelsesprosessen er beskrevet i Methods avsnitt). Ut av de ~ 700 skjermede proteiner, seks viste signifikante forskjeller mellom CC og WS grupper; tre var lavere; (CNPD1, APOA4, DACH1) mens tre var høyere (BCI3 NARS2, ATP13A4) i CC individer (tabell 2). DACH1 er en transkripsjonsfaktor, BCI3 er en transkripsjons co-aktivator, er CNDP1, NARS2, ATP13A4 foreslåtte enzymer og APOA4 er et lipoprotein. CNDP1 og APOA4 blir kommentert som utskilles ekstracellulære faktorer, mens de resterende fire er intracellulære proteiner. Videre CNDP1 og APOA4 har vist seg å endres i plasma /serum av kreft fag. Dermed har redusert CNDP1 nivåer er rapportert i ulike aggressive kreftformer [19,20] mens APOA4 har vist seg å være økt hos barn former for høy risiko akutt leukemi [27], men lavere hos voksne kvinner med eggstokkreft [28,29] . Våre studier ble derfor fokusert på CNDP1 og APOA4 hvor første skritt var å validere våre SBA resultatene etter sandwich-immunoassay (SIA). Mens reduksjonen i APOA4 ikke kunne bekreftes ved SIA (S1 Fig, p = 0,21), ble CNDP1 redusert i CC i tilsvarende grad i SBA (Fig 1 A) og SIA (figur 1B). Videre er de enkelte CNDP1 verdier oppnådd ved hjelp av SBA eller SIA var sterkt korrelert (figur 1C, ρ = 0,78, med Spearmans rang korrelasjon, p 0,001) og påliteligheten av den sistnevnte analysen ble ytterligere bekreftet ved to uavhengige SIAS ved hjelp av forskjellige antistoffer som viste gode intra- og inter-assay korrelasjoner (spekter av ρ = 0,93 til 0,99, grafer ikke vist). CNDP1 nivåer målt ved SIA var ikke forbundet med enten alder eller kjønn (figur 1D og 1E, henholdsvis).
Oppdaget protein nivåer er vist for A. skjermen ved hjelp Sandwich Perler Arrays (SBA) og B. validering av Sandwich Immunanalyser (SIA) og uttrykt som gjennomsnittlig intensitet fluorescens (MIF). C. Det var en utmerket korrelasjon mellom resultatene oppnådd av SBA og SIA. CNPD1 nivåer målt ved SIA ble ikke påvirket av E. kjønn D. alder eller. F. Fordeling av sirkulerende CNDP1 konsentrasjoner bestemmes av SIA i Cohort 2. WS = vekt stabil, CC = Cancer kakeksi. P- og Rho-verdier er gitt.
CNDP1 nivåer korrelerer negativt med faktorer assosiert med CC
Sirkulasjons CNDP1 nivåer ble sammenlignet med ulike kliniske parametre i kohort 1 (tabell 3). Det var positive relasjoner med BMI, fettmasse (uttrykt i prosent eller absolutte verdier) så vel som med sirkulerende nivåer av albumin, transferrin og IGF1. Motsatt CNPD1 var negativt assosiert med prosent vekttap, PG-SGA score og
in vivo
lipolyse (uttrykt som P-glycerol /fettmasse kg). Assosiasjonene mellom CNDP1 og BMI, fettmasse (kg), prosent vekttap, serum-IGF1 /transferrin og
in vivo
lipolyse fortsatt statistisk signifikant etter utelukkelse av de elleve fag som ble diagnostisert med ikke-ondartet sykdom post -surgery.
Reduserte CNDP1 nivåer er assosiert med dårlig prognose i en validerings kohort
SBA og SIA funn ble oppnådd i en ganske liten kohort, diagnostisert med ulike gastrointestinale kreft og hvor ingen utfallet data er tilgjengelig. For å validere, men også for å bedre definere sammenhengen mellom redusert CNDP1 nivåer og prognose, sirkulerende CNDP1 ble bestemt av SIA i en egen, mer homogen, validering kohort inkludert kun pasienter med avansert kreft i bukspyttkjertelen (Cohort 2, tabell 1 og figur 1F) . Hos disse pasientene ble CNDP1 verdier negativt forbundet med prosent vekttap og tiltak av fettforbrenning mens det var en positiv sammenheng med plasma albumin, IGF1 og fysiske helserelatert livskvalitet tiltak (SF-36) (tabell 4). Til tross for manglende sammenheng mellom CNDP1 nivåer og etablerte tumor markører (CEA, CA 125 og CA19-9), var det en signifikant positiv korrelasjon mellom CNDP1 og overlevelse (målt som dager overlevelse etter diagnose). I motsetning til funnene i kohort 1, var det ingen sammenheng mellom CNDP1 og BMI, total fettmasse eller
in vivo
lipolyse.
Diskusjoner
Til vår kunnskap, har det sirkulerende proteomet i CC ikke vært preget før. Ved hjelp av vår tidligere beskrevet antistoff suspensjon perle array-teknologi [30], utførte vi en screening av ca 700 proteiner. Vi har funnet at bare et begrenset sett av faktorer, svarende til mindre enn 1% av de siktede proteiner, viste signifikante differensialplasmanivåer i CC-pasienter sammenlignet med vektstabile kreft fag. Dette kan muligens være avhengig av at fagene i denne screening kohorten besto av nydiagnostiserte kreftpasienter og ble analysert på et tidlig stadium av CC eller at faktisk noen sirkulerte proteiner forbinder med CC. Det er også mulig at vi ikke har fått noen relevante proteiner på grunn av det faktum at mange signaler i en proteomikk skjerm kan være i støyperioden og /eller at skjermen er inkludert antistoffer rettet mot bare et begrenset sett av proteiner. Blant de forskjellig uttrykte proteiner, har fire faktorer (CNDP1, APOA4, DACH1 og BCI3) tidligere blitt studert i ulike aspekter av kreft, men bare APOA4 og CNDP1 utgjør utskilles proteiner. De to sistnevnte har tidligere vært studert i sirkulasjon av kreft fag, om enn ikke i sammenheng med kakeksi. Sandwich immunoassay bekreftet lavere plasmanivåer av CNDP1 i CC og lave CNDP1 nivåer forbundet med flere tiltak for CC. De viktigste funnene kan valideres i en egen kohort demonstrere at redusert CNDP1 korrelert med vekttap, mer avanserte sykdomstilstander, og redusert overlevelse. Riktignok noen av foreningene skilte mellom de to kohortene. Således, mens BMI, fettmassen og
in vivo
lipolyse korrelert med sirkulerende CNDP1 i kohort 1, disse forbindelsene var ikke signifikant i kohort 2. Dette kan muligens være avhengig av det faktum at forsøkspersoner i kohort 2 hadde en mer avansert sykdom stadium.
elleve av pasientene i kohorten en slutt ble diagnostisert med ikke-malign sykdom. Vi anser ikke dette for å ha noen stor betydning for våre resultater vedrørende CNDP1, delvis basert på det faktum at å utelate disse personene fra analysene ikke har noen stor innvirkning på de signifikante sammenhenger med ulike kliniske parametre. Enda viktigere er imidlertid tilsvarende korrelasjoner med CNDP1 ble funnet i kohort 2 som besto bare av pasienter med bekreftet kreft i bukspyttkjertelen.
CNDP1
genet koder for et 57 kDa glykoprotein av M20 metallopeptidase familien. Hos mennesker er det først og fremst uttrykt i sentralnervesystemet og (i mindre grad) i leveren hvor det skilles ut som en homodimer. [31]. Selv om sekvensidentitet av
CNDP1
er sterkt konservert mellom artene, er den ikke-humane gen nesten utelukkende uttrykt i nyren, men fordi den mangler et N-terminalt signalpeptid det er ikke detekterbar i sirkulasjonen [31] . Funksjonen til CNDP1 ikke er fullstendig definert, men det viser karboksy-dipeptidase og aktivitet og dens viktigste underlag synes å være den dipeptider karnosin (β-alanyl-histidin) og homocarnosine (γ-aminobutyryl-L-histidin) [31,32,33 ]. Karnosin er hovedsakelig til stede i muskel og hjernevev og har vært implisert i flere patofysiologiske prosesser, inkludert en beskyttende rolle i atheroscleroisis [34], hepatisk steatose [35], diabetisk nefropati [36,37,38,39] og i kreft [40] , der dens anti-proliferative egenskaper på forskjellige ondartede cellene har ansporet spesiell interesse [41,42,43]. Lave nivåer CNDP1 har blitt funnet å være assosiert med lymfeknutemetastase i et stort kohort av prostata kreftpasienter [20]. Videre, en nylig proteomikk analyse ved hjelp av en ikke-immun-basert (væskekromatografi-massespektrometri) tilnærming antydet at CNDP1 er en av flere proteiner ned regulert i plasma fra ti pasienter med glioblastom sammenlignet med friske kontrollpersoner [19]. Det er derfor mulig at reduserte CNDP1 nivåer kan være en fellesnevner i flere mer aggressive kreftformer. Riktignok kan det virke counterintuitive at Carnosine er foreslått å ha anti-tumor effekter mens reduserte nivåer av en Carnosine nedverdigende enzym forbinder med avanserte kreft stadier. Imidlertid kan det være en hypotese om at CNDP1 ned regulering, noe som resulterer i økt Carnosine nivåer, kan utgjøre en kompenserende /defensiv mekanisme aktiveres i forhold med høy cellefornyelsen. Enten plasma Carnosine nivåer er endret på kreft er ikke kjent, og vi har ikke nok materiale til å bestemme forholdet mellom CNDP1 og Carnosine i sirkulasjon. Derfor er uklart funksjon CNDP1
in vivo
, samt utformingen av vår studie, ikke tillate oss å etablere en årsakssammenheng mellom reduserte CNDP1 nivåer og CC.
Mekanismene kontrollerende sirkulerende nivåer av CNDP1 er ikke kjent, og vi kan ikke utelukke at vev /cellekilde CNDP1 kan variere mellom friske og kreftpasienter. Videre, uansett om CNDP1 reduksjon finner sted i andre former for vekttapet er ikke kjent. Som vi tidligere har generert globale transcriptomic data fra WAT av kohorten 1 [44] undersøkte vi om
CNDP1
genekspresjon ble påvirket av CC. Det faktum at ble det ikke observert forskjeller (data ikke vist) tyder på at endringer i sirkulerende CNDP1 observert i denne studien kan ikke forklares med endrede
CNDP1
uttrykk i WAT. En mer omfattende kartlegging av CNDP1 ekspresjon i andre forhold er nødvendig for å belyse hvordan og i hvilken vev, kroppsvekt tap påvirker først og fremst på genekspresjon og protein sekresjon. En forbeholdet er nevnt ovenfor, noe som utelukker mekanistiske undersøkelser av CNDP1 i dyremodeller, er at det murine orthologue ikke utskilles i sirkulasjon. Faktisk, selv om SIA utviklet i dette arbeidet skal teoretisk gjenkjenne mus CNDP1 (basert på sekvens homologi) vi ikke var i stand til å observere noen påvisbare nivåer i serum /plasma fra flere forskjellige musestammer (data ikke vist).
CNDP1 gjennomgår posttranslational modifikasjoner inkludert homodimerization og glykosylering. Det er for tiden uklart hvordan glykosylering status påvirker aktiviteten og funksjonelle rollen til CNDP1. Selv om det kan påvirke antistoffaffiniteten, det faktum at CNDP1 nivåer korrelerer sterkt mellom analyser ved hjelp av fire ulike antistoffer, tyder på at forskjeller i glykosylering status er ikke sannsynlig å forklare differensial nivåene observert i CC og WS grupper.
I konklusjonen viser profilering av ~ 700 sirkulerende proteiner i gastrointestinal kreft som CNDP1 nivåene er redusert i kakeksi og at lave serumkonsentrasjoner korrelerer med flere CC parametere forbundet med dårlig resultat. Det faktum at kun et begrenset sett av plasmaproteiner er endret i CC antyder at noen sirkulerende faktorer er potensielle CC markører, i det minste i de tidlige fasene av sykdommen. Enten CNDP1 har prognostisk verdi kan ikke etableres i dagens pilotstudie og må valideres i mye større kohorter. Videre den primære vev /celle kilde, mekanismene som styrer sine sirkulerende nivåer samt den funksjonelle rollen CNDP1 fortsatt uklare, og vil være fokus for fremtidige studier.
Hjelpemiddel Informasjon
S1 Fig. . APOA4 nivåer i validerings analysen
Oppdaget protein nivåer er vist for APOA4 hjelp sandwich-immunoassay og uttrykt som betyr intensitet fluorescens (MIF)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0123566.s001
(EPS)
Takk
Vi er takknemlige til Kerstin Wahlen, Eva Sjölin, Gaby Åström, Yvonne Widlund, Katarina Hertel og Britt-Marie Leijonhufvud for sin dyktige teknisk og klinisk assistanse.
